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杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.)是我国南方重要的速生用材树种,凭借出材率高、材质优良、适应性广和经济效益高等优点,在我国南方地区广泛种植。然而,随着杉木纯林面积的不断扩大,多代连栽等不合理的营林措施导致了土壤中养分含量的减少,从而引起地力衰退等问题。杉木连栽是指原有林分皆伐后用实生苗在原处进行重新造林的过程。连栽导致林地生产力逐代降低,土壤微生物群落结构多样性下降[1],土壤酶活性[2]和氮、磷等元素有效性下降。当前研究普遍认为,植物对不同形态氮素的利用具有一定的偏好性。张彦东等[3]研究发现,多数针叶树种偏好吸收 NH4+-N ;李常诚等[4]利用 15N 同位素示踪法研究不同林龄杉木的养分吸收偏好时也发现,3 种林龄的杉木均表现出对 NH4+-N 的较强吸收偏好;但也有研究表明,杉木对 NO3−-N 的偏好性大于 NH4+-N[5-6]。植物吸收和利用氮素的过程很复杂,即使是在同一生态系统,环境条件相同,同一植物亦会在林龄、栽植代数不同时采用不同的氮素获取策略。目前部分学者已从多个角度探究了杉木连栽对土壤硝态氮含量的影响,但尚未达成一致结论。刘先等[7]发现,杉木人工林硝态氮含量并未随着连栽代数增加而减少;而陈郑洪等[8]研究表明,随着连栽代数的增加,连栽杉木人工林土壤硝态氮含量呈现降低趋势。目前关于杉木连栽林硝态氮相关研究的不足,限制了人们对硝态氮转化过程随多代连栽变化的认知。
微生物活动与土壤氮循环密切相关,可以说氮循环的本质就是微生物驱动的氮素转化、利用及循环的过程[9],需要植物、真菌、细菌和古菌等共同参与。土壤氮素在微生物作用下最终成为植物可直接吸收利用的有效氮,其中,硝化作用是氮循环的核心环节,此过程能够提高土壤氮的有效性。氨氧化过程被认为是硝化作用的限速步骤,主要由氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)完成,它们能将氨(NH3)氧化成亚硝态氮(NO2−),进而推动硝化反应的进程。氨氧化古菌是酸性土壤氨氧化反应的主要催化者[10],如贺纪正等[11]对长期施肥处理引起的土壤性质变化研究中发现,酸性条件下氨氧化古菌的丰度和群落组成变化比氨氧化细菌更明显。Lu 等[12]通过稳定性同位素示踪实验证明,氨氧化古菌类群主导了森林土壤氨氧化过程。然而,以往研究多聚焦于不同生态环境、条件处理下氨氧化古菌群落结构和物种丰度变化以及氨氧化古菌在人工给水和污水处理系统中群落分布和所起作用,关于自然条件下多代连栽杉木纯林土壤中的氨氧化古菌群落组成和有效氮素形态转变规律的研究较为罕见。
土壤酶是氮循环过程中关键的催化剂,对土壤物化性质的改变极其敏感。前人研究表明,不同栽植代数会改变杉木林的氮循环特征[13]。土壤微生物是土壤氮循环过程的主要驱动力,直接调节土壤有机质和氮素养分的供给和转化。土壤酶能够表征微生物活性,不同的土壤酶参与土壤氮循环,将土壤中不同形态 N 分解为有效 N 供植物吸收[14]。目前对杉木人工林酶活性的研究主要关注脲酶、过氧化氢酶等,且大部分结果表明,随杉木连栽代数增加酶活性逐代下降[15-16],但对于参与土壤氮循环过程,尤其是参与土壤硝化、氨氧化过程的酶如氨单加氧酶(AMO)则较少涉及。因此,研究不同栽植代数的杉木人工林土壤氮循环过程中酶活性变化及其影响因子,对提高土壤N素利用率和人工林生态恢复管理有重要意义。
鉴于此,本研究选择不同栽植代数的杉木人工林土壤为研究对象,利用高通量测序技术研究杉木连栽对土壤有效态氮形态特征的影响,通过分析连栽杉木土壤中的氨氧化古菌群落组成及多样性,以揭示氨氧化古菌群落结构和多样性随连栽代数演变的规律及有效氮素与氨氧化古菌群落的相关性,最终确定影响连栽杉木林土壤氮有效性的因素,旨在为我国杉木人工林的可持续经营提供实践指导。
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研究林分位于福建省南平市王台镇(118° ~ 119° E,26°40′ ~ 27°20′ N),属武夷山系南伸支脉,是我国杉木中心产区之一。平均海拔200 m左右,地处亚热带季风气候区,年均气温19.3 ℃,相对湿度83%,年均降水量1 700 mm,主要集中在春夏季。土壤是由燕山晚期白云母化中细粒花岗岩发育的山地暗红壤,土层厚度在100 cm以上。该地栽植有4个不同代数的杉木人工林,其中,1代林林龄18 a;2代林林龄18 a;3代林林龄19 a;4代林林龄16 a。该林分乔木层主要以杉木为主,1 代林土地植被覆盖度较高,灌木层植物主要有山苍子(Litsea cubeba (Lour.) Pers.)、毛冬青(Ilex pubescens Hook. et Arn.)、盐肤木(Rhus chinensis Mill.)等;草本层植物主要有芒萁(Dicranopterisdichotoma (Thunb. ) Berhn.)、乌毛蕨(Blechnum orientale Linn.)、狗脊(Cibotium barometz (L.) J.Sm.)、观音莲座蕨(Angiopteris fokiensis Hieron)等。2 代林灌木层植物主要有粗叶榕(Ficus hirta Vahl)、草珊瑚(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)等,草本层植物主要有狗脊(Cibotium barometz (L.) J.Sm.)、双盖蕨(Diplazium donianum (Mett.) Tard.-Blot)、扇叶铁线蕨(Adiantum flabellulatum L. Sp.)等。3 代与 4 代植被丰富度则显著下降,灌木层植物主要有粗叶榕(Ficus hirta Vahl)、毛冬青(Ilex pubescens Hook. et Arn.)等;草本层植物主要有芒萁(Dicranopterisdichotoma (Thunb. ) Berhn.)、狗脊(Cibotium barometz (L.) J.Sm.)等。通过以空间代时间的方法,于2021年10月,选择立地条件相似、林龄为18 a左右的中林龄、代数分别为1~4代(G1 ~ G4)的杉木人工林进行采样,样地基本理化性质见表1。每片林地选择3个坡度在30°~40°,海拔、坡向相近的土坡。每个土坡上划分20 m × 20 m的采样地,沿着S型采集6份样品,去除枯枝落叶后,用土钻钻取深度为20 cm的表层土壤,并将6份样品等量混合为一份。每片人工林采集3份样品,每份土壤过20目筛后放入4 ℃冰箱内冷藏保存,一部分用于土壤理化性质测定,另一部分用于氨氧化古菌群落结构与多样性测定。
代数 Planting generation 1代 First generation 2代 Second generation 3代 Third generation 4代 Fourth generation pH 4.66 ± 0.02 a 4.73 ± 0.03 ab 4.77 ± 0.03 ab 4.87 ± 0.11 b 碳氮比 C/N 13.88 ± 0.85 a 13.31 ± 0.31 a 14.00 ± 0.62 a 13.15 ± 0.14 a 全碳 TC/ (g·kg−1) 19.32 ± 0.81 b 18.37 ± 0.23 b 18.89 ± 1.67 b 30.30 ± 0.13 a 全氮 TN/ (g·kg−1) 1.39 ± 0.05 b 1.38 ± 0.01 b 1.35 ± 0.08 b 2.31 ± 0.02 a 可溶性有机碳 DOC/(mg·kg−1) 178.00 ± 7.51 ab 205.57 ± 10.78 a 178.07 ± 6.00 ab 157.33 ± 6.32 b 总可溶性氮 TSN/(mg·kg−1) 13.75 ± 1.41 bc 17.41 ± 1.63 ab 19.55 ± 0.48 a 12.68 ± 1.02 c 可溶性有机氮 SON/(mg·kg−1) 2.61 ± 1.21 ab 4.88 ± 0.79 ab 6.75 ± 1.86 a 1.60 ± 0.91 b 注:表中数值为平均值 ± 标准误,同行数据后的不同小写字母表示同一形态氮素含量在不同代数之间差异显著 (P<0.05);下同
Notes: The data in the table is the mean ± standard error. Different lowercase letters after the same column of data indicate that the nitrogen content of the same form is significantly different between different stand ages (P<0.05), the same belowTable 1. Soil physical and chemical properties of the sample plot
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土壤pH值采用pH计(ST3100-F Ohaus, New Jersey,美国)测定:称取10 g风干土倒入50 mL烧杯,加入25 mL水(去CO2纯水,水土比2.5:1),混合搅拌静置30 min后用pH计测定;土壤硝态氮(NO3−-N)、铵态氮(NH4+-N)含量使用全自动连续流动分析仪(AA3 SEAL Analytical, 荷兰)测定,土壤样品经过2 mol·L−1 KCl溶液浸提后上机测定;土壤微生物量氮(MBN)含量采用氯仿熏蒸浸提法[17]测定,未熏蒸土样加入120 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4溶液(水土比4:1)浸提,直接震荡过滤,熏蒸土样在真空干燥器中加入氯仿熏蒸,培养24 h后浸提,过滤膜后上总有机碳分析(TOC-LCPH, Shimadzu, Japan)测定,直接得出未熏蒸样品的总可溶性氮(TSN)含量,计算熏蒸与未熏蒸样品的总可溶性氮(TSN)含量差值,得到土壤微生物量氮(MBN)含量,转换系数为0.54。
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土壤酶活性使用试剂盒进行测定,每个处理设置3个重复。酶活性均使用酶标仪(SpectraMax M4,美国)测定。
土壤氨单加氧酶(S-AMO):测定原理为氨单加氧酶与HRP标记的抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,再经洗涤、显色、酸化,用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值,即可反应样品氨单加氧酶活性[18]。
土壤脲酶(S-UE):测定原理为脲酶水解尿素所产生的NH3在强碱性介质中能够与次氯酸钠和苯酚反应,生成水溶性蓝色染料靛酚蓝,在630 nm处具有特征吸收峰,通过吸光值的变化可表征土壤脲酶的活性[19]。
土壤过氧化氢酶(S-CAT):测定原理为H2O2在 240 nm处具有特征吸收峰,土壤过氧化氢酶分解H2O2 使反应溶液在240 nm处吸光值随反应时间而下降,通过测定吸光值的变化率即可表征土壤过氧化氢酶的活性[20]。
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完成基因组 DNA 抽提后,利用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA,采用引物Arch-amoAF(GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC)、Arch-amoAR(GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG)[21]对土壤中amoA(26-417) 区域进行 PCR 扩增,PCR 产物使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小,并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化,随后完成Miseq文库构建。将符合要求的测序文库在Illumina Miseq平台上进行双末端测序(Paried-End),对基因进行物种注释后得到各分类水平上的氨氧化古菌的相对丰度[22]。
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数据经过正态分布检验,通过SPSS 25.0软件对组间土壤氮素含量和氨氧化古菌Alpha多样性指数分别进行单因素方差分析,以0.05的显著性水平为样品均值比较的最小显著差异检验。土壤氮素含量、酶活性及氨氧化古菌群落相对丰度冗余分析(RDA)使用Canoco5完成。叠加热图的Mantel_r分析和中性群落模型使用在线作图平台完成。利用R Studio软件完成随机森林模型和偏最小二乘路径模型以探究土壤氨氧化古菌、酶活性与硝态氮之间的响应关系。
Relationship between Ammonia-Oxidizing Archaea Community Structure and Nitrate Nitrogen Content in Chinese Fir Plantations at Different Generations
- Received Date: 2022-07-18
- Accepted Date: 2022-11-29
- Available Online: 2023-04-20
Abstract: