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2013年  26卷  第S1期

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落叶松实时定量PCR内参基因的筛选
吴涛, 李万峰, 张俊红, 韩素英, 杨文华, 齐力旺
2013, 26(S1): 1-8.
摘要:
本研究针对日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的31份材料,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,分析了12个持家基因(ACT 4、APm、Chc、Gapc、RPL1、RPL2、EF1、EF2、eIF、E3UL、UBQ和UPL2) 在这31份材料中的表达情况。经geNorm和NormFinder两种分析软件对这12个持家基因进行表达稳定性分析,结果表明:APm在不同器官、体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定;EF1 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定;eIF在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定。分析结果表明,针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基因做内参基因使用。进行基因表达细微差异研究时,可根据需要使用2个或2个以上内参组合。
日本落叶松种子萌发过程中18个miRNAs的表达变化
吴涛, 韩素英, 张俊红, 李万峰, 杨文华, 齐力旺
2013, 26(S1): 9-17.
摘要:
运用qRT-PCR技术,检测日本落叶松种子萌发过程中的5个阶段——干种子 (萌发培养0 d)、吸胀(1 d)、萌动(5 d)、胚根外露(9 d)和子叶展开(28 d),miR156、miR159和miR160等18个miRNAs在其种胚内的表达模式,并对其目标基因进行生物信息学分析,探讨miRNA在针叶林木种子萌发过程中的基因表达模式。结果表明:(1)从整个萌发过程分析,18个miRNAs的表达水平皆以干种子阶段最高,吸胀和萌动阶段迅速下降;干种子阶段的表达水平分别是吸胀、萌动、胚根外露和子叶展开阶段的4.8 43.5、17.2 1 000.0、45.5 1 000.0、62.5 1 862.2倍。(2)从各个阶段分析,miR894的表达水平在5个阶段均最高,miR408均最低;其余16个miRNAs在5个阶段内的表达水平各有变化,综合排序结果从高到低依次为:miR951、miR950、miR156、miR159、miR396、miR398、miR390、miR160、miR947、miR165、miR319、miR162、miR171、miR397、miR395和miR172。(3)miRNA目标基因预测结果显示:目标基因主要是ATP/DNA结合蛋白、ARF等转录因子、质膜和核糖体等细胞组分及MAP等激酶活性蛋白等蛋白编码基因。(4)miR160对其目标基因JR160237 具有切割作用,切割位点发生在miR160与目标基因互补结合位点第10与11位碱基之间。JR160237在种子吸胀阶段表达水平迅速升高,在萌动、胚根外露和成苗阶段有所回落。
日本落叶松杂种及亲本 4CL基因的克隆和SNP多态性分析
周亚楠, 李爱, 陈成彬, 王春国, 宋文芹
2013, 26(S1): 18-24.
摘要:
以日本落叶松(Larix kaempferi)不同杂交组合为材料,依据转录组测序信息,成功获得了11种日本落叶松材料的4 CL基因的编码区序列,该序列长1 537 bp,包含完整ORF片段1 368 bp,编码455个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明,除日本落叶松Larix16×Larix61组合外,Larix82×Larix13、Larix40×Larix10和Larix82×Larix61子代的表达均高于双亲,推测4 CL基因差异表达与落叶松杂种的木质素生物合成有关。进一步采用SNP标记方法和DNAMAN软件对不同日本落叶松杂种和亲本组合的单核苷酸多态性进行分析。共检测到66个SNP多态性位点,表明日本落叶松4CL 具有丰富的遗传多样性。66个SNP变异中,属于三突变1个;转换类型45个,占总变异的68.18%;20个属于颠换类型,占总变异的30.30%,转换:颠换=9:4。在转换类型中,A/G和C/T转换分别占28.79%和39.39%;颠换类型中A/C、A/T、G/C、G/T分别占4.55%、9.09%、9.09%和7.58%。采用NJ 聚类法对克隆片段的氨基酸序列进行了遗传多样性分析。
日本落叶松谷胱苷肽还原酶的生化特性研究
王鑫, 钱婷婷, 曾庆银
2013, 26(S1): 25-32.
摘要:
本研究从日本落叶松中克隆到一个谷胱苷肽还原酶(GR)基因,命名为LaGR。该基因编码563个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为61.06 kDa。表达模式分析发现LaGR基因在芽、成熟针叶、茎韧皮部和根韧皮部均表达,是组成型表达基因。蛋白质亚细胞定位研究发现LaGR蛋白定位在叶绿体。在大肠杆菌中表达并纯化了LaGR重组蛋白。酶学性质分析发现,LaGR蛋白对底物GSSG和NADPH具有较高的催化活性和亲和力,是热稳定蛋白,而且最适pH值范围在7.0 9.0之间。Cd2+、Pb2+和Cu2+等重金属离子对LaGR蛋白的催化活性具有明显的抑制作用。将LaGR蛋白的第528位His突变为Gln后,其突变蛋白的催化活性显著降低,而且与野生型LaGR蛋白相比,突变蛋白的动力学常数、最适pH值范围和热稳定性均发生了显著变化,预示着第528位的His在LaGR的催化特性和蛋白结构稳定性方面发挥着重要作用。
黑杨三倍体与二倍体叶片中miRNA表达差异研究
王楠, 胡宝全, 王春国, 宋文芹, 陈成彬
2013, 26(S1): 33-38.
摘要:
本文以改进CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用定量RT-PCR技术从黑杨幼嫩叶片、成熟叶片中均检测到miRNA。结果表明,miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中表达量均高于二倍体,miR164在三倍体成熟叶片中的表达量高于二倍体表达量。除miR319外,其余miRNA与其相应的靶基因在二倍体和三倍体黑杨不同阶段叶片中表达的消长关系都较为典型。暗示这些miRNA 靶基因可能与黑杨三倍体的速生性状形成相关。
黑杨三倍体 PtSIP3基因的克隆与功能分析
胡宝全, 韦韬, 王春国, 宋文芹, 陈成彬
2013, 26(S1): 39-44.
摘要:
本研究以黑杨中林46三倍体为材料,依据前期表达谱芯片的分析结果,分离克隆得到三倍体材料中高表达基因PtSIP3,该基因的编码产物为钙调磷酸酶B(Calcineurin B-like Proteins,简称CBL)的靶蛋白。随后构建了双元表达载体pRI101-PtSIP3,并成功的转入拟南芥中。经qRT-PCR表达分析和表型观察,发现PtSIP3 在拟南芥中异源过表达会抑制胚和果荚的发育、促进根的快速伸长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。
中间锦鸡儿生长发育过程中5个miRNAs及其靶基因的表达模式分析
朱建峰, 李万峰, 杨文华, 韩素英, 齐力旺
2013, 26(S1): 45-51.
摘要:
利用qRT-PCR技术分析了5个miRNAs(cin-miR157a、cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b和cin-miR396a)及其靶基因在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)不同发育阶段不同器官的表达变化。结果显示,5个miRNAs的表达模式均存在时空特异性,其中cin-miR159a、cin-miR165a、cin-miR172b、cin-miR396a在成年期营养器官中强烈表达,在幼年期和成年期生殖器官中弱表达;cin-miR157a在幼年期和成年期生殖器官中强烈表达,在成年期营养器官中弱表达。除cin-miR159a的靶基因MYB和cin-miR165a的靶基因HD-Zip Ⅲ外,其它被检测的miRNAs靶基因与相应的miRNAs的表达呈现出明显的相互消长的表达模式。该结果表明中间锦鸡儿miRNA可通过调控其靶基因的表达,进而调控发育阶段转变、器官形态建成、细胞分化等生物学过程。研究结果将为中间锦鸡儿的定向改良工作提供理论依据和基因资源。
日本落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因 LkCOMT的克隆及单核苷酸多态性分析
易敏, 张守攻, 谢允慧, 孙晓梅
2013, 26(S1): 52-59.
摘要:
依据日本落叶松转录组数据库检测到的咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因ESTs序列设计引物,分离得到一个编码该酶的新基因。其cDNA克隆全长为1 350 bp,包含长度为1 092 bp的开放阅读框,可编码364个氨基酸残基。序列分析显示,所推导的蛋白质氨基酸序列包含COMT基因5个所特有的保守元件,与海岸松PpCOMT的蛋白质氨基酸序列同源性达94%。在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCOMT序列进行了单核苷酸多样性SNPs分析,共检测到92个SNP位点,SNP发生频率为1/17 bp,多样性指数πT为0.007 80。在这些SNPs中,65个属于转换,27个属于颠换。在外显子区域,共检测到58个SNP位点,其中37个为错义突变,21个为同义突变。研究结果为日本落叶松基因标记辅助育种提供了理论基础。
日本落叶松EST-SSR标记挖掘及特征分析
刘超, 张力鹏, 王春国, 宋文芹, 陈成彬
2013, 26(S1): 60-68.
摘要:
基于日本落叶松转录组测序(RNA-seq)结果,利用SSRIT工具查找SSR位点,检测到1 788个EST-SSR位点,平均长度是17.5 bp。进一步统计分析发现在落叶松中重复类型SSR位点出现次数最多的是六、三核苷酸,其余依次是五、二、四核苷酸重复类型;同时检测到656种重复基元类型,种类丰富。用Primer Premier 5.0设计500对引物,随机合成102对,以红豆杉科、柏科、松科材料为模板进行检测,结果显示在红豆杉科和柏科里的扩增率分别为95%、50%;在松科不同属的通用性为落叶松属99.01%、黄杉属67.4%、雪松属63.8%、冷杉属67.4%、云杉属70.2%和松属75.7%。利用101对SSR引物对7种不同落叶松品种亲缘关系进行了分析,获得79个多态性位点,在遗传相似系数0.69处将其区分为4个类群。
杨树三倍体与二倍体DNA甲基化的比较分析
陈成彬, 薛振毅, 胡宝全, 王春国, 宋文芹
2013, 26(S1): 69-75.
摘要:
利用甲基化敏感扩增多态性技术,对二倍体与三倍体黑杨和白杨群体DNA甲基化进行了研究,共检测到745个基因位点,不同倍性杨树群体基因组DNA的总甲基化率为13.69% 18.84%,二倍体杨树平均为14.71%,三倍体杨树平均为17.72%。不同倍性杨树种群总甲基化率随着倍性的升高而升高,半甲基化率黑杨组也随着倍性的升高而升高,而白杨组正好相反;黑杨组全甲基化率没有明显的规律可循,而白杨组的全甲基化率则随着倍性的升高而升高。倍性与甲基化率的相关性验证分析结果表明:总甲基化率与倍性的相关系数为0.835,PPP>0.05,半甲基化率与倍性相关性较弱。不同倍性杨树群体的甲基化变异与序列变化具有显著相关性(r=0.910 3,P<0.01),推测甲基化变异具有种群特异性。
日本落叶松 UDPGDH基因的cDNA克隆和表达分析
王菁, 李爱, 王春国, 宋文芹, 陈成彬
2013, 26(S1): 76-81.
摘要:
以日本落叶松杂交Solexa转录组测序获得的数据为依据,经拼接后获得尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)原序列,以该序列两端设计引物,在落叶松亲代和子代幼嫩针叶中成功克隆了UDPGDH基因cDNA序列,序列长1 443 bp,编码480个氨基酸。qRT-PCR结果分析表明:UDPGDH基因的表达量在落叶松杂交子代中远远高于亲本,正交子代的表达比反交子代高,说明UDPGDH在形成细胞壁半纤维素前体物过程中起着非常重要的作用,暗示UDPGDH在子代的高表达有利于杂种优势的形成。
杂种落叶松嫩枝离体培养与芽增殖研究
李魁鹏, 王亚珍, 孙晓梅, 韩华, 谢允慧, 张守攻
2013, 26(S1): 82-86.
摘要:
以生长和生根兼优的杂种落叶松无性系日永8×长混18-10的嫩枝和休眠芽为试验材料,开展了嫩枝生长和芽增殖的离体组织培养技术研究,确定了两种试验材料的最佳灭菌条件及最适培养基。结果表明:15%的次氯酸钠溶液处理10 min,材料无菌存活率达到91.7%,灭菌效果最好;最适嫩枝生长培养基为B培养基;芽增殖过程中,最适腋芽萌发诱导培养基为BEMB培养基,单个嫩枝平均诱导萌发2个腋芽;无外源激素的改良BEMB培养基(硝态氮与铵态氮含量比为6:1),最适于腋芽成枝诱导,成枝率为36.5%;培养基MCM+1.5 mg·L-1 ZT +0.15 mg·L-1 KT,最适用于休眠芽不定芽诱导,不定芽诱导率为39.1%,增殖倍数为2.6。
黑杨DNA甲基转移酶基因片段的分离及表达分析
陈成彬, 王彬, 胡宝全, 王春国, 宋文芹
2013, 26(S1): 87-95.
摘要:
利用同源序列克隆技术,分离了三倍体黑杨中4类(MET、CMT、DRM、DNMT2)8个特异甲基转移酶片段,其中,5个片段与二倍体同源性达到100%,3个片段发生了剪切变化。通过实时定量PCR技术检测8个甲基转移酶在不同倍性、不同部位、不同生长时期间表达模式的差异,通过对5个不同部位基因表达的检测,表明不同倍性黑杨在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控。通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况,发现随着时间的推移,MET家族 (PnD1和PnD2) 基因可能是拮抗调节,CMT (PnD3和PnD4) 家族基因可能是协同调节;而隶属于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表达都比较弱,唯独三倍体茎尖有很高的表达。由于茎尖是生长旺盛的部位,PnD6有可能是影响三倍体速生的重要基因。这些结果可能暗示,DNA甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程。
植物杂种优势及基因组多倍化机制研究概述
王春国, 陈成彬, 宋文芹
2013, 26(S1): 96-102.
摘要:
在植物进化及物种形成过程中,通过2个亲本的杂交可以使后代表现出速生、高产、高抗逆等优于亲本的性状,形成杂种优势;而通过同源或异源基因组加倍,也可使植物表现出明显优于亲本的生长发育性状或环境适应力,形成多倍体优势。因此,杂交及基因组多倍化被认为是推动植物进化和物种形成的2个主要驱动力。杂种优势及基因组多倍体优势已在农业生产实践中得到广泛应用,并产生巨大价值。基于此,探究植物杂交优势、基因组多倍体优势具有重大理论意义和应用价值,历来受到研究者的高度关注。目前,这方面的研究特别是有关杂种优势及基因组多倍化分子机制方面的研究已取得若干重大进展,本文旨在对这些研究成果进行概述,并对今后在木本植物中开展相关研究进行展望。
植物中MicroRNA及其它非编码小RNA的保守性和进化历程
张俊红, 张守攻, 童再康, 李万峰, 韩素英, 齐力旺
2013, 26(S1): 103-108.
摘要:
非编码小RNA是一类长度约为20 26个核苷酸的内源性RNA分子,在植物中普遍存在,在转录和转录后过程调控基因表达。microRNA及其它非编码小RNA在植物个体生长发育和生理过程中起重要作用。microRNA及其它非编码小RNA在陆地植物中保守,而且每个进化分支的出现皆伴随着新microRNA和其它非编码小RNA的产生,这些现象都表明,非编码小RNA与陆地植物的系统发生密切相关。本文从microRNA及其它非编码小RNA的保守性并结合其功能,探讨了非编码小RNA在植物进化中的重要功能。
成花调节在林木育种中的应用
张荣沭, 王慧, 杨传平
2013, 26(S1): 109-114.
摘要:
花发育是一个复杂的形态建成过程,了解林木花发育分子机理对实现林木的遗传调控具有重要意义。本文综述林木成花的分子机制的研究进展和以转基因等技术定向调控林木及木本经济作物生殖生长的实践案例,并对成花调节在林木育种中的应用前景进行展望。
转基因多抗杨3号新品种选育
褚延广, 张冰玉, 黄秦军, 丁昌俊, 苏晓华
2013, 26(S1): 115-117.
摘要: