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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)属于杜仲科杜仲属,进化上相对保守,是一种古老的树种。杜仲在我国已有2000多年栽培历史,广泛分布于我国多省区。杜仲组织中存在一定数量的含胶细胞,含胶细胞中储存有天然橡胶的异构体杜仲胶(反式-1,4-聚异戊二烯),故以杜仲叶片和果实作为主要原料提取杜仲胶。天然橡胶作为一种重要的战略物资,由于国际橡胶市场供需关系日趋紧张,严重影响我国天然橡胶资源安全,因此,大力发展杜仲胶产业对于保障我国的天然橡胶资源安全具有重要意义[1-4]。大力开发杜仲胶产业,需要发展杜仲种植业、提升杜仲种质资源品质,这就要求研究人员从植株、细胞和分子等水平系统地研究杜仲产胶过程,为杜仲胶生成机制研究提供支撑,从而能够在根本上提升杜仲的胶产量和品质。目前,对于杜仲产胶机制的相关研究主要集中在基因、蛋白质、代谢组和植株水平[5-9],细胞形态学水平研究较为缺乏。
杜仲含胶细胞主要分布在茎、叶、根、果实及雄蕊组织中[10-11]。早在古代,我国的劳动人民就已经发现杜仲茎皮存在“折之内有白丝相连”的现象[12]。史自强等[13]采用溴-碘-冰醋酸变性试剂处理后进行石蜡切片的方法观察到了棕色变性橡胶丝。田兰馨等[14-15]采用石蜡切片法在杜仲1年生茎初生韧皮部观察到含胶细胞,采用薄切片法对杜仲1年生茎中含胶细胞发生和发育进行了研究,并描述了茎中含胶细胞自原始细胞发育至成熟过程的细胞内部结构变化。崔跃华等[16] 、申延等[17]也在1年生茎和当年生果实中观察到了类似细胞内部结构变化。崔跃华等还采用碱溶液离析组织的方法对果皮、叶片和叶柄的含胶细胞长度进行了离析测量[18];周莉英等[19]采用溴-碘-冰醋酸试剂变性处理后以碱溶液离析叶片中含胶细胞束的方法,对不同月份叶片中含胶细胞的长度进行了动态分析。Nakazawa等[20]采用激光共聚焦显微技术对杜仲茎组织切片进行荧光染色分析,认为杜仲含胶细胞内部橡胶粒子的融合过程和反式-1,4-聚异戊二烯的积累同时进行,并提出了一种含胶细胞反式-1,4-聚异戊二烯合成及积累过程的模型,分为细胞分化和伸长、橡胶粒子堆积、橡胶粒子充满乳管并融合三个阶段;利用扫描电子显微镜技术对杜仲茎中含胶细胞断面进行研究,认为反式-1,4-聚异戊二烯最初以棒状粒子形式在含胶细胞中合成,并随着细胞成熟而转变为纤维状结构,最终充满细胞腔。赵喜源[4]也通过断面表征观察到含胶细胞内部的橡胶粒子。杜仲含胶细胞的内部橡胶粒子是积累天然高分子聚异戊二烯的细胞器,其发育机制尚未有相关文献报道。橡胶粒子的基本结构与脂质体一致,内部为疏水橡胶球芯,外部为单层生物膜。单层生物膜作为相界面防止颗粒聚集[21]。杜仲含胶细胞在乳管分类中属无分支-非铰接型乳管[22]。无分支-非铰接型乳管在生长中原基伸长成一个不分枝的管道,通过侵入性生长方式生长[22-23]。前人对杜仲含胶细胞的解剖结构、起源分化和杜仲胶积累机制进行了一定的研究,但关于杜仲含胶细胞的起源、发育和成熟过程的细胞形态特征变化过程尚且不足。本研究通过利用整体观察法和组织切片法对杜仲茎、种子萌芽期子叶和幼苗期子叶的含胶细胞的起源、发育和成熟过程的细胞形态特征进行了更深一步的研究,以期为解释含胶细胞起源、发育和成熟过程提供细胞形态学证据。
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含胶细胞在杜仲茎皮层内大量存在,部分含胶细胞单独生长,与其他含胶细胞无纠缠。取得的3个单独生长的含胶细胞外部形态的完整高分辨率图像见图1。杜仲含胶细胞由宽度均匀的细长胞体和近似为椭球体的2个膨大端构成;胞体基本与杜仲茎的轴方向平行,结构呈近似直线状或折线状;自然状态下的含胶细胞整体无色透明,经变性整体染色法处理后细胞整体被苏丹III染成红色。含胶细胞形态结果符合以往文献中对成熟含胶细胞形态的叙述,故其为含胶细胞的成熟形态。
对取得的14个成熟含胶细胞照片进行统计分析。统计结果显示:茎皮层中杜仲成熟的含胶细胞轴长度范围为981 ~ 3 167 μm,直线长度范围为813 ~ 3 149 μm,直线长度与轴长度之比范围为1:1.00 ~ 1:1.21,平均轴长度为2 086.9 μm。
在杜仲茎皮层中观察到与含胶细胞具有相同染色的特殊结构见图2、图3。图2表明:结构具有两端膨大、胞体细长的特征,与成熟的含胶细胞特征相同;直线长度为1 196.8 μm,达到成熟含胶细胞直线长度,故这种特殊结构属于含胶细胞;含胶细胞在其细长的胞体上具有多个膨大节,成熟含胶细胞并不具备,因此,图2属于含胶细胞的成熟过程中间形态,是成熟中的含胶细胞。图3显示:该结构存在10个较为密集的膨大节,相邻膨大节之间直接相连或由一段长度较短的胞体相连,因此,是另一个成熟中含胶细胞的局部图像。图3中虚线标注的亚结构呈哑铃状,由一段28.9 μm的细长胞体和2个膨大节构成,结构两端最远处距离为61.6 μm;哑铃状结构右端膨大节与另一个膨大节直接相连;左端膨大节与膨大节同样直接相连,但在2个膨大节间出现了长度为18 μm的胞体结构。图3中哑铃状亚结构与其直接相连的2个膨大节间存在无胞体结构和有胞体结构2种情况,代表相邻亚结构的膨大节之间的相连过程先于相邻的哑铃状结构之间胞体出现的过程。对比图2和图3结果,图2含胶细胞膨大节更少、分布更稀疏,膨大节间胞体长度更长。
对46个含胶细胞膨大端照片进行统计分析,结果显示:膨大端椭球体短轴长度(膨大端宽度)范围为8.6 ~ 22.4 μm,椭圆形的长轴与短轴之比范围为1.08 ~ 1.77。
茎皮层中含胶细胞局部图像见图4所示。含胶细胞周围有一定的空隙(图4A);经二甲苯透明后含胶细胞膨大端大部分胞质均匀无内部结构(图4B),少部分在椭球体中心处有球状结构,在显微镜光源照射下显得十分明亮(图4C);大多数胞体无内部结构(图4D黑色箭头处),少部分在中线处有连续的内部结构,在显微镜光源照射下显得十分明亮(图4D白色箭头处),其余部分胞质染色均匀。
图4C和图4D中含胶细胞内部存在光照下显得明亮的结构现象,类似于玻璃经光照后夹杂的气泡呈明亮状的现象。分析光在含胶细胞内外的传播情况:显微镜光源发出的光由于受到周围环境影响,到达含胶细胞表面时光线方向各异。将含胶细胞胞体近似为圆柱体,当光于细胞表面进入细胞质时,此时含胶细胞细胞质的亮度与周围组织未有明显差异,代表永久装片中覆盖在样品表面的中性树胶封片剂(nD,20: 1.521 6 ~ 1.524 0)和二甲苯(nD,25: 1.493 25 ~ 1.502 95[24])透明处理后的周围组织与二甲苯透明处理后的含胶细胞细胞质的折射率差异较小,光只发生了曲面折射。当光由含胶细胞细胞质进入内部结构时,此时观察到含胶细胞胞体中线处具有呈明亮内部结构,代表相当一部分的光在二甲苯透明后的细胞质与内部结构两相界面上发生了全反射现象。全反射现象的发生条件之一为光由光密介质进入光疏介质,故含胶细胞内部结构的折射率小于含胶细胞细胞质的折射率。综上所述,该内部结构在光源照射的情况下显得十分明亮,是因为其折射率小于二甲苯透明后的含胶细胞细胞质的折射率,故该内部结构与二甲苯透明的细胞质折射率更低且存在明显的相界面。
当年生杜仲茎的整体染色冷冻切片结果见图5,含胶细胞(染色后呈红色部分)主要分布在皮层韧皮部,有的含胶细胞单独生长,有的含胶细胞聚集生长。单独生长的含胶细胞胞体垂直于轴方向生长时其胞体截面近似圆形,故含胶细胞胞体可近似为圆柱状处理(图5白色箭头处)。
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茎皮层中3个单独生长含胶细胞图像见图1A、B、C所示,对其进行形态学数据测量,参考图1D并按照式(1)进行体积估算,同时计算膨大端体积占含胶细胞体积比例ω,结果见表1。
项目
Project图1测量数据
Fig. 1 Measurement dataA B C 直线长度l/μm 2 030.0 1 765.8 1 922.6 左膨大端长轴长a1/μm 30.1 34.7 25.1 右膨大端长轴长a2/μm 22.4 22.4 22.2 左膨大端短轴长b1/μm 22.5 25.1 18.4 右膨大端短轴长b2/μm 17.1 22.2 15.9 胞体长度s/μm 2 074.3 1 708.7 1 875.3 轴长度Axis length/μm 2 126.8 1 803.3 1 997.3 胞体平均宽度$\bar{d}$/μm 12.2 10.1 9.6 含胶细胞体积V/mm3 2.61 × 10−4 1.92 × 10−4 1.51 × 10−4 膨大端体积占含胶细胞体积比例ω/% 6.27 10.94 4.73 Table 1. Morphological data of laticifer cells
经体积估算得到单个含胶细胞体积范围为1 × 10−4 ~ 3 × 10−4 mm3。含胶细胞膨大端长轴远小于整个含胶细胞的长度,短轴长却为胞体平均宽度的2倍左右。计算结果显示,膨大端在含胶细胞总体积中占据相对较大的比例(4% ~ 11%)。
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种子萌芽期子叶局部显微图像见图6。在种子萌芽期子叶靠近胚一端处(图6B红框位置)观察到子叶中原位生成的含胶细胞束向杜仲胚方向延伸的一连串细胞结构(图6A),该结构远离含胶细胞集束,在子叶中孤立存在。由于含胶细胞原位生成并以侵入性生长方式协调地生长,同时随着植物的生长而伸长,故在种子萌芽期子叶中,原位发生的含胶细胞束中的含胶细胞结构位置越远离集束、在子叶中存在越孤立、结构伸长的越短,则其发育时期越早。因此,一连串含胶细胞结构可以确定为含胶细胞的早期结构,是含胶细胞的最初状态。含胶细胞的早期结构可以分为两个部分:图6A结构右侧存在三个中间弯曲细长、两端膨大的哑铃状结构,结构间紧邻但不连续,细胞质较周边组织有明显的折射率差异。图6A中从右至左的3个哑铃状结构两端最远距离分别为63.5、38.2、48.9 μm;3个结构内部细长处宽度在5 μm左右,具有较大长宽比,基本符合田兰馨[14-15]文献中原始细胞叙述。其中,右侧第一个哑铃状结构显著不对称,其靠近胚的一端宽度达到16.9 μm,尺寸接近于含胶细胞膨大端短轴长,而另一端宽度仅为8.5 μm。图6A结构左侧存在一个连续结构,右端微有膨大但与哑铃状原始细胞间两端距离紧密却存在界限;胞身含有2个膨大节,宽度分别为12.9 μm和10.9 μm;两个膨大节间胞体长度为40.9 μm。
杜仲幼苗期子叶含胶细胞图显示:杜仲子叶中的成熟含胶细胞胞体细长,具有不规则形态的膨大端,细胞整体均一、透明、染色均匀(图7A)。有在螺纹导管存在的叶脉区域,发现众多具有与成熟含胶细胞相同染色的断续结构,其近似构成了一条曲线(图7B红色框线处)。相比种子萌芽期子叶,幼苗期子叶中含胶细胞密度更低,可以清晰地看到单独生长的含胶细胞。
以图6A结构作为含胶细胞发育过程形态研究起点,图7A含胶细胞作为发育过程形态研究终点,分析解离的染色后含胶细胞束中的含胶细胞成熟过程的中间形态。含胶细胞特殊形态如图8所示:图8A、B、C分别是3种有代表性的成熟中含胶细胞结构。图8A得到的结构类似于图6A,整体结构连续,其中,右侧第1个哑铃状结构显著不对称,右端宽度为11.9 μm,左端宽度为5.9 μm,两端最远距离为45.2 μm;通过对比图8A结构的自身差异发现,距结构右侧最远端距离86.7 μm至273.3 μm区域内的膨大节间胞体较其他位置胞体有明显的伸长迹象。图8B中结构仅有5个膨大节,膨大节分布稀疏,相邻2个膨大节之间的胞体长度存在显著差异;胞体一端未见明显膨大端。图8C是一种连续的但不含膨大节的结构,除存在内部结构外,整体形态与成熟的含胶细胞相同,椭圆形的膨大端出现。图8A、B、C含胶细胞结构均具有相连的类似含胶细胞胞体的连续结构,内部存在一定的内部结构,区别在于膨大节有无、相邻膨大节之间胞体长度差异和膨大端的有无。由此可以认为,图8A、B、C分别显示的是3个处于不同发育时期的含胶细胞,图8A和图8B的差异可能是由于随着含胶细胞逐渐成熟,不对称的哑铃状原始细胞结构消失,膨大节之间胞体伸长及连接相邻亚结构单元的胞体伸长造成的。由以上结果对其发育时序排序为:图8A→图8B→图8C。故以发育时期先后顺序对含胶细胞形态图像排序为:图6A→图8A→图8B→图8C→图7A。
图8D为图8B胞体膨大节局部放大图。图8E为膨大节分布稀疏且无膨大端的含胶细胞局部图像,含胶细胞与图8B含胶细胞处于同一发育时期,其细胞内部存在不连续的椭球状结构。图8F为无膨大节、有膨大端的含胶细胞的局部图像,含胶细胞外形已非常接近成熟的含胶细胞,但内部具有一些平行结构,该结构于含胶细胞末端膨大区汇合。平行的内部结构形成,可能代表着含胶细胞进入了新的发育时期。
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图9为杜仲叶片主脉横截面中取得含胶细胞的透射电子显微照片。反式-1,4-聚异戊二烯结构存在于含胶细胞细胞壁包裹的细胞腔之中[20]。图9A含胶细胞直径11 μm,反式-1,4-聚异戊二烯结构占据整个细胞腔截面积的94.2%。图9B中含胶细胞长9.1 μm,宽6.9 μm;含胶细胞腔截面中,液泡占据大部分面积,细胞壁内侧的细胞质基质将液泡环绕。细胞质基质中存在直径分别为3.3 μm和0.5 μm的2个明显的橡胶粒子,占细胞腔截面积的34.1%。在细胞质基质中多处存在平行于细胞壁和液泡膜的内质网(图9C、D),同时在细胞质基质中分布着许多电子致密物质。左侧紧邻的含胶细胞具有多个橡胶粒子,橡胶粒子周围存在着许多深灰色点状的电子致密物质。
Cytomorphology of Laticifer Cells in Stems and Cotyledons of Eucommia ulmoides Oliv.
- Received Date: 2022-10-05
- Accepted Date: 2022-12-30
- Available Online: 2023-06-20
Abstract: