• 中国中文核心期刊
  • 中国科学引文数据库(CSCD)核心库来源期刊
  • 中国科技论文统计源期刊(CJCR)
  • 第二届国家期刊奖提名奖

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

白桦BpAMT基因家族鉴定及表达模式分析

杨海昕 刘晓莹 詹亚光 范桂枝

引用本文:
Citation:

白桦BpAMT基因家族鉴定及表达模式分析

    作者简介: 杨海昕,硕士研究生,研究方向:细胞生物学;E-mail:yhxshana@163.com.
    通讯作者: 范桂枝, gzf325@126.com
  • 中图分类号: S718

Genome-wide Identification and Expression Analysis of BpAMT Gene Family in Betula platyphylla

    Corresponding author: Fan Gui-zhi, gzf325@126.com
  • CLC number: S718

  • 摘要: 目的 鉴定白桦AMT基因家族成员,分析AMT基因的表达模式。 方法 本研究利用生物信息学方法鉴定了该家族成员并通过实时荧光定量技术分析其基因表达模式。 结果 从白桦基因组中鉴定了9个AMT家族成员,并将其分为AMT1AMT2两个亚家族,分别命名为BpAMT1.1~1.4BpAMT2.1~2.5;BpAMTs氨基酸残基数为384~522个,等电点为4.61~8.16,均定位于质膜与细胞器膜上;BpAMT基因不均匀的分布在5条染色体上,且成员间存在串联重复现象。BpAMT基因的表达具有组织部位特异性,呈现叶>根>茎趋势;同时发现,硝酸钾、氯化铵、茉莉酸甲酯、赤霉素、脱落酸、氯化镉、干旱、4 ℃和日变化等均可以影响BpAMT基因表达,且不同处理下家族成员的响应程度存在差异。 结论 从白桦中鉴定9个BpAMT基因,聚类为两个亚家族,在调节氮素吸收转运、响应激素信号及非生物胁迫中发挥不同的作用,该研究结果为深入解析BpAMT基因在白桦生长发育和抵抗逆境中的功能奠定基础。
  • 图 1  白桦与部分植物AMT蛋白系统进化树

    Figure 1.  Phylogenetic evolution of AMT proteins from some plants and B.platyphylla.

    图 2  BpAMT基因结构与保守基序分析

    Figure 2.  Conserved motif and gene structure analyses of BpAMT genes

    图 3  BpAMT启动子中的顺式作用元件分布

    Figure 3.  Distribution of cis-elements in BpAMT promoter regions

    图 4  白桦叶、茎和根中BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

    Figure 4.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR in leaves, stems and roots

    图 5  不同氮素条件处理下的BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

    Figure 5.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under different nitrogen treatment

    图 6  BpAMT基因日变化表达的qRT-PCR分析

    Figure 6.  Expression analysis of BpAMT daily variation by qRT-PCR

    图 7  激素处理下BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

    Figure 7.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under hormone treatment

    图 8  非生物胁迫下BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

    Figure 8.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under abiotic stress

    表 1  所使用的引物

    Table 1.  Primers used in this study

    基因名称qPCR-F(5’→3’)qPCR-R(5’→3’)
    BpAMT1.1CACAGAACGCCCTACCATAAAGGGTCGATGGTGGGAAATAAT
    BpAMT1.2CCGACCCGACAATCTCTTATTCCTATTCTTGGGCCCTCTATG
    BpAMT1.3GTTTGGCTGGTACGGATTCAGCACTCCATTGGCCGTAATA
    BpAMT1.4ACTGCGGTTACGACTTCATTAGGCAAACATCCAAAGCATCCC
    BpAMT2.1CCGAAGAGCCTTGAGAATAGAGGCGTTGTCGCCTTTGTTTAG
    BpAMT2.2CGACGAATTCCCACCTAACAGGTGAAAGGATCTCCACCATTA
    BpAMT2.3ACAGATTGTAGGCGGCTTATTCCTCATCCGACATGCGTAAA
    BpAMT2.4AGAGAGATGCAGACCGAAATGCCTTGCACAACTCCAAATGAC
    BpAMT2.5GCCATTCTCAACACCCATCTCCTGGACTGCACCAATTACA
    BpTUTCAACCGCCTTGTCTCTCAGGTGGCTCGAATGCACTGTTGG
    下载: 导出CSV

    表 2  BpAMT基因家族特征分析

    Table 2.  Characteristics analysis of BpAMT family genes

    基因名称
    Gene name
    氨基酸数目
    AA
    分子量/kD
    Molecular weight/ kD
    等电点
    PI
    脂肪系数
    Aliphatic index
    亲水系数
    GRAVY
    亚细胞定位预测
    Subcellular localization prediction
    染色体定位
    Gene localization
    BpAMT1.149953.606.5989.820.405质膜、细胞质Chrom08
    BpAMT1.250753.796.4487.850.396叶绿体Chrom05
    BpAMT1.350253.896.1791.810.414质膜、内质网Chrom03
    BpAMT1.438441.644.6197.530.517质膜、叶绿体Chrom13
    BpAMT2.148652.158.16101.980.500叶绿体Chrom14
    BpAMT2.245448.966.65101.890.534叶绿体、细胞质Chrom14
    BpAMT2.348052.116.30102.420.486叶绿体Chrom03
    BpAMT2.452257.464.7698.640.263质膜、叶绿体Chrom05
    BpAMT2.547151.427.6799.830.435质膜、细胞质Chrom05
    下载: 导出CSV
  • [1] 张 楠. 干旱及外施氮素对长春花生长及次生代谢的影响[D]. 重庆: 西南大学, 2012.

    [2] 王新磊, 吕新芳. 氮代谢参与植物逆境抵抗的作用机理研究进展[J]. 广西植物, 2020, 40(4):583-591. doi: 10.11931/guihaia.gxzw201901007

    [3] 李 静, 张冰玉, 苏晓华, 等. 植物中的铵根及硝酸根转运蛋白研究进展[J]. 南京林业大学学报:自然科学版, 2012, 36(4):137-143.

    [4] 吕新芳, 于 培, 邓文浩, 等. 大叶藻基因组铵根转运蛋白AMT的生物信息学特征[J]. 基因组学与应用生物学, 2018, 37(10):4478-4485.

    [5] 丛 郁, 杨顺瑛, 宋志忠, 等. 杜梨铵转运蛋白基因的克隆表达及在梨属植物中的SNP分析[J]. 西北植物学报, 2011, 31(10):1942-1950.

    [6]

    Hao DL, Zhou JY, Yang SY, et al. Function and Regulation of Ammonium Transporters in Plants[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(10): 35-57.
    [7]

    Zhao X P, Ye X Z, Shi W M. Expression of OsAMT1 ( 1.1-1.3 ) in rice varieties differing in nitrogen accumulation[J]. Russian Journal of Plant Physiology, 2014, 61(5): 750-756.
    [8]

    Simon-Rosin U, Wood C, Udvardi M K. Molecular and cellular characterisation of LjAMT2;1, an ammonium transporter from the model legume Lotus japonicus[J]. Plant Molecular Biology, 2003, 51(1): 99-108. doi: 10.1023/A:1020710222298
    [9]

    Gemma C, Miguel C, Eduardo P M, et al. Ammonium transport and CitAMT1 expression are regulated by N in Citrus plants[J]. Planta, 2009, 229(2): 331-342. doi: 10.1007/s00425-008-0833-y
    [10]

    Sun Y C, Sheng S, Fan T F, et al. Molecular identification and functional characterization of GhAMT1.3 in ammonium transport with a high affinity from cotton (Gossypium hirsutum L.)[J]. Physiologia Plantarum, 2019, 167(2): 217-231. doi: 10.1111/ppl.12882
    [11]

    Gazzarrini, Lejay, Gojon, et al. Three functional transporters for constitutive, diurnally regulated, and starvation-induced uptake of ammonium into Arabidopsis roots[J]. The Plant cell, 1999, 11(5): 937-947. doi: 10.1105/tpc.11.5.937
    [12]

    Walters M B, Willis J L, Gottschalk K W. Seedling growth responses to light and mineral N form are predicted by species ecologies and can help explain tree diversity[J]. NRC Research Press, 2014, 44(11): 1356-1368.
    [13] 马学发, 孙志虎, 刘 彤, 等. 不同形态氮素比例对白桦幼苗生长影响的研究[J]. 森林工程, 2017, 33(2):1-4. doi: 10.3969/j.issn.1006-8023.2017.02.002

    [14] 李海霞, 张妍妍, 白 卉, 等. 供氮水平对白桦幼苗生物量、碳氮含量与储量的影响[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(22):156-159.

    [15]

    Chen S, Wang Y C, Yu L L, et al. Genome sequence and evolution of Betula platyphylla[J]. Horticulture research, 2021, 8(1): 496-507.
    [16] 孟 森. 林木细根氮素吸收动态及氮转运蛋白基因表达[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016.

    [17]

    Yuan L, D Loqué, Kojima S, et al. The organization of high-affinity ammonium uptake in Arabidopsis roots depends on the spatial arrangement and biochemical properties of AMT1-type transporters[J]. QED Publishing. Group, 2007, 18(8): 2636-2652.
    [18] 张 洁, 叶 玲, 郭永正, 等. 谷子AMT基因家族的鉴定及生物信息学分析[J]. 山西农业科学, 2020, 48(3):283-290.

    [19] 李红梅, 韩国民. 玉米自交系B73铵转运蛋白基因家族分析[J]. 安庆师范大学学报:自然科学版, 2018, 24(1):73-77.

    [20]

    Wu Z, Gao X, Zhang N, et al. Genome-wide identification and transcriptional analysis of ammonium transporters in Saccharum[J]. Genomics, 2021, 113(4): 1671-1680. doi: 10.1016/j.ygeno.2021.04.001
    [21] 丛 郁, 杨顺瑛, 宋志忠, 等. 葡萄AMT基因家族生物信息学分析[J]. 中国农学通报, 2011, 27(25):193-199.

    [22] 李 畅. 水稻铵转运蛋白基因OsAMT1.1OsAMT2.1生物学功能分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2016.

    [23]

    Francesca S, Anne M, Anna R, et al. Functional characterization of an ammonium transporter gene from Lotus japonicus[J]. Gene, 2001, 270(1): 237-243.
    [24] 李 赢, 王 爽, 万 华, 等. 大麦AMT1基因家族的全基因组分析[J]. 分子植物育种, 2019, 17(11):3461-3467.

    [25]

    Wu X, Yang H, Qu C, et al. Sequence and expression analysis of the AMT gene family in poplar[J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6(1): 337-346.
    [26]

    Yuan L, Graff L, D Loqué, et al. AtAMT1.4, a pollen-specific high-affinity ammonium transporter of the plasma membrane in Arabidopsis[J]. Plant & Cell Physiology, 2009, 50(1): 13-25.
    [27] 钟丽华. 铵态氮调控菜心氮素吸收的分子机制[D]. 广州: 华南农业大学, 2016.

    [28]

    Guo H, Wang N, Mcdonald T R, et al. MpAMT1.2 from Marchantia polymorpha is a high-affinity, plasma membrane ammonium transporter[J]. Plant & Cell Physiology, 2018, 59(5): 5-13.
    [29]

    Ijato T, Porras-Murillo R, Ganz P, et al. Concentration dependent physiological and transcriptional adaptations of wheat seedlings to ammonium[J]. Physiologia Plantarum, 2021, 171(3): 328-342. doi: 10.1111/ppl.13113
    [30] 李良勇, 崔国贤. 营养胁迫下植物内源激素变化研究进展[J]. 作物研究, 2002(S1):240-244.

    [31]

    Li H, Han J L, Chang Y H, et al. Gene characterization and transcription analysis of two new ammonium transporters in pear rootstock (Pyrus betulaefolia)[J]. Journal of Plant Research, 2016, 129(4): 737-748. doi: 10.1007/s10265-016-0799-y
    [32] 李 真, 袁婷婷, 朱成磊, 等. 毛竹铵态氮转运蛋白的分子特征及基因表达模式[J]. 林业科学, 2021, 57(7):70-79. doi: 10.11707/j.1001-7488.20210708

    [33]

    Huang L, Li M, Zhou K, et al. Uptake and metabolism of ammonium and nitrate in response to drought stress in Malus prunifolia[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2018, 127(1): 185-193.
    [34]

    Duan Y, Zhu X, Shen J, et al. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of the amino acid permease gene family in tea plants (Camellia sinensis)[J]. Genomics, 2020, 112(4): 2866-2874. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.03.026
  • [1] 李煜张进王丽娟卢孟柱 . 杨树PtROP家族基因的表达分析与功能预测. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.001
    [2] 宁坤杨洋马述山李慧玉 . 11条白桦BpSPL家族基因的生物信息学和表达分析. 林业科学研究,
    [3] 张妍刘瀛孙丰宾戴超刘雪梅 . 白桦APETALA2(AP2)转录因子基因的分离及其表达. 林业科学研究,
    [4] 暴帅孔雪邢磊张翠霞官民晓赵丽红刘闯刘雪梅 . 白桦雄花序发育早期和中期差异表达基因的cDNA-AFLP分析. 林业科学研究,
    [5] 孙丰坤周姗李蕾蕾詹亚光曾凡锁 . 白桦BpLHY、BpTOC1与BpGI节律基因生物信息学及表达分析. 林业科学研究,
    [6] 张进李建波刘伯斌陈军卢孟柱 . 杨树CDPK基因家族的表达分析及功能预测. 林业科学研究,
    [7] 孙化雨娄永峰李利超赵韩生高志民 . 毛竹TIPs基因家族成员组织表达模式研究. 林业科学研究,
    [8] 徐向东任逸秋张利李煜王丽娟卢孟柱 . 杨树PIF基因家族成员表达模式研究. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.02.003
    [9] 刘宇徐焕文刘桂丰姜静 . 赤霉素GA4+7处理下白桦无性系生长及差异基因表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.025
    [10] 郭依萍石晶静周美琪于颖王超 . 白桦BpbZIP1基因抗旱耐盐分析及ABRE元件结合鉴定. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2020.05.009
    [11] 王思宁孙化雨李利超杨意宏徐浩赵韩生高志民 . 毛竹PeDWF4基因克隆及表达模式分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.05.007
    [12] 吕中睿刘宏张国昀于立洋罗红梅何彩云 . 沙棘UGT基因家族的全基因组鉴定与表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.06.002
    [13] 宋争李潞滨梁立雄王涛 . 铁皮石斛phytocyanin基因家族全基因组分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.02.014
    [14] 薛丽刘晓霞罗莹吕中睿张建国饶国栋 . 毛果杨MAP65基因家族的扩张与表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.02.010
    [15] 袁婷婷朱成磊杨克彬宋新章高志民 . 毛竹硝态氮转运蛋白家族PeNPFs基因鉴定及其表达特性分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.03.001
    [16] 张恺恺杨立莹丰美静张林凤陈段芬邱德有杨艳芳 . 曼地亚红豆杉NAC基因家族鉴定及表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.02.011
    [17] 胡景涛李彦杰段艳艳阮宇顾欣肖国生 . 桑树HD-Zip I亚家族基因的鉴定及表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.004.014
    [18] 刘聪张洋夏德安陈雪冰魏志刚 . 毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析. 林业科学研究, doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.03.003
    [19] 陈鸿鹏朱凤云吴志华谢耀坚 . 赤桉GAPDH家族基因的克隆及其序列分析. 林业科学研究,
    [20] 刘无双杜明会陶维康杨贞诸葛强 . 杨树生物钟节律基因PtCCA1的克隆及表达模式研究. 林业科学研究,
  • 加载中
图(8) / 表(2)
计量
  • 文章访问数:  181
  • HTML全文浏览量:  117
  • PDF下载量:  7
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-05-11
  • 录用日期:  2022-08-30
  • 网络出版日期:  2022-09-14

白桦BpAMT基因家族鉴定及表达模式分析

    通讯作者: 范桂枝, gzf325@126.com
    作者简介: 杨海昕,硕士研究生,研究方向:细胞生物学;E-mail:yhxshana@163.com
  • 东北林业大学生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 150036

摘要:  目的 鉴定白桦AMT基因家族成员,分析AMT基因的表达模式。 方法 本研究利用生物信息学方法鉴定了该家族成员并通过实时荧光定量技术分析其基因表达模式。 结果 从白桦基因组中鉴定了9个AMT家族成员,并将其分为AMT1AMT2两个亚家族,分别命名为BpAMT1.1~1.4BpAMT2.1~2.5;BpAMTs氨基酸残基数为384~522个,等电点为4.61~8.16,均定位于质膜与细胞器膜上;BpAMT基因不均匀的分布在5条染色体上,且成员间存在串联重复现象。BpAMT基因的表达具有组织部位特异性,呈现叶>根>茎趋势;同时发现,硝酸钾、氯化铵、茉莉酸甲酯、赤霉素、脱落酸、氯化镉、干旱、4 ℃和日变化等均可以影响BpAMT基因表达,且不同处理下家族成员的响应程度存在差异。 结论 从白桦中鉴定9个BpAMT基因,聚类为两个亚家族,在调节氮素吸收转运、响应激素信号及非生物胁迫中发挥不同的作用,该研究结果为深入解析BpAMT基因在白桦生长发育和抵抗逆境中的功能奠定基础。

English Abstract

  • 氮素是植物生长发育过程中所必需的大量营养元素之一,是核酸、蛋白质和叶绿素等大分子物质的重要组成成分[1]。作为植物吸收无机氮素的低耗能方式,铵态氮的吸收利用效率直接影响植物生长发育[2],吸收过量的铵对植物具有毒性,其吸收和代谢受到严格的调控[3]

    铵态氮的吸收主要由铵根转运蛋白(Ammonium transporter,AMT)调控,它将铵根离子从细胞外转运到细胞内进而调节植株地上部分与地下部分的氮素平衡[4]。随着测序技术和生物信息学的发展,研究者发现基因AMT一般包括AMT1AMT2两个亚家族,亚家族成员之间具有相似的高级结构,但其基因结构和成员数量不同[5]。在基因结构上,AMT1家族成员一般不含内含子,多为高亲和转运体[6]AMT2家族成员含多个内含子且位置和大小基本保守,其亲和性没有明确规律;在基因数量上,AMT家族成员一般在6~16个之间。在基因表达上,AMT家族成员在根、茎和叶等的基因表达具有组织部位特异性,同时也受病毒和害虫等生物以及氮素浓度、光照、植物激素和干旱等非生物因素的调控,如水稻(Oryza sativa L.)OsAMT1.3在根系维管束和侧根原基中表达[7],百脉根(Lotus japonicas Regel.)LjAMT2.1主要在根瘤细胞的原生质膜上表达[8],柑橘(Citrus reticulata Blanco.)CitAMT1和棉花(Gossypium hirsutum L.)GhAMT1.3在低氮的条件下表达量大幅度提高[9-10],拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)AtAMT1.1AtAMT1.3的转录水平随日变化周期中光照强度的降低而下降[11]

    在自然状态下,土壤中的氮素受到限制或有效性降低都会限制植株的生长、影响植株对碳同化物质的分配格局以及抵抗胁迫的能力[12]。白桦(Betula platyphylla Suk.)是喜光耐寒的先锋树种,它对土壤适应性强且生长速度较快[13]。研究发现,在一定浓度范围内随着供氮水平的增加,白桦幼苗根系、茎和叶中全氮浓度提高,其中无机氮比有机氮更易于其生物量的积累[14]AMT作为氮代谢的关键基因之一,其家族成员在白桦中的研究还未见报道,尤其是其成员数量及功能还不清楚,有关AMT基因在非生物胁迫条件下表达的研究文献有限。因此本研究以10年生白桦树、2年生白桦盆栽苗及白桦悬浮细胞为试验材料,基于最新公布的白桦基因组序列[15],筛选鉴定BpAMT家族成员,初步解析BpAMT家族成员在不同组织、不同氮素条件、日变化周期以及不同激素和非生物胁迫处理后的表达模式,该研究将为深入探究BpAMT家族成员的功能提供参考依据。

    • 白桦组培苗与悬浮细胞为实验室保存材料,组培苗培养基为WPM培养基附加蔗糖20 g∙L−1与琼脂6.5 g∙L−1,每25~30 d继代一次;悬浮细胞培养基为B5培养基附加蔗糖20 g∙L−1、琼脂8 g∙L−1、水解酪蛋白1 g∙L−1、TDZ 0.6 mg∙L−1、6-BA 0.3 mg∙L−1与2,4-D 0.5 mg∙L−1,每7 d继代一次;10年生白桦树材料采集于东北林业大学主校区丹青楼前白桦林;2年生白桦盆栽苗培养于东北林业大学逸夫教学楼旁。

    • 利用拟南芥AtAMT1.1 (CAA53473)、AtAMT1.2 (AAD54639)、AtAMT1.3 (AAD54638)、AtAMT1.4 (CAB81458)、AtAMT1.5 (NP_189072)和AtAMT2.1 (NP_181363) 6个AMT序列,在白桦基因组数据中进行比对,数据库网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,登录号为PRJNA285437,剔除重复序列后获得BpAMT候选基因,进行保守结构域鉴定,确定BpAMT家族成员并进行编号。通过在线分析软件EXPASY进行理化性质分析;通过在线软件WoLF PSORT进行亚细胞定位预测;使用MEGAX构建系统进化树,构树方法选择NJ法;使用GSDS2.0绘制基因结构,使用在线MEME对白桦目标氨基酸序列进行比对,并对保守区进行分析;通过在线软件MG2C绘制基因在染色体上位置;使用TBtools进行共线性分析;运用SPDEv2.0确定启动子序列,plantcare进行顺式作用元件功能预测,导入TBtools进行可视化。

    • 于2021年7月15日采集2年生白桦盆栽苗的根、茎和叶组织,每次取材进行3次生物学重复,测量不同组织下BpAMT基因表达情况,采用改良的CTAB法提取总RNA,使用Takara公司ScriptTM RT试剂盒合成cDNA。使用 Premier 5.0 设计定量引物(表1),引物由生工生物工程上海股份有限公司合成,以白桦持家基因 BpTU 为内参基因,进行qRT-PCR分析基因表达模式,目的基因的相对表达量用2−△△CT来表示。运用IBM SPSS Statistics 23软件对BpAMT基因表达进行统计及显著性差异分析。

      表 1  所使用的引物

      Table 1.  Primers used in this study

      基因名称qPCR-F(5’→3’)qPCR-R(5’→3’)
      BpAMT1.1CACAGAACGCCCTACCATAAAGGGTCGATGGTGGGAAATAAT
      BpAMT1.2CCGACCCGACAATCTCTTATTCCTATTCTTGGGCCCTCTATG
      BpAMT1.3GTTTGGCTGGTACGGATTCAGCACTCCATTGGCCGTAATA
      BpAMT1.4ACTGCGGTTACGACTTCATTAGGCAAACATCCAAAGCATCCC
      BpAMT2.1CCGAAGAGCCTTGAGAATAGAGGCGTTGTCGCCTTTGTTTAG
      BpAMT2.2CGACGAATTCCCACCTAACAGGTGAAAGGATCTCCACCATTA
      BpAMT2.3ACAGATTGTAGGCGGCTTATTCCTCATCCGACATGCGTAAA
      BpAMT2.4AGAGAGATGCAGACCGAAATGCCTTGCACAACTCCAAATGAC
      BpAMT2.5GCCATTCTCAACACCCATCTCCTGGACTGCACCAATTACA
      BpTUTCAACCGCCTTGTCTCTCAGGTGGCTCGAATGCACTGTTGG
    • 以含不同氮源的B5培养液处理白桦悬浮细胞,设置对照CK组(正常B5培养液),CK-0组(CK组去除NH4NO3试剂)、低浓度单一硝态氮组(CK-0组添加0.1 mmol∙L−1 KNO3试剂)、高浓度单一硝态氮组(CK-0组添加3 mmol∙L−1 KNO3试剂)、低浓度单一铵态氮组(CK-0组添加0.1 mmol∙L−1 NH4Cl试剂)与高浓度单一铵态氮组(CK-0组添加3 mmol∙L−1 NH4Cl试剂)为实验组,分别培养白桦悬浮细胞,每个处理进行3次生物学重复,在1 d后取样测量不同处理下BpAMT基因表达量的变化情况,并进行统计及显著性差异分析。

    • 于2020年8月3—4日1个日周期内,每隔3 h取样一次,共9个时间点采集主校区丹青楼前10年生白桦树叶片,每次取材进行3次生物学重复,对不同时间下BpAMT基因表达量进行统计分析。

    • 选择长势一致的白桦盆栽苗,分别用100 μmol∙L−1茉莉酸甲酯(MeJA)、100 mg∙L−1赤霉素(GA3)和10 μmol∙L−1脱落酸(ABA)处理24 h后取样,每次取材进行3次生物学重复,测量不同激素处理下BpAMT基因表达量的变化情况。

    • 选择长势一致的白桦盆栽苗,分别用50 mmol∙L−1氯化镉(CdCl2)、10% (W/V)PEG6000和4 ℃环境模拟重金属、干旱和低温胁迫,处理24 h后取样,每次取材进行3次生物学重复,测量不同非生物胁迫下BpAMT基因表达量的变化情况。

    • 从白桦基因组中筛选鉴定了9个BpAMT基因,分别编号为BpAMT1.1~1.4BpAMT2.1~2.5表2)。对BpAMT蛋白理化性质分析表明,氨基酸残基数范围为384~522,分子量范围为41.64~57.46 kD,蛋白质等电点范围为4.61~8.16。BpAMT蛋白亲水系数均为正值,均为疏水性蛋白。此外,亚细胞定位结果显示,BpAMT主要定位于膜结构上,多分布在叶绿体、质膜与内质网上,这可能与BpAMT蛋白的跨膜转运功能有关。BpAMT基因成功定位于第3、5、8、13和14条染色体上,其中第5号染色体上分布基因最多,有3个基因,且均分布在染色体下端。第8号和13号染色体上基因分布最少,均有1个基因。BpAMT2.1BpAMT2.2在第14号染色体上的位置接近,并且二者的序列长度和基因结构相似,可能是BpAMT中的串联复制基因。

      表 2  BpAMT基因家族特征分析

      Table 2.  Characteristics analysis of BpAMT family genes

      基因名称
      Gene name
      氨基酸数目
      AA
      分子量/kD
      Molecular weight/ kD
      等电点
      PI
      脂肪系数
      Aliphatic index
      亲水系数
      GRAVY
      亚细胞定位预测
      Subcellular localization prediction
      染色体定位
      Gene localization
      BpAMT1.149953.606.5989.820.405质膜、细胞质Chrom08
      BpAMT1.250753.796.4487.850.396叶绿体Chrom05
      BpAMT1.350253.896.1791.810.414质膜、内质网Chrom03
      BpAMT1.438441.644.6197.530.517质膜、叶绿体Chrom13
      BpAMT2.148652.158.16101.980.500叶绿体Chrom14
      BpAMT2.245448.966.65101.890.534叶绿体、细胞质Chrom14
      BpAMT2.348052.116.30102.420.486叶绿体Chrom03
      BpAMT2.452257.464.7698.640.263质膜、叶绿体Chrom05
      BpAMT2.547151.427.6799.830.435质膜、细胞质Chrom05
    • 图1所示,将白桦BpAMT与拟南芥、柑橘、百脉根、杨树(Populus trichocarpa Torr. & Gray)、茶树(Camellia sinensis L.)和杜梨(Pyrus betulifolia Bunge.)AMT氨基酸序列构建进化树。结果显示,BpAMT家族分为BpAMT1BpAMT2两个进化支,在9个BpAMT基因中,其中4个属于BpAMT1亚家族,5个属于BpAMT2亚家族。其中BpAMT1.4BpAMT1亚家族中其余3名成员亲缘关系较远,与杜梨PbAMT1.3PbAMT1.5及杨树PtrAMT1.6聚类在一起。白桦BpAMT与杨树PtrAMT聚类最多,亲缘关系较近。

      图  1  白桦与部分植物AMT蛋白系统进化树

      Figure 1.  Phylogenetic evolution of AMT proteins from some plants and B.platyphylla.

    • 为了了解BpAMT基因的序列特征,对其基因结构及保守基序进行分析。如图2A所示,BpAMT1.1~1.3均含有一个1个外显子,无内含子;BpAMT1.4含有4个外显子与3个内含子;BpAMT2基因序列包含3~6个外显子与3~5个内含子,且具有未翻译区结构。

      图  2  BpAMT基因结构与保守基序分析

      Figure 2.  Conserved motif and gene structure analyses of BpAMT genes

      BpAMTs保守基序如图2B所示,BpAMT两个亚家族中均存在motif 4、5、6、7、9这5种保守基序。BpAMT2亚家族成员氨基酸序列中含有特定识别基序motif 3,除BpAMT1.4外,BpAMT1亚家族成员氨基酸序列中含有特定识别基序motif 10,motif 7在两个亚家族中都存在,但是位置有很大差异,motif 7在BpAMT1的5’端,而在BpAMT2的中段。BpAMT的保守性较高,同一个亚家族的BpAMT蛋白motif分布较为相似,这些保守motif的存在保证了家族成员在转运铵盐中发挥稳定的作用。

    • 提取BpAMT基因编码区上游2 000 bp的核苷酸序列,根据BpAMT基因家族的性质,去除一般性转录调控元件和功能未知元件,如图3所示,发挥功能的元件主要分为3类:逆境胁迫响应元件、光响应元件及植物激素响应元件,从中选取了10种重要的顺式元件进行可视化。

      图  3  BpAMT启动子中的顺式作用元件分布

      Figure 3.  Distribution of cis-elements in BpAMT promoter regions

      BpAMT1.3外,其余BpAMT启动子区具有1~2个逆境响应元件,包括TC-rich repeats元件、响应干旱胁迫的MYB元件以及响应低温胁迫的LTR元件,说明这些成员与逆境应答密切相关。BpAMT启动子区的光反应元件主要为G-box元件,除BpAMT1.2BpAMT2.5不包含光反应元件外,其余BpAMT启动子区具有1~3个光响应元件,BpAMT2.3启动子区具有参与昼夜节律调控的元件。BpAMT启动子区激素响应元件种类较多,主要有参与脱落酸反应的ARBE元件、响应生长素的TGA-box元件、参与水杨酸反应相关的TCA-motf元件以及响应赤霉素的TATC-box元件,表明BpAMT可能受到各种不同激素的调控。以上结果表明,BpAMT可能与逆境应答、激素信号转导和生长发育过程密切相关。

    • 图4所示,BpAMT家族基因在组培苗和盆栽幼苗根、茎和叶中的表达趋势相同,均呈现叶>根>茎趋势。其中,在盆栽苗和组培苗茎和叶部位BpAMT1.1的表达量最高,分别为153.05和377.41、267.88和253.06;在盆栽苗和组培苗根、茎、叶中BpAMT1.3的表达量均最低,分别为9.35和2.14、1和1、12.18和2.19。

      图  4  白桦叶、茎和根中BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

      Figure 4.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR in leaves, stems and roots

    • 图5所示,BpAMT家族基因在硝态氮和铵态氮处理后的表达趋势不同。在去除培养基中无机氮源(CK0)的条件下,除BpAMT2.3之外的BpAMT表达量均呈上调趋势;在KNO3与NH4Cl处理下,BpAMT1.12.1表达量均呈上调趋势,其余BpAMT在KNO3处理下均呈下调趋势,其余BpAMT1BpAMT2在NH4Cl处理下呈现相反的变化趋势。其中BpAMT2.1表达量在CK0、3 mmol∙L−1 KNO3、0.1mmol∙L−1 NH4Cl与3 mmol∙L−1 NH4Cl处理下均呈上调趋势,表达量分别为对照组的19、58、50和18倍。BpAMT1.31.4的表达量在不同氮素条件下的表达都比较低,这可能与其较大的基因家族有关系,表明家族基因之间存在功能冗余。

      图  5  不同氮素条件处理下的BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

      Figure 5.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under different nitrogen treatment

    • 图6所示,BpAMT1.11.32.12.22.3表达量在3:00—15:00时段呈上升趋势,在18:00—0:00时段呈下降趋势,BpAMT1.42.4 的日变化规律与之相反。不同基因表达量达峰值的时间不同,BpAMT1.11.3表达量在18:00达到峰值,BpAMT2.12.22.3表达量在15:00达到峰值,BpAMT1.4表达量在00:00达到峰值,BpAMT2.4表达量在3:00达到峰值。

      图  6  BpAMT基因日变化表达的qRT-PCR分析

      Figure 6.  Expression analysis of BpAMT daily variation by qRT-PCR

    • 图7所示,BpAMTs在MeJA、GA3和ABA处理下呈现不同的表达特征,在叶、茎和根3个组织部位中呈现相似的表达特征,在根部响应最明显。经MeJA处理后,除BpAMT1.3BpAMT2.1外,其余7个BpAMT的表达量上调,其中BpAMT1.4表达量在根部上调最明显,为对照组的4.18倍,BpAMT2.1表达量在根部下调最明显,为对照组的0.14倍。经ABA处理后,BpAMT1.12.12.22.5的表达量上调,其余5个BpAMT的表达量下调。其中,BpAMT2.1表达量在叶片中上调最明显,为对照组的6.01倍,BpAMT1.3表达量在茎部下调最明显,为对照组的0.18倍。经GA3处理后,BpAMT1.12.22.4的表达量上调,BpAMT2.5的表达量下调,其余5个BpAMT的表达量没有显著变化,其中BpAMT2.2表达量在根部上调最明显,为对照组的6.17倍,BpAMT2.5表达量在叶片下调最明显,为对照组的0.41倍。在MeJA、GA3和ABA处理下,BpAMT1.12.2在叶、茎和根中均呈现上调表达趋势。以上结果表明,BpAMT受多种激素的诱导表达,但对不同激素的响应程度与响应部位存在差异。

      图  7  激素处理下BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

      Figure 7.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under hormone treatment

    • 图8所示,BpAMT在低温、干旱和氯化镉处理下呈现不同的表达特征,在叶、茎和根3个组织部位中呈现相似的表达特征,在茎部响应最明显。经低温处理后,BpAMT1.21.42.22.42.5的表达量上调,BpAMT1.12.3的表达量下调,其中BpAMT2.4在茎部上调最明显,为对照组的12.25倍,BpAMT1.1在根中下调最明显,为对照组0.13倍。经干旱处理后,BpAMT1.11.42.12.3的表达量上调,BpAMT1.21.32.22.5的表达量下调,其中BpAMT1.4在茎部上调最明显,为对照组的9.97倍,BpAMT2.5在茎部下调最明显,为对照组的0.13倍。经氯化镉处理后,BpAMT2.12.4的表达量上调,BpAMT2.22.3的表达量没有显著变化,其余BpAMT的表达量下调,其中BpAMT2.4的表达量在茎中上调最明显,为对照组的9.74倍,BpAMT1.3在茎中下调最明显,为对照组的0.09倍。在低温、干旱和氯化镉处理下,BpAMT2.1在叶、茎和根3个组织部位中均呈现上调表达趋势。以上结果表明,BpAMTs在不同非生物胁迫中的表达情况存在差异,推测在逆境中发挥不同的作用。

      图  8  非生物胁迫下BpAMT基因表达的qRT-PCR分析

      Figure 8.  Expression analysis of BpAMT by qRT-PCR under abiotic stress

    • 铵是植物根系吸收的经济有效的一种氮素形式,AMT介导的高亲和力铵跨质膜运输是植物根系吸收铵的主要途径[16]。近年来有关植物吸收和转运铵态氮的分子机制有了较大突破,特别是随着高通量测序技术的发展,拟南芥、谷子(Setaria italica Beauv.)、玉米(Zea mays L.)及甘蔗(Saccharum officinarum L.)等植物的AMT遗传信息逐步被发掘[17-20]

      白桦基因组数据的公布为系统解析BpAMT家族成员提供了可能。因此,本论文基于白桦基因组和本研究室获得的转录组数据,共筛选了9个具有完整Ammonium-transp superfamily结构域的BpAMTs。与已报道的植物AMT家族分为 AMT1AMT2 两个亚家族一致,9个BpAMTs也分为两类,其中4个属于BpAMT1亚家族,5个属于BpAMT2亚家族。

      BpAMT2亚家族成员的氨基酸序列中均具有特定识别基序motif 3,保守基序的数量和位置相同,其基因结构中外显子数目在3~6个之间,这与葡萄(Vitis vinifera L.)、水稻与百脉根等植物AMT2亚家族成员的报道一致[21-23]BpAMT1亚家族成员BpAMT1.1~1.3的氨基酸序列中保守基序的数量和位置相同,均含有特定识别基序motif 10,基因结构中不含内含子,这也与大麦(Hordeum vulgare L.)和杨树等植物中大多数AMT1基因不含内含子的报道一致[24-25]BpAMT1.4基因结构中包含3个内含子,其氨基酸序列中缺失BpAMT1亚家族特定识别序列motif10,但其保守基序的数目和位置都与BpAMT1.1~1.3相同;进化关系分析发现,BpAMT1.4BpAMT1.1~1.3定位在同一分支上,故将其归类于BpAMT1亚家族。BpAMT1.4氨基酸序列中缺失motif 10可能与其结构演化过程中内含子的获得有关,同时推测其可能参与特殊的铵转运机制。

      基因家族的进化过程中会出现基因复制、扩展、丢失和漂移等事件,BpAMTs也出现了基因片段复制事件,且不均匀分布于5条染色体上。由此推测,为了适应不同生境下的氮素种类及供给量,白桦在进化过程中可能通过扩展BpAMT基因家族来适应环境。启动子顺式作用元件分析显示 BpAMTs含有多个胁迫响应元件、激素响应以及光反应元件等,表明BpAMTs基因潜在的重要功能。同一亚家族内成员含有的元件类型和数量也各不相同,表明BpAMTs的表达调控方式具有一定的特异性。

      植物AMT基因的表达具有组织特异性,如拟南芥AtAMT1.1在根中表达最高,AtAMT2.1在茎中表达最高,AtAMT1.4在花粉中专一性表达[26]。同样,在两种白桦材料中对BpAMTs的组织部位表达模式进行了验证,不同组织部位的BpAMTs表达趋势均为叶>根>茎,由此推测,BpAMTs基因表达主要受叶片中系统氮态信号以及根系中局部铵态信号的控制。在响应光照的日变化中,菜心BcAMTs基因表达量在6:00—12:00为上升趋势,15:00—00:00呈下降趋势,在中午12:00时表达量达到峰值[27]。同样,BpAMT1.11.3BpAMT2.12.3的在同一日周期内的表达量也有相似的趋势,而BpAMT1.4BpAMT2.4日变化趋势与之相反,表明在光照逐渐减少的情况下,白桦通过提高BpAMT1.4BpAMT2.4基因的表达,维持植物夜间的铵根离子吸收,由此可见BpAMTs表达受日变化光周期的影响,而铵根离子吸收速率是否具有日变化趋势还需进一步验证。

      一般情况下,缺氮或低氮条件对铵根离子的吸收有促进作用,不同的氮源对铵根离子的吸收也有影响,硝酸根作为氮代谢过程中氮元素吸收同化的源头,可以在酶促反应下合成铵根离子,作为铵根离子转运基因,BpAMTs表达的规律性有待明确。BpAMTs在不同氮素条件处理下呈现不同的表达特征。在缺氮条件下,除BpAMT2.3外,其余BpAMTs表达量均上升,这与柑橘[9]、地钱(Marchantia polymorpha L.)[28]与小麦[29]在缺氮后AMT基因表达趋势相似;在高浓度单一硝态氮为氮源的条件下,BpAMT2.11.12.5表达量显著提高,推测这可能与高浓度单一硝态氮对悬浮细胞产生了胁迫有关系,使之趋向于吸收耗能更低的铵根离子。

      研究表明,氮素形态影响植物体内部分激素的合成和运输,同时通过外施激素也可以增加植物的氮素利用率[30]。外源激素是影响AMT 基因表达的重要因素,MeJA 和ABA处理杜梨后,发现PbAMT1.5 的表达显著上调[31];GA3和NAA处理毛竹后,多个PeAMTs显著上调,PeAMT4显著下调[32]BpAMT对激素的响应存在差异,BpAMT1.12.12.22.42.5对MeJA、GA3和ABA处理均具有敏感性,其中BpAMT1.12.2在叶、茎和根中均呈现上调表达趋势,且在根部响应最强烈,推测白桦根部铵根离子的吸收过程与激素互相作用,共同调节白桦的根系发育。

      非生物胁迫是影响植物铵根吸收转运的重要因素。干旱胁迫下楸子(Malus prunifolia Borkh.)MpAMT1.24.2的表达显著上调[33];茶树在盐胁迫下CsAMT1.3b3.1表达显著下调,CsAMT1.1a2.1a3.3表达显著上调[34]BpAMT对非生物胁迫的响应存在差异,BpAMT1.11.22.12.5 对低温、干旱和镉胁迫处理均具有敏感性,其中BpAMT2.1在叶、茎和根3个组织部位中均呈现上调表达趋势,且在茎部响应最强烈,可能由于胁迫处理改变了不同组织部位对铵态氮的利用度,打破了铵根离子在根与茎之间运输过程的动态平衡,导致BpAMT在茎部的表达改变。镉胁迫下的下调基因数量最多,可能因为NH4 + 与Cd2 + 同为阳离子,白桦通过抑制铵根离子的吸收降低植物对Cd2 + 的吸收,对植物本身起保护作用,由此认为BpAMT基因可能通过在逆境环境中调节铵态氮的吸收与转运,从而保证氮代谢的稳定性。以上结果为白桦氮素吸收代谢与激素以及非生物逆境之间的互作研究提供了参考思路。

    • 从白桦基因组数据库中鉴定了9个BpAMT家族成员,定位到白桦5条染色体上,根据进化关系和结构特征分为2个亚家族。BpAMT基因表达具有组织部位特异性,受日变化、不同氮素、激素和非生物胁迫等影响,其中BpAMT1.1BpAMT2.1响应较强。以上结果为BpAMT家族成员的功能研究提供了有价值的信息和可靠的候选基因。

参考文献 (34)

目录

    /

    返回文章
    返回