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横断山脉亚高山带几种高山栎林下丛枝菌根菌(AMF)调查

李鸿博 黄耀华 康定旭 伍建榕 马焕成 陈诗

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横断山脉亚高山带几种高山栎林下丛枝菌根菌(AMF)调查

    通讯作者: 马焕成, mhc@swfu.edu.cn ; 陈诗, cshi1981@qq.com
  • 中图分类号: Q945.31

Investigation of Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in several alpine oak understory forests in the subalpine zone of the Hengduan mountains

    Corresponding author: Ma Huan-cheng, mhc@swfu.edu.cn ;Chen Shi, cshi1981@qq.com
  • CLC number: Q945.31

  • 摘要: 目的 明确横断山脉亚高山带高山栎林下AMF孢子分类地位。 方法 自横断山脉亚高山带不同地段选择6个高山栎根围土壤和根系样本,对其土壤中AMF孢子利用湿筛沉淀法进行选取。利用AMF特异引物对其ITS区段18SrRNA基因进行扩增,结合形态学与分子生物学手段对其进行鉴定,构建系统发育演化树并推测其亲缘关系。 结果 表明:四川、西藏高山栎林下土壤AMF孢子与根系克隆为类球囊霉属(Paraglomus),云南香格里拉高山栎林下土壤AMF孢子与根系克隆为球囊霉属(Glomus)。克隆结果表明AMF能够广泛存在于高山栎组植物根系。根系苯胺蓝染色结果可见明显类似丛枝和泡囊的结构。综合高山栎土壤AMF孢子与根际AMF鉴定结果认为,高山栎林下存在大量AMF,且目前不同采样地高山栎林下根围土和根系分别仅发现一种AMF存在,提示各高山栎同时仅能与一种AMF发生共生关系。此外,高山栎林下AMF孢子在演化过程中发生分化并介于ParaglomusGlomus的分类地位之间,且西藏、四川地区AMF与云南香格里拉地区AMF存在差异。 结论 本研究发现自然条件下横断山脉亚高山地区高山栎林下菌塘普遍存在AMF,且云南香格里拉地区高山栎根系AM与Glomus属更接近,说明AM在长期演化过程中随地域迁移出现分化。为了解横断山脉亚高山带高山栎林下AMF的形成与演化提供理论参考。
  • 图 1  高山栎根部土壤中的AMF孢子形态特征

    Figure 1.  Morphological characteristics of AMF spore in soil of Quercus alpine root

    图 2  5种高山栎孢子密度特征

    Figure 2.  Spore density characteristics of five species of Quercus alpine

    图 3  四川、西藏几种高山栎根际土壤AMF孢子和根系克隆AMF基于18S rRNA基因序列与参考序列构建的系统进化树

    Figure 3.  Phylogenetic tree constructed by 18S rRNA gene sequence and reference sequence of several species of Quercus alpine rizosphere AMF spore and roots AMF clone in SiChuan and Tibet

    图 4  云南香格里拉高山栎根际土壤与根系AMF克隆结果基于18SrDNA序列与参考序列构建的系统进化树

    Figure 4.  Phylogenetic tree constructed by 18S rRNA gene sequence and reference sequence of several species of Quercus alpine rizosphere AMF spore and roots AMF clone in shangri-la, YunNan

    图 5  各高山栎根系AMF泡囊、丛枝结构

    Figure 5.  AMF vesicles and arbuscular structure of roots of Quercus alpine

    表 1  横断山脉亚高山几种高山栎样地分布情况调查表

    Table 1.  Survey of the distribution of several types of Quercus sample plots in the subalpine regions of Transverse Mountains

    树种
    species
    采集地
    collected location
    经纬度
    Altitude & Longitude
    海拔/m
    Elevation
    树高/m
    Tree height
    胸径/地径
    DBH/cm
    坡度
    Slope
    编号
    Sample NO.
    高山栎
    Quercus semicarpifolia
    西藏林芝察隅
    国道219、559旁
    97°29′17″~
    97°29′19″ E
    28°50′7″~
    28°50′27″ N
    2 610 28 92 33° GSL1
    14 20
    18 40
    24 80
    长穗高山栎
    Quercus longispica
    西藏林芝察隅国道559旁 97°11′29″ E
    29°13′31″ N
    3 440 2.0 6 12°阳坡 GSL2
    刺叶高山栎
    Quercus spinosa
    四川阿坝马尔康县梦笔山 31°43′28″ E
    102°16′38″ N
    3 630 2.2 4 28°半阳坡 GSL3
    川滇高山栎
    Quercus aquifolioides
    四川阿坝巴郎山国道310旁 102°50′18″ E
    30°59′35″ N
    3 480 2.1 4.5 30°阳坡 GSL4
    高山栎
    Quercus semicarpifolia
    西藏察隅桑久村219国道 101°8′42″ E
    31°52′42″ N
    2 970 1.83.2 818 48°阳坡 GSL5
    乔木型高山栎(未鉴定)
    Quercus arborescens
    (not identified)
    云南香格里拉奔子栏镇附近 99°11′46″ E
    28°11′51″ N
    2 740 17 55 30°阳坡 G
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    表 2  几种高山栎根部土壤AMF形态特征

    Table 2.  Morphological characteristics of soil AMF in roots of several Quercus alpine

    采集树种
    Tree species
    孢子编号
    Spore NO.
    孢子颜色
    Spore color
    孢子形状
    Spore shape
    孢子直径/
    um
    Diameter
    of spore
    孢壁层数
    Spore
    wall
    layers
    Melzer’s
    染色反应
    staining
    reaction
    其他特征
    Other features
    高山栎Quercus
    semicarpifolia Smith
    (乔木)
    GSL1-001 黑色 近圆形 130~160 整体通黑、质硬,压裂
    后未能明显分辨包子层数
    GSL1-003 深棕黑色 近球形 110~140 1 ­— 孢子质软,有内含物
    GSL1-005 棕褐色 球形或近球形 70~100 2 孢子壁较厚,颜
    色由外及里发生渐变
    GSL1-007 深黄色 球形 90~130 2 孢子壁界限清晰,有内含物
    长穗高山栎
    Quercus longispica (Hand.-Mazz.)
    A. Camus(灌木)
    GSL2-008 黑色 球形或近球形 130~170 质硬、表面有轻
    微凸起并有内含物
    GSL2-010 棕色或暗棕色 圆形至近圆形 120~150 2 孢子壁光滑、分层明显
    GSL2-012 深棕色 椭圆形 50~80 2 表面不光滑且有少量覆
    盖物孢内含分泌物
    GSL2-014 深棕色至棕黑色 圆形至近椭圆形 80~110 2 孢表面有明显双层网纹,
    网孔呈不规则多边形
    刺叶高山栎
    Quercus spinosa David
    ex Franch.(灌木)
    GSL3-007 黑色 球形或近球形 80~100 1 ­— 表面粗糙,具分泌物
    且具网状结构
    GSL3-009 深棕色 近球形或椭圆 70~100 1 表面光滑,可见
    纹路零散分布
    GSL3-010 黑色 椭圆形、近球形 50~70 黑色,孢壁破损后未见
    明显孢子壁及分层

    川滇高山栎
    Quercus aquifolioides
    Rehd. et Wils(灌木)
    GSL4-003 深棕至红棕色 圆形或近圆形 60~90 2 内含物为无色透明似油滴状
    GSL4-004 深棕至黄棕色 球形或近球形 60~90 2 孢壁界限明显,表面不光滑
    GSL4-006 深棕色 球形至近球形 100~120 1 表面光滑,有覆盖物
    GSL4-00Y 黑褐色 近球形 120~150 2 表面光滑孢子壁界限,颜色较
    浅,内容物为深棕黑色
    高山栎Quercus
    semicarpifolia Smith
    (巨大乔木)
    GSL5-004 黑色 近球形或不规则 160~220 3 质硬易碎、实心;压破
    孢子孢壁未见明显分层
    GSL5-006 黑色 球形至近球形 120~160 3 孢壁未见明显分层且不光滑
    GSL5-008 黑色 近球形或卵形 50~75 2 压破未见明显孢壁分层
    GSL5-012 深棕至暗棕红 近球形 100~130 1 ­— 孢壁较厚,内含分泌物
    GSL5-016 棕色至深棕色 球形或近球形 280~480 2 可见孢子梗
    云南香格里拉高山栎
    Quercus spp.
    GA 棕至深棕褐色 近橄榄球型 75~90 3 表面光滑,具有内含物
    GB 深棕至黑色 球形 55~75 3 具内含物,可见孢子梗
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    表 3  各高山栎AMF与GenBank中的序列信息比对

    Table 3.  Comparison of sequence information of each alpine oak AMF with that in GenBank

    树种
    species
    采集地
    collected location
    菌株号
    Strains No.
    GenBank中相近菌株
    Nearest type strain
    GenBank登录号
    Accession No.
    相似度
    Identity/%

    Family

    Genus
    高山栎
    Quercus
    semicarpifolia
    西藏林芝察隅
    国道219旁2610 m
    GSL1-001 类球囊霉科
    Paraglomeraceae
    Paraglomus sp. LT935278 97.2
    GSL1-003 Paraglomus sp. LT935278 99.2
    GSL1-005 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983307 99.2
    GSL1-007 Paraglomus sp. LT935278 96.1
    长穗高山栎
    Quercus
    longispica
    西藏林芝察隅
    国道559旁3440 m
    GSL2-008 Paraglomus sp. LT935278 97.2
    GSL2-010 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT935278 98.0
    GSL2-012 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983306 98.5
    GSL2-014 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT984328 91.7
    刺叶高山栎
    Quercus
    spinosa
    四川阿坝马尔康县
    梦笔山3630 m
    GSL3-007 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983306 98.6
    GSL3-009 Paraglomus sp. LT935278 95.8
    GSL3-010 Paraglomus sp. LT935517 96.3
    川滇高山栎
    Quercus
    aquifolioides
    四川阿坝巴郎山
    国道310旁3540 m
    GSL4-003 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT984234 93.3
    GSL4-004 Paraglomus sp. LT935517 96.5
    GSL4-006 Paraglomus sp. LT935482 93.9
    GSL4-00Y Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT984234 90.9
    (巨大乔木)高山栎
    Quercus
    semicarpifolia
    西藏林芝察隅国道
    桑久村219旁
    GSL5-004 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983016 91.3
    GSL5-006 Paraglomus sp. LT935278 96.4
    GSL5-008 Paraglomus sp. LT935278 96.2
    GSL5-012 Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983306 98.6
    GSL5-016 Paraglomus sp. LT935517 95.6
    高山栎
    Quercus
    semicarpifolia
    西藏林芝察隅
    国道219旁2610 m
    GSL1-a Paraglomus IH1
    VTX00444
    LT983016 90.3
    川滇高山栎
    Quercus
    aquifolioides
    川滇高山栎
    Quercus aquifolioides
    GSL4-a Paraglomus sp. LT935482 92.9
      注:GSL1-a、GSL4-a为根系克隆结果比对,其余为AMF孢子序列比对.
      Note: GSL1-A and GSL4-A were the comparison of root clone results, and the rest were the comparison of AMF spore sequences.
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    表 4  香格里拉地区高山栎根系AMF 克隆与其土壤中AMF孢子的对比结果

    Table 4.  Comparison of AMF clones in roots of Quercus alpine and AMF spores in soil in Shangri-La area

    树种
    species
    采集地
    collected location
    孢子/菌株号
    Strains No.
    GenBank中相近菌株
    Nearest type strain
    GenBank登录号
    Accession No.
    相似度
    Identity/%

    Family

    Genus
    (乔木型)高山栎
    Quercus semicarpifolia
    (not identified)
    云南香格里拉奔子栏镇 GA 球囊霉科
    Glomeraceae
    Glomus sp. VTX00301 KC579428 98.1
    GB Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    (乔木型)高山栎
    Quercus semicarpifolia
    (not identified)
    云南香格里拉奔子栏镇 G1 球囊霉科
    Glomeraceae
    Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G2 Glomus sp. VTX00113 JX144124 98.9
    G3 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G4 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G5 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G6 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G7 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G9 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G10 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G11 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G12 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G15 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G16 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
    G17 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      注:GA、GB为香格里拉高山栎样点孢子的18rRNA基因扩增结果,与根系克隆结果形成对照。
      Notes: GA、GB was the result of amplification of 18rRNA gene from the spores of Quercus shangrila.
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-04-08
  • 录用日期:  2022-06-01
  • 网络出版日期:  2022-06-09

横断山脉亚高山带几种高山栎林下丛枝菌根菌(AMF)调查

    通讯作者: 马焕成, mhc@swfu.edu.cn
    通讯作者: 陈诗, cshi1981@qq.com
  • 1. 西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室,云南 昆明 650224
  • 2. 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,西南林业大学 生物多样性保护学院,云南 昆明 650224

摘要:  目的 明确横断山脉亚高山带高山栎林下AMF孢子分类地位。 方法 自横断山脉亚高山带不同地段选择6个高山栎根围土壤和根系样本,对其土壤中AMF孢子利用湿筛沉淀法进行选取。利用AMF特异引物对其ITS区段18SrRNA基因进行扩增,结合形态学与分子生物学手段对其进行鉴定,构建系统发育演化树并推测其亲缘关系。 结果 表明:四川、西藏高山栎林下土壤AMF孢子与根系克隆为类球囊霉属(Paraglomus),云南香格里拉高山栎林下土壤AMF孢子与根系克隆为球囊霉属(Glomus)。克隆结果表明AMF能够广泛存在于高山栎组植物根系。根系苯胺蓝染色结果可见明显类似丛枝和泡囊的结构。综合高山栎土壤AMF孢子与根际AMF鉴定结果认为,高山栎林下存在大量AMF,且目前不同采样地高山栎林下根围土和根系分别仅发现一种AMF存在,提示各高山栎同时仅能与一种AMF发生共生关系。此外,高山栎林下AMF孢子在演化过程中发生分化并介于ParaglomusGlomus的分类地位之间,且西藏、四川地区AMF与云南香格里拉地区AMF存在差异。 结论 本研究发现自然条件下横断山脉亚高山地区高山栎林下菌塘普遍存在AMF,且云南香格里拉地区高山栎根系AM与Glomus属更接近,说明AM在长期演化过程中随地域迁移出现分化。为了解横断山脉亚高山带高山栎林下AMF的形成与演化提供理论参考。

English Abstract

  • 菌根是一种发生在植物根系和土壤菌根真菌之间建立的古老共生体系,在自然界中存在已有4亿年之久[1],有研究统计,地球上大约86%的陆生被子植物能够与真菌互作形成菌根共生体[2-3]。丛枝菌根真菌(AMF)作为植物根系所在土壤环境中微生物群落的重要组成者之一,在个体层面可以促进植物对K+、Ca2+、Mg2+离子的有效吸收,帮助植物抵御逆境中来自生物或非生物的胁迫,宏观群落层面则能够优化植被分布,森林中地下的庞大菌根系统能够将林木个体有机相连而形成一个物质资源共享体,加速种群建成并形成植物优势种,从而改变生态格局[4-6],可以说,菌根真菌和植物共生,是维护森林生态系统稳定及发展的基础[7-8]

    高山栎(Quercus spp.)作为一类广泛分布在我国西部川、滇、藏地区的常绿硬叶栎类植物,是横断山脉地区重要的野生植被群落优势种,多以成规模的林地出现或以离散点状方式与其他乔木混生生长于海拔1 800~4 800 m的地区[9-10],其热值高、生长速度快及萌蘖更新能力强的特点对该地区生态环境保持具有重要意义[11-12]。当前,外界公认松科植物共生菌根类型为外生菌根已毋庸置疑。而栎属植物存在外生菌根共生现象的同时,是否能与内生菌根真菌共生尚鲜有报道。杨淑娇[13]等对云南香格里拉高山栎和高山松(Pinus densata Mast.)的林下菌塘微生物分布研究发现,高山栎林下菌塘有大量AMF存在,且高山栎林下菌塘中真菌和AMF生物量显著高于高山松,但AMF种类丰度只有一种,综合高山栎和高山松林型下菌塘的多种微生物比较认为,菌塘中的微生物类型是其菌落结构组成的重要影响因素,林型则未影响林下微生物群落特征构成。该研究说明在错综复杂的地下根系网络中,不同类型土壤微生物之间的相互联系往往对宿主植物林下菌群结构和分布具有重要影响。张中峰[14]等人将摩西球囊霉(Glomus mosseae (Nicol. & Gerd.) Gerd. & Trapp)和根内球囊霉(Glomus intraradices Schenck & Smith )接种至青冈栎(Quercus glauca (Thunberg) Oersted)幼苗发现AMF能够显著促进青冈栎幼苗叶面积和生物量增长,提升幼苗成活率,该结果表明在人为干扰措施下,栎属植物能够与AMF形成互惠共生关系。基于上述前人研究不难推测,AMF与高山栎组植物间应当存在相应的联系。这种联系是否具有广泛性和普遍性?同为被子植物门下的栎属植物高山栎根系在非人为干扰的野生生境中,其根际及根系是否同AMF共生等问题值得深入探究。基于此,本研究假设横断山脉亚高山地区高山栎林下同样具有AMF分布,并且在自然条件下高山栎植物根系存在AMF。分三步验证上述假设:第一,利用湿筛沉淀法对采自横断山脉不同地区高山栎林下土壤样本进行孢子湿筛,利用形态学、分子生物学结合的手段对其种类进行鉴定。第二,利用分子克隆方法选取针对AMF 18S rRNA gene的特异引物对高山栎外根际潜在的AMF进行扩增,测序检验扩增结果中是否存在AMF。第三,利用染色观察的方法观察高山栎根系样本内是否存在典型的AMF丛枝、泡囊结构,结合对比单孢提取与克隆扩增结果,以期明确横断山脉亚高山带自然环境中生长的高山栎林下根围、根际AMF种类,揭示横断山脉亚高山高山栎林下AMF的演化方向。

    • 横断山脉作为世界年轻的山脉群之一,纵跨川、滇二省西部及西藏东部,山岭曲折蜿蜒,谷高差悬殊,植被分布以海拔梯度差异明显,受高空西风环流、印度洋及太平洋季风环流影响,气候主要分为干湿两季,降水多集中于5—10月,但因地形地势复杂,地域辽阔,年均气温13.6 ℃,年降雨量942.6 mm,部分地区降雨差异较明显[9,15]。由于该地区地势陡峭,降雨所致的水土流失成为潜在威胁。

    • 于2020年7月、10月和2021年8月分别前往位于28°45′3″~30°59′35″ N, 97°40′25″~102°50′18″ E(四川、西藏等地)以及99°11′46″E、28°11′51″N(云南香格里拉)地段,横断山脉亚高山带的不同海拔(2 340~3 630 m)地区(表1)阳坡地段高山栎天然林,各高山栎林均为乔木或灌木纯林,林下无其他植被。采集其根部15~30 cm处的土壤混合装入9号自封袋,沿主根对高山栎根系进行挖掘,找到高山栎根系侧根、须根等与根际土装入自封袋,放入含冰袋的保温箱隔离贮存,标记并编号,带回实验室将根系于−80 ℃保存,土壤平铺风干置于塑封袋用于后续实验。

      表 1  横断山脉亚高山几种高山栎样地分布情况调查表

      Table 1.  Survey of the distribution of several types of Quercus sample plots in the subalpine regions of Transverse Mountains

      树种
      species
      采集地
      collected location
      经纬度
      Altitude & Longitude
      海拔/m
      Elevation
      树高/m
      Tree height
      胸径/地径
      DBH/cm
      坡度
      Slope
      编号
      Sample NO.
      高山栎
      Quercus semicarpifolia
      西藏林芝察隅
      国道219、559旁
      97°29′17″~
      97°29′19″ E
      28°50′7″~
      28°50′27″ N
      2 610 28 92 33° GSL1
      14 20
      18 40
      24 80
      长穗高山栎
      Quercus longispica
      西藏林芝察隅国道559旁 97°11′29″ E
      29°13′31″ N
      3 440 2.0 6 12°阳坡 GSL2
      刺叶高山栎
      Quercus spinosa
      四川阿坝马尔康县梦笔山 31°43′28″ E
      102°16′38″ N
      3 630 2.2 4 28°半阳坡 GSL3
      川滇高山栎
      Quercus aquifolioides
      四川阿坝巴郎山国道310旁 102°50′18″ E
      30°59′35″ N
      3 480 2.1 4.5 30°阳坡 GSL4
      高山栎
      Quercus semicarpifolia
      西藏察隅桑久村219国道 101°8′42″ E
      31°52′42″ N
      2 970 1.83.2 818 48°阳坡 GSL5
      乔木型高山栎(未鉴定)
      Quercus arborescens
      (not identified)
      云南香格里拉奔子栏镇附近 99°11′46″ E
      28°11′51″ N
      2 740 17 55 30°阳坡 G
    • 将高山栎根部土壤过40目筛后,精确称量20 g土壤,倒入玻璃烧杯,加500 mL超纯水浸泡12 h后,利用湿筛沉淀法[16-17]过4目(100目165 μm、140目105 μm、200目74 μm、300目50 μm)筛出并将每一目筛出的孢子及细土倒入容积为1 L的烧杯静置,静置15 min后倒300 mL入封液漏斗,后向烧杯内加水至500 mL。静置15 min后向漏斗中填200 mL ddH2O,此步骤重复3次。后静置15 min并弃漏斗废液300 mL。将每一目筛孢子用的封液漏斗置于铁架台,使用抽滤机(Rocker 600)将孢子抽滤至实验前预备好的画有方格的滤纸上,编号标记并放入4 ℃冰箱保存备用。

    • 在体式镜(LAICA SE6)下从培养皿中的滤纸上挑出形态、颜色等不同的孢子,单个置于滴加ddH2O的载玻片上在光学显微镜(LEICA MC170)下观察并拍照,记录孢子颜色、大小,轻轻将其压破,观察孢壁颜色、类型、厚度、层数及内含物特征等,载玻片上还可加入Melzer’s染液观察是否存在显色反应[18],并拍照保存。同时,每拍摄一个孢子将与其形态相同的孢子挑至1.5 mL的离心管内 − 20 ℃冰冻保存,以便做分子鉴定时一一对应。参照《VA菌根真菌鉴定手册》(1988)和http://invam.caf.wvu.edu网址上的图片对照及近年来所发表的研究文献成果,进行形态学鉴定[19]

      在体式镜下统计每个土样下的孢子数目,并计算出孢子密度,每个土样4次重复。

      孢子密度(Spore density,SD):指每克土样中丛枝菌根真菌的孢子个数。

      SD=某土样中AMF所有孢子数/土壤干质量[20]

    • 利用Chelex-100提取单孢DNA,向装有孢子的离心管中加入600 μL ddH2O,置入超声波震荡洗涤仪器(30 Hz)震荡3 min,挑出孢子转移至新的离心管,重复上述步骤以清洗孢子表面存在的杂质。将清洗后的单孢转移至新的离心管中(1.5 mL),加入30 μL TE buffer,置于盛有液氮的保温瓶速冻,取已灭菌的研磨棒在体式显微镜下将孢子研碎。加入15 μL 20% Chelex-100后置于金属恒温水浴锅98 ℃裂解10 min,放入−20 ℃冰箱冰浴5 min后取出,置于离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R)12 000 r ∙ min−1离心10 min,所得上清液即为用于扩增的孢子的DNA模板。

      参照《菌根学》[21]中的扩增办法,对孢子DNA模板进行巢式PCR扩增。第一轮扩增上下游引物为GeoL1(5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3),GeoA2(5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)反应体系为50 μL(ddH2O 20 μL,Taq PCR Master Mix 25 μL,ITS1 1.5 μL,ITS41.5 μL,DNA 2 μL)。94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,其中变性、退火、延伸进行35个循环,后72 ℃延伸10 min。将扩增后的PCR原液稀释10~20倍作为第二轮DNA扩增模板,第二轮PCR上下游引物为AM1(5′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′)和NS31-GC(5′-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′)94 ℃预变性2 min,94 ℃变性45 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,其中变性、退火、延伸进行35个循环,后72 ℃延伸7 min,回收PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(110 V,25 min)经凝胶成像系统(Molecular Imager GEL Doc TM XR)检测,观察结果,拍照并记录。将条带清晰的产物送擎科生物公司(TSINGKE 昆明)测序分析。

    • 为证明高山栎根系内外根际存在AMF,取−80 ℃冷冻保存的西藏、四川(GSL1-a,GSL4-a)以及香格里拉地区的高山栎根系(G)样本,置于流水下冲洗根系表面后,分别剪成1 cm长的小段放入1.5 mL的离心管中,加入75%的酒精后剧烈震荡20 s,将根系取出至ddH2O下冲洗,后放入已灭菌的研钵加液氮速冻并研磨至粉末状。利用试剂盒(EZUP柱式植物基因组DNA抽提试剂盒,SANGONG),严格按照盒内使用说明书的操作步骤提取高山栎根系总DNA,使用AMF的特异上下游引物AML1,AML2对高山栎内外根际潜在的AM真菌 DNA进行扩增。反应体系为50 μL(ddH2O 24.8 μL,Taq PCR Master Mix 16.2 μL,AML1、AML2各2.5 μL,DNA 4 μL)。步骤为94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,54 ℃复性1 min,72 ℃退火2 min,其中变性、复性、退火进行35个循环,后72 ℃延伸10 min。之后经凝胶电泳(同2.1.3)检测后,利用PCR产物纯化回收试剂盒,纯化回收产物,使用克隆试剂盒(零背景TOPO-TA克隆试剂盒)严格按照使用说明将回收的DNA插入质粒载体。于37 ℃在LB液体培养基中培养1 h(将液体培养基放入摇床180~200 rpm震荡培养)。培养完成后在超净工作台下取200 μL菌液涂布于提前加入氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上,待培养基吸收后封存,37 ℃恒温培养12~16 h。

      在超净工作台下将培养好的菌落用无菌的移液器吸头(量程为20 μL)挑入提前加装10 μL ddH2O的PCR管并抽吸混匀,利用AML1和AML2 引物对DNA模板进行扩增。反应体系为50 μL(ddH2O 22.8 μL,Taq PCR Master Mix 20.2 μL,AML1 、AML2各2.5 μL,DNA 2 μL)。94 ℃预变性2 min,94 ℃变性45 s,65 ℃复性1 min,72 ℃退火45 min,其中变性、复性、退火进行35个循环,后72 ℃延伸10 min。经凝胶电泳检测后将扩增结果良好的样本送至测序公司(SanGong 昆明)测序。

    • 分别将两次采集的根系须根样本剪裁成0.5~1 cm的小段,置入盛有10% KOH溶液的试管于水浴锅90 ℃脱色处理,直至根系颜色变淡,用蒸馏水反复冲洗后加入0.5%的苯胺蓝染液继续90 ℃染色1 h,重复冲洗步骤用3%乳酸、甘油脱色2~3 d至半透明后,置于显微镜下观察根系内的AMF 泡囊丛枝结构。

    • 利用Chromas2.22、观察序列峰图、DNA man 8剪贴与拼接序列。将序列提交至NCBI基因数据库比对并下载同源序列。使用Mega X多序列比对并筛选建树模型,选择参数值最高的推荐模型,利用最大似然法1000次循环检验构建系统发育树。

      运用EXCEL2016 统计孢子密度数据及扩增样本序列比对数据。

    • 对高山栎根部10~30 cm土壤的筛取结果表明,各高山栎样地下均有大量AMF孢子存在,孢子直径在50~220 μm之间,形状以球形、近球形为主。颜色多以黑色和深棕色出现,偶见棕黄或深棕红。其中部分孢子呈黑色,该类孢子在显微镜下压裂未见明显孢壁层数,部分孢子有分泌物渗出(表2图1)。目前经实验观察的孢子均未见Melzer’s染液染色反应。5种高山栎根系土壤样本中孢子密度分别为GSL2(205.49)>GSL4(178.90)>GSL1(88.39)>GSL3(43.84)>GSL5(16.16)个·g−1,不同高山栎土壤样本具有明显差异,且呈乔木高山栎大于灌木的趋势(图2)。其中,GSL3为灌木但表现出孢子密度相对较低的特征。各样本孢子100目下(直径>165 μm)以黑色硬质孢子为主,多数孢子密集分布于300目筛(50~74 μm)内,呈深棕色。

      图  1  高山栎根部土壤中的AMF孢子形态特征

      Figure 1.  Morphological characteristics of AMF spore in soil of Quercus alpine root

      表 2  几种高山栎根部土壤AMF形态特征

      Table 2.  Morphological characteristics of soil AMF in roots of several Quercus alpine

      采集树种
      Tree species
      孢子编号
      Spore NO.
      孢子颜色
      Spore color
      孢子形状
      Spore shape
      孢子直径/
      um
      Diameter
      of spore
      孢壁层数
      Spore
      wall
      layers
      Melzer’s
      染色反应
      staining
      reaction
      其他特征
      Other features
      高山栎Quercus
      semicarpifolia Smith
      (乔木)
      GSL1-001 黑色 近圆形 130~160 整体通黑、质硬,压裂
      后未能明显分辨包子层数
      GSL1-003 深棕黑色 近球形 110~140 1 ­— 孢子质软,有内含物
      GSL1-005 棕褐色 球形或近球形 70~100 2 孢子壁较厚,颜
      色由外及里发生渐变
      GSL1-007 深黄色 球形 90~130 2 孢子壁界限清晰,有内含物
      长穗高山栎
      Quercus longispica (Hand.-Mazz.)
      A. Camus(灌木)
      GSL2-008 黑色 球形或近球形 130~170 质硬、表面有轻
      微凸起并有内含物
      GSL2-010 棕色或暗棕色 圆形至近圆形 120~150 2 孢子壁光滑、分层明显
      GSL2-012 深棕色 椭圆形 50~80 2 表面不光滑且有少量覆
      盖物孢内含分泌物
      GSL2-014 深棕色至棕黑色 圆形至近椭圆形 80~110 2 孢表面有明显双层网纹,
      网孔呈不规则多边形
      刺叶高山栎
      Quercus spinosa David
      ex Franch.(灌木)
      GSL3-007 黑色 球形或近球形 80~100 1 ­— 表面粗糙,具分泌物
      且具网状结构
      GSL3-009 深棕色 近球形或椭圆 70~100 1 表面光滑,可见
      纹路零散分布
      GSL3-010 黑色 椭圆形、近球形 50~70 黑色,孢壁破损后未见
      明显孢子壁及分层

      川滇高山栎
      Quercus aquifolioides
      Rehd. et Wils(灌木)
      GSL4-003 深棕至红棕色 圆形或近圆形 60~90 2 内含物为无色透明似油滴状
      GSL4-004 深棕至黄棕色 球形或近球形 60~90 2 孢壁界限明显,表面不光滑
      GSL4-006 深棕色 球形至近球形 100~120 1 表面光滑,有覆盖物
      GSL4-00Y 黑褐色 近球形 120~150 2 表面光滑孢子壁界限,颜色较
      浅,内容物为深棕黑色
      高山栎Quercus
      semicarpifolia Smith
      (巨大乔木)
      GSL5-004 黑色 近球形或不规则 160~220 3 质硬易碎、实心;压破
      孢子孢壁未见明显分层
      GSL5-006 黑色 球形至近球形 120~160 3 孢壁未见明显分层且不光滑
      GSL5-008 黑色 近球形或卵形 50~75 2 压破未见明显孢壁分层
      GSL5-012 深棕至暗棕红 近球形 100~130 1 ­— 孢壁较厚,内含分泌物
      GSL5-016 棕色至深棕色 球形或近球形 280~480 2 可见孢子梗
      云南香格里拉高山栎
      Quercus spp.
      GA 棕至深棕褐色 近橄榄球型 75~90 3 表面光滑,具有内含物
      GB 深棕至黑色 球形 55~75 3 具内含物,可见孢子梗

      图  2  5种高山栎孢子密度特征

      Figure 2.  Spore density characteristics of five species of Quercus alpine

    • 对西藏、四川各高山栎根围土壤中的AMF分子鉴定结果表明,横断山脉不同海拔地区采集的高山栎土壤AMF均与类球囊霉科(Paraglomeraceae)类球囊霉属(Paraglomus)具有较近的亲缘关系(表3)。经西弗吉尼亚大学孢子比对网站(occultum | Davis - INVAM | West Virginia University (wvu.edu))比对发现,Paraglomus属下目前收录的菌种仅有巴西类球囊霉 (Paraglomus brasilianum (Spain & J. Miranda) J.B. Morton & D. Redecker)和隐类球囊霉(Paraglomus occultum (C. Walker) J.B. Morton & D. Redecker)但这两种AM 孢子在颜色、质地、孢壁层数与Melzer’s染液反应效果与目标菌种均明显不同。利用Mycobank检索AMF Paraglomus属,选取Gosling P和Mello C M A等[22-23]发表的AMF Paraglomus属的几种序列,以及MAARJAM (ut.ee)中与本研究孢子相似度高于90%(相似度为90.9%~99.2%)的序列对几种高山栎林下AMF孢子进行系统发育树构建。结果表明,明确到种的Paraglomus序列聚为一支,MAARJAM (ut.ee)中Paraglomeraceae Paraglomus sp.属序列与样本GSL2-014聚为一支(图3),其余所有孢子与根系AMF克隆样本能够单独聚为一支,其中同源序列相似度高于97%[24]的个体极有可能为类球囊霉属内某种真菌。

      表 3  各高山栎AMF与GenBank中的序列信息比对

      Table 3.  Comparison of sequence information of each alpine oak AMF with that in GenBank

      树种
      species
      采集地
      collected location
      菌株号
      Strains No.
      GenBank中相近菌株
      Nearest type strain
      GenBank登录号
      Accession No.
      相似度
      Identity/%

      Family

      Genus
      高山栎
      Quercus
      semicarpifolia
      西藏林芝察隅
      国道219旁2610 m
      GSL1-001 类球囊霉科
      Paraglomeraceae
      Paraglomus sp. LT935278 97.2
      GSL1-003 Paraglomus sp. LT935278 99.2
      GSL1-005 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983307 99.2
      GSL1-007 Paraglomus sp. LT935278 96.1
      长穗高山栎
      Quercus
      longispica
      西藏林芝察隅
      国道559旁3440 m
      GSL2-008 Paraglomus sp. LT935278 97.2
      GSL2-010 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT935278 98.0
      GSL2-012 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983306 98.5
      GSL2-014 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT984328 91.7
      刺叶高山栎
      Quercus
      spinosa
      四川阿坝马尔康县
      梦笔山3630 m
      GSL3-007 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983306 98.6
      GSL3-009 Paraglomus sp. LT935278 95.8
      GSL3-010 Paraglomus sp. LT935517 96.3
      川滇高山栎
      Quercus
      aquifolioides
      四川阿坝巴郎山
      国道310旁3540 m
      GSL4-003 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT984234 93.3
      GSL4-004 Paraglomus sp. LT935517 96.5
      GSL4-006 Paraglomus sp. LT935482 93.9
      GSL4-00Y Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT984234 90.9
      (巨大乔木)高山栎
      Quercus
      semicarpifolia
      西藏林芝察隅国道
      桑久村219旁
      GSL5-004 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983016 91.3
      GSL5-006 Paraglomus sp. LT935278 96.4
      GSL5-008 Paraglomus sp. LT935278 96.2
      GSL5-012 Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983306 98.6
      GSL5-016 Paraglomus sp. LT935517 95.6
      高山栎
      Quercus
      semicarpifolia
      西藏林芝察隅
      国道219旁2610 m
      GSL1-a Paraglomus IH1
      VTX00444
      LT983016 90.3
      川滇高山栎
      Quercus
      aquifolioides
      川滇高山栎
      Quercus aquifolioides
      GSL4-a Paraglomus sp. LT935482 92.9
        注:GSL1-a、GSL4-a为根系克隆结果比对,其余为AMF孢子序列比对.
        Note: GSL1-A and GSL4-A were the comparison of root clone results, and the rest were the comparison of AMF spore sequences.

      图  3  四川、西藏几种高山栎根际土壤AMF孢子和根系克隆AMF基于18S rRNA基因序列与参考序列构建的系统进化树

      Figure 3.  Phylogenetic tree constructed by 18S rRNA gene sequence and reference sequence of several species of Quercus alpine rizosphere AMF spore and roots AMF clone in SiChuan and Tibet

    • 利用AMF特异引物AML1、AML2对香格里拉地区的高山栎根系潜在AMF的ITS片段DNA克隆,结果表明,经75%浓度酒精对高山栎根系表面消毒30 s后,其根系表面仍存在AMF的DNA。通过MAARJAM (ut.ee)网站比对发现,存在真菌普遍与球囊霉属Glomus在Genbank中的标准序列相似度较高,部分目标菌种序列与Genbank中的序列对比有相似度较高的类球囊霉属Paraglomus序列存在,但其在覆盖度(Query coverage)或最大识别度(Max identity)两个指标并非最高(表4)。利用Bio-edit软件检验克隆所得目标AM菌种同源性,发现17个菌种均为同一菌株,故选择G1为代表,与该样本下AMF孢子序列(GA、GB)一同构建系统发生演化树(图4),分析表明,目标菌种样品G1、GA和GB与Glomus versiforme(Y17651.1)聚为一支,说明其亲缘关系与该属较近,置信度可达98%,推测高山栎能够和与Glomus versiforme同源性较高的AMF形成共生关系。且其与林下菌塘孢子类似,二者均未能鉴定到种。说明能够与香格里拉地区高山栎根系共存的AMF极可能为球囊霉属和类球囊霉属,或与其并列的某一新属真菌。

      表 4  香格里拉地区高山栎根系AMF 克隆与其土壤中AMF孢子的对比结果

      Table 4.  Comparison of AMF clones in roots of Quercus alpine and AMF spores in soil in Shangri-La area

      树种
      species
      采集地
      collected location
      孢子/菌株号
      Strains No.
      GenBank中相近菌株
      Nearest type strain
      GenBank登录号
      Accession No.
      相似度
      Identity/%

      Family

      Genus
      (乔木型)高山栎
      Quercus semicarpifolia
      (not identified)
      云南香格里拉奔子栏镇 GA 球囊霉科
      Glomeraceae
      Glomus sp. VTX00301 KC579428 98.1
      GB Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      (乔木型)高山栎
      Quercus semicarpifolia
      (not identified)
      云南香格里拉奔子栏镇 G1 球囊霉科
      Glomeraceae
      Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G2 Glomus sp. VTX00113 JX144124 98.9
      G3 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G4 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G5 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G6 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G7 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G9 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G10 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G11 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G12 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G15 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G16 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
      G17 Glomus sp. VTX00113 JX144124 99.0
        注:GA、GB为香格里拉高山栎样点孢子的18rRNA基因扩增结果,与根系克隆结果形成对照。
        Notes: GA、GB was the result of amplification of 18rRNA gene from the spores of Quercus shangrila.

      图  4  云南香格里拉高山栎根际土壤与根系AMF克隆结果基于18SrDNA序列与参考序列构建的系统进化树

      Figure 4.  Phylogenetic tree constructed by 18S rRNA gene sequence and reference sequence of several species of Quercus alpine rizosphere AMF spore and roots AMF clone in shangri-la, YunNan

    • 几种高山栎根系苯胺蓝染色结果表明,100~200倍放大时可见明显的类泡囊和丛枝结构,此类结构在高山栎根系内主要呈圆形或近圆形(图5a5b),部分呈椭圆形,部分泡囊分布密集,并伴随“向无规则方向伸展”的横向菌丝结构,推测其为高山栎根系于AMF共生所形成的泡囊和丛枝。

      图  5  各高山栎根系AMF泡囊、丛枝结构

      Figure 5.  AMF vesicles and arbuscular structure of roots of Quercus alpine

    • 自然界中能够独立生存的生物少之又少,几乎所有生物之间均普遍存在共生关系[23]。AM作为一种重要的功能型土壤微生物,其与宿主植物间形成的共生体系能够使宿主植物在群落构成,及其对外界生境在生态适应性层面产生深远影响[5,25]。调查野生生境中的AMF不仅能够扩充AMF菌种资源库,有利于发掘AMF在不同宿主植物根系下的群落构成及多样性,且在探究其对于生态系统平衡稳定的可持续发展层面具重要意义[21,26]

      横断山脉一直以来是生物多样性研究的热点地区,不少学者研究认为四千万至五千万年前印度次大陆与欧亚板块碰撞导致的青藏高原隆起,随后该地区可能成为东亚北温带植物的避难所[27-29]。杨钦周[30]认为,横断山脉纵向深切及垂直气候带的明显分布促使硬叶栎类古老栎群的残遗保留和新生类群的分化形成。因此,选择古老的高山栎组植物对其根系潜在的AMF进行研究,从演化发育的角度能够更有助于理解并揭示该地区AMF的起源、营养类型、生活方式及分类问题。

      本研究利用湿筛沉淀法从形态学和分子生物学结合的视角证实高山栎林下菌塘中存在AMF真菌孢子,这与杨淑娇[13]等基于磷脂脂肪酸(RLFP)方法研究香格里拉高山栎林下菌塘微生物的结果一致,验证了AMF在野生条件下能够广泛存在于横断山脉亚高山地区高山栎林下的假设。西藏、四川等地各土壤样本中的孢子18S rRNA gene分子证据表明所有孢子均与类球囊霉属Paraglomus的亲缘关系较为接近,通过将各孢子的形态学特征与已证实或发表的孢子形态对比发现,其在颜色、质地、孢壁层数和Melzer’s染液反应效果等方面均与目前已知的巴西类球囊霉、隐类球囊霉及其他几种该属下发表的新种具有明显差异,故认为该地区高山栎林下AMF很有可能为类球囊霉属下的未知种。由于其所处地理位置植被分布的古老与独特性,结合18Sr RNA gene序列相似度比对分析认为,其或在漫长演化进程中在Glomeraceae和Paraglomeraceae科便已出现分化。基于系统发育树(图3)对横断山北部西藏四川等地区孢子的演化进行推测,GSL2-14的演化介于ParaglomusArcheaspora 之间而GSL1-001、2-008、3-007、4-003等则独立分为一支,与前者呈并列关系,这与前人基于真菌分类学为“科”级别将ParaglomusArcheasporaGlomus 中分离出去的分类学定位相吻合[31]

    • 由于目前AMF分子研究技术仍旧有一定的局限性,即缺乏一套通用的既能扩增所有AM家族,又能排除非AM真菌的引物[32]。因此,为保证克隆质量,选择AML1和AML2作为引物扩增高山栎根系(样本GSL1-a,GSL4-a,G)AMF的18s rRNA基因,发现与四川、西藏等地高山栎克隆菌株相似度较高的AMF均为类球囊霉属Paraglomus,与香格里拉地区高山栎克隆菌株相似度较高的AMF则均为球囊霉属Glomus。系统发育树构建结果表明Glomus versiforme与后者AMF同源性极高(图5),西藏、四川与香格里拉等地高山栎根系AMF结果存在一定差异这种现象出现的原因可能是AMF在长期演化过程中随地域环境变化(从西藏、四川到云南)和不同高山栎种(表1)而逐渐发生分化。同时,本研究克隆结果与张中峰[14]等人将将摩西球囊霉和根内球囊霉接种至青冈栎幼苗的结果类似,说明栎属植物在非人为干扰的野生环境下根系也存在AMF。第二,PCR扩增过程中由于DNA模板中存在残留的酚类及腐殖酸等,此类物质难以去除并会对DNA扩增造成一定影响[33]。引物不同,扩增过程中的靶向序列碱基对存在差异,并且扩增时碱基错配的概率也可能呈倍放大,从而造成序列比对时发生单孢提取与分子克隆出现结果上的差异。此外,高山栎根系、土壤样本均分别仅有一种AMF出现,可能提示不同高山栎同时仅与一种AMF在内外根际范围产生联系。有研究表明,碳源和植物内源激素能够对AM产孢能力产生重要影响,2者条件丰富的情况下孢子萌发率较高[34-35]。同理,高山栎生长在半阳坡地区,当地气候、海拔及水热条件使得土壤生境中的C源及高山栎宿主植物内源激素发生变化,进而一定程度干扰AMF产孢,,而ParaglomusGlomus在高山栎根际微生物的生态位竞争过程中占据了相对优势地位,以此来确保自身所需碳源的充分供给。

      综合横断山脉亚高山带几种高山栎林下菌塘AMF孢子调查及其根际AMF的克隆结果发现,高山栎组植物作为典型的被子植物,在与外生菌根真菌发生共生现象的同时,极有可能在自然环境中保留了与AMF存在共生的现象。在喜马拉雅造山运动后[30],横断山区长时间与外界环境隔离,土壤微生物在漫长的演化进程中由于地理环境的相对封闭而发生分化,最终形成了现有存在的AMF孢子,而该类孢子随区域(从西藏、川西到云南)变化显示出一定的演化差异,具体体现在其形态及分子学方面的不同。因此在系统发育进化关系的构树结果中,该类孢子以单独汇聚为一支呈现。

    • 本研究利用形态学与分子生物学的手段证明,自然条件下横断山脉亚高山地区高山栎林下菌塘普遍存在AMF,利用分子克隆手段发现AMF可分布于高山栎植物根系,且发现西藏、四川等地该类孢子在形态上与已知AMF属种存在较大差异,极有可能为Paraglomus属下的新种。同时,云南香格里拉地区高山栎根系AM与Glomus属更接近,说明AM在长期演化过程中随地域迁移出现分化。本研究结果为揭示AMF对横断山脉亚高山带高山栎生态适应性机制的影响提供新的证据,为进一步了解横断山脉亚高山带高山栎林下AMF的形成与演化提供理论参考。

参考文献 (35)

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