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壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea Mill.)植物共有7个种,自然分布于欧亚及北美大陆的温带广阔地域。其中,板栗(C. mollissima Blume)、锥栗(C. henryi (Skan) Rehd. et Wils.)和茅栗(C. seguinii Dode)为我国特有种。栗属中国特有种在栗属植物研究和利用中占有重要地位,其品质优良,适应性和抗逆性强,尤其对栗疫病和墨水病具有较强的抵抗力,是进行食用栗品种改良的重要基因来源,对世界栗属资源保护和可持续利用具有重要作用[1]。我国栗属育种研究起始于上世纪50—60年代,通过常规育种方法选育了一大批应用于生产的优良品种等[2-3],目前传统的选择育种和杂交育种仍是栗属品种选育和性状遗传改良的主要方法。
栗属为多年生木本植物,其童期长,选育一个新品种或对某一性状进行遗传改良周期漫长,至少需要10~15 a,且花费巨大。同时,栗属农艺性状大多是受微效多基因控制的数量性状,遗传基础复杂,且易受环境影响,导致传统的育种方法效率不高。确定控制农艺性状的自然等位变异,不仅有助于解析其遗传基础,且可以为分子标记辅助育种乃至定向育种提供有效的基因资源和分子标记,具有重要的理论意义和应用价值[4]。近年来,关联分析(Association analysis)成为解析复杂数量性状遗传基础的一个重要手段。关联分析又称连锁不平衡作图(Linkage disequilibrium mapping)或关联作图(Association mapping),是一种以连锁不平衡为基础,检测群体内处于连锁不平衡状态的标记或候选基因的遗传变异与目标性状显著关联频率的方法,目前已广泛应用于农林作物。截至目前,关联分析在林木中应用主要以自然群体为主,而以杂交群体为材料进行关联分析鲜有报道。
简单重复序列(SSR)广泛分布于各类真核生物基因组中,为共显性标记,具有多态性高、重复性好、便于检测等特点[5]。SSR标记现已成为生物遗传特性研究的一种重要分子标记,被广泛应用于栗属植物遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建等研究[5-11]。本课题组以锥栗种内、板栗和锥栗种间共9个杂交组合F1代群体(235个单株)为材料,前期采用32对高多态性栗属SSR标记对其遗传多样性、遗传效应等进行了分析[12]。在此基础上,本研究进一步对其进行群体遗传结构和连锁不平衡分析,并将SSR标记与F1代生长、枝条、叶片表型及其光合生理等农艺性状表型数据进行关联分析,以期获得与农艺性状相关的分子标记,为栗属植物分子标记辅助选择和高效育种奠定基础。
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供试材料为锥栗种内、锥栗和板栗种间共9个杂交组合235份杂交F1代单株及其亲本(表1)。其中,4个亲本YLZ 1、YLZ 2、YLZ 24和YLZ 26为浙江省审(认)定锥栗良种,YLZ 24早熟、大果高产,YLZ 26特别高产稳产,YLZ 1和YLZ 2耐贮藏、优质且适宜加工;YLZ 14和YLZ 15为锥栗优株无性系,均是晚熟、优质品系;‘魁栗’为浙江省板栗良种,果型特大,平均单果质量20~25 g。2011年通过人工控制授粉获得杂交种实,2012年播种育苗,2013年春季建立杂交子代测定林,同时栽植所有亲本1年生嫁接苗若干株,株行距4 m × 4 m,每年进行精细抚育管理,235份子代单株及其亲本生长发育状况良好。
表 1 栗杂交组合概况
Table 1. Cross combination of chestnut
组合编号
Combination No.杂交组合
Combination子代数量
Number of hybridsC1 YLZ 26 × YLZ 14 14 C2 YLZ 26 × YLZ 15 30 C3 YLZ 24 × YLZ 1 30 C4 YLZ 24 × YLZ 15 30 C5 YLZ 1 × YLZ 24 30 C6 YLZ 1 × YLZ 2 17 C7 YLZ 14 × YLZ 1 24 C8 魁栗 Kuili × YLZ 15 30 C9 魁栗 Kuili × YLZ 1 30 -
于2019年4月份采集235个子代单株及其亲本幼嫩、无病虫害的新鲜叶片,每个单株采集嫩叶3~5片,装于事先做好标记的自封袋中,并将自封袋置于装有干冰的泡沫箱中带回实验室。
采用北京艾德莱生物科技公司生产的DNA试剂盒提取235份子代及其亲本基因组DNA,所提取的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量和紫外分光光度计测定浓度后,−20 ℃低温下保存备用。
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从120对引物中筛选出条带清晰、多态性高、重复性好的32对SSR引物,采用毛细管电泳仪对所有样本的SSR扩增产物进行分析(图1)。32对SSR引物具体信息、SSR扩增程序、毛细管电泳数据获得等内容详见本课题组前期研究[12]。
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分别于2018—2019年(连续2 a)1、7、11月份对235份子代单株的枝条性状、叶片表型及其光合生理指标、生长性状进行调查测定,具体方法参照本课题组章平生等[13-14]前期研究。
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利用TASSEL 5.0软件和R语言完成标记间的连锁不平衡(LD)分析及关联分析,STRUCTURE 2.3.4 软件进行群体遗传结构分析。
根据R2确定标记间的关联程度,即假设有两个连锁的座位A和B,其等位基因分别为A、a和B、b,用πA、πa、πB、πb分别表示相应的等位基因频率,用πAB、πaB、πAb 和πab分别表示4种单倍型AB、aB、Ab和ab的频率,则实际观测到的单倍型频率与期望单倍型频率间的差异D及R2的计算公式为:
$ {D_{ab}} = {{\text{π }}_{{\text{AB}}}}{{ - }}{{\text{π }}_{\text{A}}}{{\text{π }}_{\text{B}}} $
$ {R^2} = {({D_{ab}})^2}/{{\text{π }}_{\text{A}}}{{\text{π }}_{\text{a}}}{{\text{π }}_{\text{B}}}{{\text{π }}_{\text{b}}} $
应用STRUCTURE 2.3.4软件估测栗杂交子代的群体遗传结构。依据Evanno等[15]的统计模型,以最大似然法和Delta K值对235份杂交子代进行亚群划分。数据录入后,初始阶段MCMC的不作数迭代默认设置为10000次,再将不作数迭代后的MCMC调为100000次,群体的数目(K)设为2~13,以此估计可能的群体数目。计算Q参数,作为关联分析的协变量。
采用TASSEL 5.0软件中的一般线性模型(General linear model,GLM)和混合线性模型(Mixed linear model,MLM)对SSR标记和农艺性状进行关联分析。GLM以Q作为协变量进行回归分析;MLM 采用Q + K方法分析。
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群体遗传结构是影响连锁不平衡(LD)水平的一个重要因素,亚群数量的增加会使连锁不平衡的程度增强,可能导致多态性基因位点与目标性状间产生伪关联,造成假阳性结果的出现,因此,在进行关联分析时对群体遗传结构的分析是不可或缺的步骤。本研究结果显示,当K=4时,图像出现明显的拐点(图2),Delta K值也接近最大。据此,235个杂交F1代最终被划分为4个亚群(图3),平均混合度为0.120。
由图3可知,235份杂交子代群体被划分为4个亚群,而并未按照其杂交组合分为9个亚群,但每个亚群中子代分布呈现出一定的遗传分化。其中,第1亚群主要包括组合C8(‘魁栗’ × YLZ 15号)和C9(‘魁栗’ × ‘YLZ 1号’),且有少部分组合C2、C6和C7的子代混入其中;第2亚群主要为组合C2(‘YLZ 26号’ × YLZ 15号)、C4(‘YLZ 24号’ × YLZ 15号)和C1(‘YLZ 26号’ × YLZ 14号),同样有少部分组合C3、C5和C7的子代混入其中;第3亚群主要包括组合C3(‘YLZ 24号’ × ‘YLZ 1号’)和C5(‘YLZ 1号’ × ‘YLZ 24号’),少部分组合C6和C7的子代混入其中;而第4亚群则主要为组合C6(‘YLZ 1号’ × ‘YLZ 2号’)和C7(YLZ 14号 × ‘YLZ 1号’),组合C9的个别子代混入其中。此结果与前期研究中UPGMA和PCA分类结果基本一致[12]。
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利用TASSEL 5.0软件对32对SSR标记进行连锁不平衡(LD)分析,根据标记间R2来确定两两标记间的关联程度,利用R语言ggplot和pheatmap软件包对所得数据进行可视化分析(图4)。可以看出,统计概率P < 0.05时,32对SSR标记组成496个位点中存在一定的连锁不平衡(图4中对角线上面淡红及红色位点),其中,74个位点的连锁不平衡水平较高,占总标记对的比例为14.92%,其余位点的连锁不平衡水平相对较低;而P < 0.01时,大多数位点间连锁不平衡水平较低,且有37个标记对的R2值为0,表现出完全的连锁平衡现象。LD分析结果表明32个SSR位点间连锁不平衡总体水平较低。
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利用TASSEL 5.0软件一般线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)对杂交子代涵盖生长、枝条、叶片表型及其光合生理的25个农艺性状(连续2 a数据平均值)与32个SSR标记进行关联分析,并结合比较包法隆尼(Bonferroni threshold,P < 1/1048=9.5 × 10−4)阈值,对标记进行筛选,结果见表2。
表 2 GML和MLM模型关联标记及其对农艺性状的解释率
Table 2. Explanation ratio of associated markers with agronomic traits in GML and MLM models %
性状
Trait树高
Height/
m地径
Ground
diameter/cm冠径
Crown
diameter/m1年生枝条粗度
Annual branch
thickness/mm1年生枝条长度
Annual branch
length/cm节间距
Knot
spacing/cm均值
Mean6.23 ± 0.80 15.44 ± 3.23 5.08 ± 0.70 6.32 ± 0.61 42.38 ± 5.08 2.63 ± 0.30 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 5.50 6.21 8.24 8.51 11.02 11.08 CmTCR10 5.24 5.35 5.65 5.82 CmTCR13 6.15 6.15 6.75 6.97 CmTCR19 CmTCR22 8.85 8.85 5.56 5.59 5.25 5.19 5.01 5.06 5.76 5.73 CmTCR25 CsCAT15 7.09 7.09 5.55 5.69 CsCAT18 7.03 6.96 CsCAT26 4.81 CsCAT38 CsCAT41 CsCAT5 7.02 7.02 8.07 8.10 CsCAT7 8.81 8.81 5.59 5.62 5.01 5.19 CsCAT8 8.15 8.51 EMCs15 8.60 8.60 4.88 7.50 8.19 6.68 6.79 EMCs2 EMCs4 5.06 5.11 ICMA003 6.47 6.40 ICMA010 7.55 7.55 9.48 9.52 4.67 5.10 7..93 7.80 ICMA014 ICMA017s 12.06 12.06 13.79 13.88 8.59 12.78 6.19 6.23 ICMA022 6.57 6.57 KT010a 5.84 5.84 KT024a 8.66 8.78 PRA86 7.75 7.74 5.17 PRD21 11.60 11.60 7.49 7.50 5.67 PRD26 11.75 12.21 7.10 7.22 PRD52 5.45 5.59 6.64 8.58 性状
Trait叶柄长度
Petiole
length/mm叶片长度
Leaf
length/cm叶片宽度
Leaf
width/cm叶面积
Leaf
area/cm2叶片厚度
Leaf
thickness/mm叶形指数
Leaf
index均值
Mean15.68 ± 2.74 16.87 ± 1.47 5.84 ± 0.61 71.29 ± 11.96 0.178 ± 0.030 2.93 ± 0.28 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 6.09 6.18 6.68 6.68 8.02 8.23 10.75 10.75 CmTCR10 6.08 5.97 4.81 6.08 6.72 6.65 6.70 6.19 CmTCR13 7.09 7.10 6.82 6.82 9.86 9.84 7.07 7.07 CmTCR19 4.82 CmTCR22 6.63 6.61 8.85 8.85 8.28 8.41 7.02 9.03 5.79 5.81 CmTCR25 CsCAT15 8.25 8.29 10.83 10.83 12.47 12.64 ·续表2· 性状
Trait叶柄长度
Petiole
length/mm叶片长度
Leaf
length/cm叶片宽度
Leaf
width/cm叶面积
Leaf
area/cm2叶片厚度
Leaf
thickness/mm叶形指数
Leaf
index均值
Mean15.68 ± 2.74 16.87 ± 1.47 5.84 ± 0.61 71.29 ± 11.96 0.178 ± 0.030 2.93 ± 0.28 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CsCAT18 7.92 7.93 12.24 12.24 9.43 9.46 CsCAT26 9.26 9.26 8.98 9.03 7.92 7.92 6.70 6.73 CsCAT38 4.66 6.62 CsCAT41 CsCAT5 7.20 7.22 8.63 9.31 5.93 CsCAT7 8.07 8.09 16.70 16.70 18.73 18.51 8.48 14.69 5.15 5.21 CsCAT8 6.48 8.31 6.98 7.07 EMCs15 4.90 24.02 24.02 EMCs2 7.23 7.36 6.65 6.65 7.91 8.19 EMCs4 8.53 8.53 8.04 8.04 9.86 9.85 ICMA003 7.83 7.80 5.84 6.73 6.20 6.20 ICMA010 5.70 6.59 11.91 11.91 11.49 11.59 6.26 6.25 ICMA014 5.86 6.48 5.98 ICMA017s 9.72 9.81 16.69 16.69 14.17 17.46 6.85 9.07 5.34 5.36 ICMA022 KT010a 6.40 5.84 7.10 7.10 5.62 5.90 KT024a 5.16 4.93 16.16 16.16 12.59 12.50 8.35 8.34 PRA86 10.43 10.41 14.08 14.08 13.61 13.61 10.90 15.87 11.23 11.28 PRD21 10.45 10.52 11.13 11.13 10.18 10.12 5.56 10.02 10.08 PRD26 7.62 7.62 12.43 12.43 12.18 12.22 6.58 7.19 5.15 5.60 PRD52 11.92 11.93 8.89 8.89 10.47 10.43 性状
Trait叶片鲜质量
Fresh leaf
weight/g叶片干质量
Dry leaf
weight/g比叶质量
Specific leaf
weight/(g·cm−2)叶绿素a
Chlorophyll a/
(mg·g−1)叶绿素b
Chlorophyll b/
(mg·g−1)叶绿素总量
Chlorophyll a + b/
(mg·g−1)均值
Mean1.43 ± 0.31 0.68 ± 0.14 0.009 5 ± 0.001 0 0.42 ± 0.08 0.23 ± 0.03 0.65 ± 0.11 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 9.96 10.25 11.98 12.53 11.62 11.39 CmTCR10 7.30 6.22 CmTCR13 9.65 9.67 11.00 11.15 CmTCR19 4.68 CmTCR22 6.16 6.24 6.91 7.06 8.27 7.23 5.05 5.24 7.05 7.69 5.64 5.94 CmTCR25 5.86 6.40 6.63 7.11 CsCAT15 7.41 7.56 8.37 8.65 CsCAT18 9.12 9.20 13.17 13.35 5.02 4.65 CsCAT26 5.72 6.20 5.78 6.25 7.77 CsCAT38 4.97 5.21 6.60 7.11 CsCAT41 CsCAT5 8.77 8.78 10.13 10.20 6.16 5.79 5.89 4.78 CsCAT7 11.36 11.13 12.46 11.99 9.27 8.16 4.91 5.86 CsCAT8 6.24 6.30 7.11 7.23 5.15 EMCs15 12.07 11.89 14.04 13.62 16.20 15.25 性状
Trait叶片鲜质量
Fresh leaf weight/g叶片干质量
Dry leaf weight/g比叶质量
Specific leaf weight/(g·cm−2)叶绿素a
Chlorophyll a/(mg·g−1)叶绿素b
Chlorophyll b/(mg·g−1)叶绿素总量
Chlorophyll a + b/(mg·g−1)均值
Mean1.43 ± 0.31 0.68 ± 0.14 0.0095 ± 0.0010 0.42 ± 0.08 0.23 ± 0.03 0.65 ± 0.11 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM EMCs2 7.96 8.36 10.68 11.48 4.65 EMCs4 7.45 10.04 9.10 8.95 ICMA003 5.16 5.09 5.84 6.30 4.77 ICMA010 14.63 14.75 14.99 15.22 5.93 5.66 4.90 ICMA014 ICMA017s 13.73 13.86 15.50 15.76 7.52 7.16 6.09 4.97 ICMA022 KT010a 5.04 5.16 KT024a 6.92 6.78 6.44 6.18 PRA86 10.27 11.90 12.88 12.69 14.45 13.30 PRD21 7.54 7.47 8.38 8.31 PRD26 9.66 9.67 9.89 9.93 8.23 7.74 PRD52 性状
Trait类胡萝卜素
Carotenoids/
(mg·g−1)叶脉分枝角
Branch angle
of vein/(°)叶缘齿数
Number of leaf
edge teeth叶尖角
Leaf tip
angle/(°)叶基角
Leaf basal
angle/(°)叶脉数
Leaf vein
number均值
Mean0.47 ± 0.13 58.37 ± 3.84 30.88 ± 2.89 25.81 ± 7.16 112.98 ± 11.68 34.93 ± 2.70 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 5.46 5.60 CmTCR10 5.87 5.96 5.16 CmTCR13 8.89 9.93 CmTCR19 5.90 CmTCR22 6.36 7.66 CmTCR25 5.07 CsCAT15 CsCAT18 5.21 7.26 7.30 6.40 6.40 CsCAT26 4.95 CsCAT38 CsCAT41 4.67 CsCAT5 6.15 6.25 CsCAT7 5.96 5.96 CsCAT8 4.97 EMCs15 5.47 EMCs2 EMCs4 7.95 7.95 ICMA003 5.58 5.68 8.80 8.88 5.33 ICMA010 8.44 8.54 ICMA014 ICMA017s ICMA022 KT010a 5.06 KT024a PRD86 9.47 9.47 PRD21 5.76 PRD26 7.20 7.20 PRD52 5.07 5.04 GLM模型中,高达28个SSR标记位点与树高等24个农艺性状呈极显著关联,每个性状可检测到关联的SSR位点数1~22个不等,解释率范围为4.65%~24.02%。不同性状关联的位点数不同,3个生长性状中,与树高相关联的位点数最多,达16个,其中位点ICMA017s、PRD21关联解释率相对较高,分别能解释12.06%、11.60%的树高变异,而其它位点的解释率均不足10.00%。3个枝条性状中,关联位点数最多的性状为节间距,但其位点解释率偏低,均在8.00%以下。在叶片表型及其光合生理性状中,叶片宽度、叶面积及叶片干质量关联的位点数最多,均达22个。其中,叶片宽度、叶面积均与位点CsCAT7表现出较高的关联解释率,分别为16.70%、18.73%;与叶片干质量关联解释率最高的位点是ICMA017s,能解释15.50%的叶片干质量变异;部分叶片性状关联的位点较少,如类胡萝卜素仅与位点CsCAT18相关联,叶缘齿数仅与ICMA003相关联,叶绿素a仅与CmTCR22和CsCAT18相关联,叶脉分枝角仅与CsCAT26和ICMA010相关联。此外,不同位点关联的性状数也不相同,其中位点CsCAT41仅能解释4.67%的叶尖角变异,位点ICMA022仅能解释6.57%的树高变异,而位点CmTCR22与树高、地径等17个农艺性状关联,关联的性状最多,但解释率均在10.00%以下。
MLM模型中,得出26个SSR位点与树高等23个农艺性状呈极显著关联,解释率范围为5.04%~24.02%。与GLM模型关联分析的结果相比,部分性状关联的位点数以及部分位点关联的性状数均有所减少,但解释率差异不明显,其中位点CsCAT18不再与类胡萝卜素和叶绿素a关联,位点CsCAT26不再与叶脉分枝角关联。
综合两种模型关联分析结果,发现15个SSR标记与树高、地径、冠径3个生长性状关联,14个SSR标记与1年生枝条长度、1年生枝条粗度、节间距3个枝条性状关联,26个SSR标记与叶片长度等18个叶片表型及其光合生理性状关联。进一步对各性状高度关联的SSR标记进行筛选分析,最终得出ICMA017s等15个标记分别与树高等13个农艺性状高度关联,标记对性状的解释率均在10.00%以上(表3)。其中,ICMA017s与3个生长性状高度关联,PRD21与树高性状高度关联,表明这2个SSR标记与栗树体生长高度相关;PRD26、CmTCR4分别与1年生枝条粗度、1年生枝条长度高度关联,表明这2个标记与栗枝条生长发育高度相关;PRA86等15个标记分别与代表叶片大小、形状、厚度以及质量的8个表型性状高度关联,表明这些标记与栗叶片生长发育高度相关,同时,叶片各性状高度关联的标记数量差异较大,其中叶片干质量高度关联的标记数量达10个,其次为叶片宽度和叶面积,均为9个,而叶形指数关联的标记数量最少,仅2个。此外,还存在同一标记同时与多个性状高度关联的现象,如ICMA017s与树高、地径、冠径、叶片宽度、叶面积、叶片鲜质量及叶片干质量均存在高度关联,PRD21与树高、叶片长度、叶片宽度、叶形指数均高度关联,CmTCR4与1年生枝条长度、叶片厚度、叶片鲜质量、叶片干质量及比叶质量均高度关联,表明某些标记位点可能同时控制多个性状,且某一性状同时受多个标记位点控制。
表 3 性状高度关联SSR标记统计
Table 3. The traits with high associated SSR markers
性状
Trait显著关联标记
Significant associated markers解释率
Explanation ratio树高
HeightICMA017s、 PRD21 11.60%~12.06% 地径
Ground diameterICMA017s 13.79%~13.88% 冠径
Crown diameterICMA017s 12.78%~12.78% 1年生枝条粗度
Annual branch thicknessPRD26 11.75%~12.21% 1年生枝条长度
Annual branch lengthCmTCR4 11.02%~11.08% 叶片长度
Leaf lengthPRA86、PRD21、 PRD52 10.41%~11.93% 叶片宽度
Leaf widthCsCAT7、CsCAT15、CsCAT18、 ICMA010、ICMA017s、
KT024a、PRA86、PRD21、PRD2610.83%~16.70% 叶面积
Leaf areaCsCAT7、CsCAT15、ICMA010、 ICMA017s、KT024a、
PRA86、PRD21、PRD26、PRD5210.12%~18.73% 叶片厚度
Leaf thicknessCmTCR4、EMCs15、PRA86 10.75%~24.02% 叶形指数
Leaf indexPRA86、PRD21 10.02%~11.28% 叶片鲜质量
Fresh leaf weightCmTCR4、CsCAT7、EMCs15、ICMA010、ICMA017s、PRA86 10.25%~14.75% 叶片干质量
Dry leaf weightCmTCR4、CmTCR13、CsCAT5、CsCAT7、CsCAT18、
EMCs15、EMCs2、ICMA010、ICMA017s、PRA8610.13%~15.76% 比叶质量
Specific leaf weightCmTCR4、EMCs15、PRA86 11.39%~16.20%
栗杂交F1代群体遗传结构及其农艺性状关联分析
Genetic Structure and Association Analysis with Agronomic Traits of F1 Hybrids of Chestnut
-
摘要:
目的 解析控制栗属农艺性状的自然等位变异并获得与其相关联的SSR位点,为分子标记辅助选择和高效育种奠定基础。 方法 以涵盖9个杂交组合的235份栗杂交子代混合群体为材料,采用SSR标记对其进行群体遗传结构和连锁不平衡(LD)分析,并将32个高多态性SSR标记与25个农艺性状进行关联分析。 结果 统计概率P < 0.05时,32对SSR标记组成496个位点中存在一定的连锁不平衡,其中,74个位点的连锁不平衡水平较高,占总标记对的14.92%;而P < 0.01时,32个SSR位点间LD总体水平较低。群体遗传结构分析结果显示,当K=4时,Delta K值接近最大。据此,F1代混合群体被划分为4个亚群,且每个亚群中子代分布呈现出一定的遗传分化,平均混合度为0.120。GLM模型中,高达28个SSR标记位点与树高等24个农艺性状呈极显著关联,每个性状可检测到关联的SSR位点数1~22个不等,解释率范围为4.65%~24.02%;MLM模型中,得出26个SSR位点与树高等23个性状呈极显著关联,解释率范围为5.04%~24.02%。综合两种模型关联分析结果,发现15个SSR标记与树高等3个生长性状关联,14个SSR标记与1年生枝条长度等3个枝条性状关联,26个SSR标记与叶片长度等18个叶片表型及其光合生理性状关联。 结论 ICMA017s等15个SSR标记分别与树高等13个农艺性状高度关联,标记对性状的解释率均在10.00%以上,且存在同一标记与多个性状、同一性状与多个标记高度关联的现象。 Abstract:Objective To analyze the natural allelic variation which controls agronomic characters and obtain the associated SSR loci of chestnut for supporting molecular marker assisted selection and efficient breeding. Method A total of 235 chestnut hybrid progeny populations covering 9 cross combinations were used to analyze the genetic structure and linkage disequilibrium(LD)of the populations. And association analysis of 32 highly polymorphic SSR markers with 25 agronomic traits were conducted. Result There was a certain linkage disequilibrium in 496 loci of 32 SSR markers when P < 0.05, among which 74 loci had a higher level of linkage disequilibrium than the others, accounting for 14.92% of the total marker pairs. However, when P < 0.01, the overall level of LD among the 32 SSR loci was low. Genetic structure analysis results showed that when K=4, the Delta K value approximated the maximum. The F1 mixed population was divided into four sub-populations, and the distribution of offspring in each sub-population showed a certain degree of genetic differentiation, with an average degree of mixing of 0.120. In the GLM model, up to 28 SSR loci were significantly associated with 24 agronomic traits, and the associated SSR loci ranged from 1 to 22 for each trait, with interpretation rates ranging from 4.65% to 24.02%. In the MLM model, 26 SSR loci were significantly associated with 23 traits, and the interpretation rates ranged from 5.04% to 24.02%. Based on the correlation analysis results of the two models, 15 SSR markers were associated with 3 growth traits, 14 SSR markers were associated with 3 branch traits, and 26 SSR markers were associated with 18 leaf phenotype and photosynthetic physiological traits. Conclusion 15 SSR markers including ICMA017s are highly correlated with 13 agronomic traits, and the interpretation rates of markers for traits are more than 10.00%. In addition, there is a phenomenon that the same marker is highly correlated with multiple traits and the same trait is highly correlated with multiple markers. -
Key words:
- Castanea
- / hybrids
- / SSR marker
- / population genetic structure
- / association analysis
-
表 1 栗杂交组合概况
Table 1. Cross combination of chestnut
组合编号
Combination No.杂交组合
Combination子代数量
Number of hybridsC1 YLZ 26 × YLZ 14 14 C2 YLZ 26 × YLZ 15 30 C3 YLZ 24 × YLZ 1 30 C4 YLZ 24 × YLZ 15 30 C5 YLZ 1 × YLZ 24 30 C6 YLZ 1 × YLZ 2 17 C7 YLZ 14 × YLZ 1 24 C8 魁栗 Kuili × YLZ 15 30 C9 魁栗 Kuili × YLZ 1 30 表 2 GML和MLM模型关联标记及其对农艺性状的解释率
Table 2. Explanation ratio of associated markers with agronomic traits in GML and MLM models %
性状
Trait树高
Height/
m地径
Ground
diameter/cm冠径
Crown
diameter/m1年生枝条粗度
Annual branch
thickness/mm1年生枝条长度
Annual branch
length/cm节间距
Knot
spacing/cm均值
Mean6.23 ± 0.80 15.44 ± 3.23 5.08 ± 0.70 6.32 ± 0.61 42.38 ± 5.08 2.63 ± 0.30 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 5.50 6.21 8.24 8.51 11.02 11.08 CmTCR10 5.24 5.35 5.65 5.82 CmTCR13 6.15 6.15 6.75 6.97 CmTCR19 CmTCR22 8.85 8.85 5.56 5.59 5.25 5.19 5.01 5.06 5.76 5.73 CmTCR25 CsCAT15 7.09 7.09 5.55 5.69 CsCAT18 7.03 6.96 CsCAT26 4.81 CsCAT38 CsCAT41 CsCAT5 7.02 7.02 8.07 8.10 CsCAT7 8.81 8.81 5.59 5.62 5.01 5.19 CsCAT8 8.15 8.51 EMCs15 8.60 8.60 4.88 7.50 8.19 6.68 6.79 EMCs2 EMCs4 5.06 5.11 ICMA003 6.47 6.40 ICMA010 7.55 7.55 9.48 9.52 4.67 5.10 7..93 7.80 ICMA014 ICMA017s 12.06 12.06 13.79 13.88 8.59 12.78 6.19 6.23 ICMA022 6.57 6.57 KT010a 5.84 5.84 KT024a 8.66 8.78 PRA86 7.75 7.74 5.17 PRD21 11.60 11.60 7.49 7.50 5.67 PRD26 11.75 12.21 7.10 7.22 PRD52 5.45 5.59 6.64 8.58 性状
Trait叶柄长度
Petiole
length/mm叶片长度
Leaf
length/cm叶片宽度
Leaf
width/cm叶面积
Leaf
area/cm2叶片厚度
Leaf
thickness/mm叶形指数
Leaf
index均值
Mean15.68 ± 2.74 16.87 ± 1.47 5.84 ± 0.61 71.29 ± 11.96 0.178 ± 0.030 2.93 ± 0.28 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 6.09 6.18 6.68 6.68 8.02 8.23 10.75 10.75 CmTCR10 6.08 5.97 4.81 6.08 6.72 6.65 6.70 6.19 CmTCR13 7.09 7.10 6.82 6.82 9.86 9.84 7.07 7.07 CmTCR19 4.82 CmTCR22 6.63 6.61 8.85 8.85 8.28 8.41 7.02 9.03 5.79 5.81 CmTCR25 CsCAT15 8.25 8.29 10.83 10.83 12.47 12.64 ·续表2· 性状
Trait叶柄长度
Petiole
length/mm叶片长度
Leaf
length/cm叶片宽度
Leaf
width/cm叶面积
Leaf
area/cm2叶片厚度
Leaf
thickness/mm叶形指数
Leaf
index均值
Mean15.68 ± 2.74 16.87 ± 1.47 5.84 ± 0.61 71.29 ± 11.96 0.178 ± 0.030 2.93 ± 0.28 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CsCAT18 7.92 7.93 12.24 12.24 9.43 9.46 CsCAT26 9.26 9.26 8.98 9.03 7.92 7.92 6.70 6.73 CsCAT38 4.66 6.62 CsCAT41 CsCAT5 7.20 7.22 8.63 9.31 5.93 CsCAT7 8.07 8.09 16.70 16.70 18.73 18.51 8.48 14.69 5.15 5.21 CsCAT8 6.48 8.31 6.98 7.07 EMCs15 4.90 24.02 24.02 EMCs2 7.23 7.36 6.65 6.65 7.91 8.19 EMCs4 8.53 8.53 8.04 8.04 9.86 9.85 ICMA003 7.83 7.80 5.84 6.73 6.20 6.20 ICMA010 5.70 6.59 11.91 11.91 11.49 11.59 6.26 6.25 ICMA014 5.86 6.48 5.98 ICMA017s 9.72 9.81 16.69 16.69 14.17 17.46 6.85 9.07 5.34 5.36 ICMA022 KT010a 6.40 5.84 7.10 7.10 5.62 5.90 KT024a 5.16 4.93 16.16 16.16 12.59 12.50 8.35 8.34 PRA86 10.43 10.41 14.08 14.08 13.61 13.61 10.90 15.87 11.23 11.28 PRD21 10.45 10.52 11.13 11.13 10.18 10.12 5.56 10.02 10.08 PRD26 7.62 7.62 12.43 12.43 12.18 12.22 6.58 7.19 5.15 5.60 PRD52 11.92 11.93 8.89 8.89 10.47 10.43 性状
Trait叶片鲜质量
Fresh leaf
weight/g叶片干质量
Dry leaf
weight/g比叶质量
Specific leaf
weight/(g·cm−2)叶绿素a
Chlorophyll a/
(mg·g−1)叶绿素b
Chlorophyll b/
(mg·g−1)叶绿素总量
Chlorophyll a + b/
(mg·g−1)均值
Mean1.43 ± 0.31 0.68 ± 0.14 0.009 5 ± 0.001 0 0.42 ± 0.08 0.23 ± 0.03 0.65 ± 0.11 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 9.96 10.25 11.98 12.53 11.62 11.39 CmTCR10 7.30 6.22 CmTCR13 9.65 9.67 11.00 11.15 CmTCR19 4.68 CmTCR22 6.16 6.24 6.91 7.06 8.27 7.23 5.05 5.24 7.05 7.69 5.64 5.94 CmTCR25 5.86 6.40 6.63 7.11 CsCAT15 7.41 7.56 8.37 8.65 CsCAT18 9.12 9.20 13.17 13.35 5.02 4.65 CsCAT26 5.72 6.20 5.78 6.25 7.77 CsCAT38 4.97 5.21 6.60 7.11 CsCAT41 CsCAT5 8.77 8.78 10.13 10.20 6.16 5.79 5.89 4.78 CsCAT7 11.36 11.13 12.46 11.99 9.27 8.16 4.91 5.86 CsCAT8 6.24 6.30 7.11 7.23 5.15 EMCs15 12.07 11.89 14.04 13.62 16.20 15.25 性状
Trait叶片鲜质量
Fresh leaf weight/g叶片干质量
Dry leaf weight/g比叶质量
Specific leaf weight/(g·cm−2)叶绿素a
Chlorophyll a/(mg·g−1)叶绿素b
Chlorophyll b/(mg·g−1)叶绿素总量
Chlorophyll a + b/(mg·g−1)均值
Mean1.43 ± 0.31 0.68 ± 0.14 0.0095 ± 0.0010 0.42 ± 0.08 0.23 ± 0.03 0.65 ± 0.11 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM EMCs2 7.96 8.36 10.68 11.48 4.65 EMCs4 7.45 10.04 9.10 8.95 ICMA003 5.16 5.09 5.84 6.30 4.77 ICMA010 14.63 14.75 14.99 15.22 5.93 5.66 4.90 ICMA014 ICMA017s 13.73 13.86 15.50 15.76 7.52 7.16 6.09 4.97 ICMA022 KT010a 5.04 5.16 KT024a 6.92 6.78 6.44 6.18 PRA86 10.27 11.90 12.88 12.69 14.45 13.30 PRD21 7.54 7.47 8.38 8.31 PRD26 9.66 9.67 9.89 9.93 8.23 7.74 PRD52 性状
Trait类胡萝卜素
Carotenoids/
(mg·g−1)叶脉分枝角
Branch angle
of vein/(°)叶缘齿数
Number of leaf
edge teeth叶尖角
Leaf tip
angle/(°)叶基角
Leaf basal
angle/(°)叶脉数
Leaf vein
number均值
Mean0.47 ± 0.13 58.37 ± 3.84 30.88 ± 2.89 25.81 ± 7.16 112.98 ± 11.68 34.93 ± 2.70 标记
MarkerGLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM GLM MLM CmTCR4 5.46 5.60 CmTCR10 5.87 5.96 5.16 CmTCR13 8.89 9.93 CmTCR19 5.90 CmTCR22 6.36 7.66 CmTCR25 5.07 CsCAT15 CsCAT18 5.21 7.26 7.30 6.40 6.40 CsCAT26 4.95 CsCAT38 CsCAT41 4.67 CsCAT5 6.15 6.25 CsCAT7 5.96 5.96 CsCAT8 4.97 EMCs15 5.47 EMCs2 EMCs4 7.95 7.95 ICMA003 5.58 5.68 8.80 8.88 5.33 ICMA010 8.44 8.54 ICMA014 ICMA017s ICMA022 KT010a 5.06 KT024a PRD86 9.47 9.47 PRD21 5.76 PRD26 7.20 7.20 PRD52 5.07 5.04 表 3 性状高度关联SSR标记统计
Table 3. The traits with high associated SSR markers
性状
Trait显著关联标记
Significant associated markers解释率
Explanation ratio树高
HeightICMA017s、 PRD21 11.60%~12.06% 地径
Ground diameterICMA017s 13.79%~13.88% 冠径
Crown diameterICMA017s 12.78%~12.78% 1年生枝条粗度
Annual branch thicknessPRD26 11.75%~12.21% 1年生枝条长度
Annual branch lengthCmTCR4 11.02%~11.08% 叶片长度
Leaf lengthPRA86、PRD21、 PRD52 10.41%~11.93% 叶片宽度
Leaf widthCsCAT7、CsCAT15、CsCAT18、 ICMA010、ICMA017s、
KT024a、PRA86、PRD21、PRD2610.83%~16.70% 叶面积
Leaf areaCsCAT7、CsCAT15、ICMA010、 ICMA017s、KT024a、
PRA86、PRD21、PRD26、PRD5210.12%~18.73% 叶片厚度
Leaf thicknessCmTCR4、EMCs15、PRA86 10.75%~24.02% 叶形指数
Leaf indexPRA86、PRD21 10.02%~11.28% 叶片鲜质量
Fresh leaf weightCmTCR4、CsCAT7、EMCs15、ICMA010、ICMA017s、PRA86 10.25%~14.75% 叶片干质量
Dry leaf weightCmTCR4、CmTCR13、CsCAT5、CsCAT7、CsCAT18、
EMCs15、EMCs2、ICMA010、ICMA017s、PRA8610.13%~15.76% 比叶质量
Specific leaf weightCmTCR4、EMCs15、PRA86 11.39%~16.20% -
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