Screening of Camellia oleifera Rootstock Genotypes Tolerant to Low Phosphorus and Identification of Indexes Tolerant to Phosphorus Deficiency

试验材料是江西省主推的12个品种油茶半同胞实生子代，主推品种详细信息见表1。

2018年收集12个品种油茶的成熟果实，脱壳取种籽，12月份播种沙藏，待长出子叶后移至口径为20 cm、河沙为基质的圆底花盆中，每盆3株，每处理9盆，每盆底部放置托盘。所有油茶苗在江西农业大学科技园大棚内培养，根据基质湿度适当补充水分，每12 d左右浇灌1次营养液。霍格兰营养液配方为：Ca(NO₃)₂·4H₂O 4 mmol·L⁻¹, KNO₃ 3 mmol·L⁻¹, MgSO₄·7H₂O 2 mmol·L⁻¹, H₃BO₃ 50 μmol·L⁻¹, ZnSO₄·7H₂O 15 μmol·L⁻¹, CuSO₄·5H₂O 2 μmol·L⁻¹, MnSO₄·H₂O 50 μmol·L⁻¹, H₂MoO₄ 14 μmol·L⁻¹, Fe-Na₂-EDTA 100 μmol·L⁻¹，磷源由KH₂PO₄提供，不足的钾用KCl补充。2019年3月开始浇灌霍格兰营养液，培养8个月后测定各品种油茶幼苗在正常磷(1 mmol·L⁻¹ KH₂PO₄)和低磷(0 mmol·L⁻¹ KH₂PO₄)下的各项生长及养分指标，3个生物学重复。

每个处理选长势较一致的油茶收获整株，洗净根系，将根、茎、叶分离。用Expression 10000XL 3.49扫描仪扫描整个根系，Win RHIZO(Pro2012b)分析并计算总的根系指标。CI-203手持式激光叶面积仪测定整株叶片形态。分离后的根、茎、叶放入烘箱中，100℃杀青30 min后65℃烘至恒质量，用电子秤分别称量根、茎、叶干质量，并计算根冠比。H₂SO₄-H₂O₂消煮根、茎、叶后，Smart Chem 200全自动智能化学分析仪测定各组织全磷，并计算磷积累量、磷利用效率。公式如下：

总磷积累量 (mg) = 总干质量/全磷

总磷利用效率 (g·mg⁻¹) = 总干质量/总磷积累量

用SPSS 25.0进行相关性、主成分、逐步回归分析，结合隶属函数综合评价12个品种油茶半同胞实生子代的耐低磷顺序，运用 Heml 1.0 Heat map Illustrator 软件进行聚类热图分析。相关指标计算公式^[25]如下:

　　式（２）中：µ(X_j)表示第j个综合指标的隶属函数值，X_j表示第j个综合指标值；X_max表示第j个综合指标的最大值，X_min表示第j个综合指标的最小值。

各综合指标权重：

　　式中：W_j表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重; P_j为各品种第j个综合指标的贡献率。

　　式中：D表示在低磷胁迫条件下油茶耐低磷能力的综合评价值。

由于不同品种油茶半同胞实生子代在低磷和正常磷下生长差异较大，为消除种间误差，用耐低磷系数能更准确的反映其耐低磷能力大小^[26]。表2表明：低磷下各油茶的地上干质量、总根长、总根表面积、叶面积、叶长、叶宽以及总磷积累量与正常磷(P1)相比均有所下降(耐低磷系数 < 1)，其中，CL18的地上干质量和叶面积耐低磷系数最接近1。除CL3和CL18外，其他油茶的根冠比耐低磷系数均大于1，除W1外的所有油茶总磷利用效率的耐低磷系数也都大于1，但是不同油茶的各指标变化幅度不同。因此，用单项指标的耐低磷系数来评判油茶的耐低磷能力大小，结果会有很大差异。

由表3可以看出：许多性状指标间存在着较强关联性，如地上干质量与总根长、总根表面积、总根体积、叶面积、总磷积累量呈显著( P < 0.05)或极显著( P < 0.01)正相关，总磷积累量与根干质量、地上干质量呈极显著正相关(P < 0.01)，根全磷、地上全磷、植株全磷均与总磷利用效率呈极显著负相关(P < 0.01)。

根据表4可知：主成分分析将14个与耐低磷相关的指标转化为4个主成分，其特征根均大于1，其中，主成分1的贡献率为26.546%，主成分2的贡献率为22.948%，主成分3的贡献率为21.353%，主成分4的贡献率为19.550%。这4个主成分可作为评价油茶耐低磷的综合指标。

特征向量表明了各个性状对主成分负荷影响的程度和方向。表4表明：第1主成分中，总根长、总根表面积和总根体积有较大的正系数值，说明这3个指标对第1主成分有较大的正面影响，这3个指标反映了根系生长，因此，将第1主成分归为根系形态指标。第2主成分中，植株全磷、地上全磷有较大正系数值，植株总磷利用效率有较大负系数值，说明第2主成分大时，植株全磷、地上全磷会增大，而植株总磷利用效率会降低；第2主成分主要反映了植株的磷营养积累能力，第2主成分归为磷营养指标。第3主成分中，根干质量的系数值最大，第3主成分归为根生物量指标。第4主成分中，叶面积、叶宽、叶长有较大的正向系数，第4主成分归为叶形态指标。

根据公式(2)计算12个品种油茶半同胞实生子代4个综合指标CI(j)的隶属函数值μ(X_j)，由表5可知：83-4隶属函数值最大(μ(X₁)=1)，CL53隶属函数值最小(μ(X₁)=0)，表明83-4在CI(1)综合指标中耐低磷能力最强，而CL53耐低磷性最差。

利用公式(3)计算其权重W_j，得到4个综合指标的权重分别为0.294、0.254、0.236、0.216(表5)。

利用公式(4)计算油茶耐低磷综合评价值(D)，根据D值大小得到不同品种油茶的耐低磷能力顺序为：CL18 > CL40 > G8 > CL4 > W2 > 83-4 > GX48 > W1 > CL53 > CL3 > GF20 > 84-3。

采用最大距离法对D值进行聚类分析(图1)，可以将12个品种油茶半同胞实生子代耐低磷能力分为3类，第Ⅰ类：GF20、CL3、84-3，为相对不耐低磷敏感类型；第Ⅱ类：W1、CL53、GX48, 为中间型；第Ⅲ类：G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4，为相对耐低磷类型。

Figure 1.  The cluster of low-P tolerance in C.oleifera

为了解各项测定指标与D值间的相关程度，筛选出关键的油茶耐低磷鉴定指标，以综合评价值D为因变量，各项测定指标为自变量，做逐步回归分析，建立回归模型为：D = −0.960 + 0.666PA + 0.341SPC + 0.379TRA + 0.460LW + 0.197RPC,（方程决定系数R² = 0.997，P < 0.01）。根据方程结果，14个指标筛选出PA（总磷积累量）、SPC（地上全磷）、TRA（总根表面积）、LW（叶宽）、RPC（根全磷）这5个相关性更强的指标。对回归方程的精度比较(表6)发现：精度均在95%以上，证明这5个指标对油茶耐低磷性影响显著，此方程可用来评价其他油茶耐低磷性。

油茶新造林面积在逐年增加，大多数高产油茶已采取集约式经营，但是产量仍然不高，特别是单位面积的产量。调查发现，同一林分，相同管理措施下，同一品种不同株之间的产量差别很大，果实产量从1 kg到20 kg不等。油茶优良无性系主要通过芽苗砧嫁接的形式推广和应用，实际生产中通常以实生苗胚根作为砧木，在嫁接繁育时一般只注重选用良种穗条，对砧木的选择往往是随机的，大量研究表明，抗逆性强的砧木能提高嫁接植株的抗逆能力，且砧木相对穗条来说对植株的影响程度更大^{[21, 27]}。磷缺乏是限制油茶高产的主要因素之一，在矿质元素中，磷是对光合作用及碳水化合物在地上部分与根系之间分配起重要作用的元素^[8]。本研究结果表明，不同品种油茶半同胞实生子代芽苗砧对磷的吸收和利用效率有很大差异，砧木耐低磷性差异可能是单株产量差异大的原因之一。杨邵研究表明，长林18号种子和砧木形态表现优，发芽率高，百粒质量大，种间发芽率和百粒质量变异小，但以长林18号为砧木嫁接长林23号、长林40号、长林18号穗条的油茶成活率低，亲和性较差^[14]。本研究发现，长林18号实生后代的耐低磷能力较强，但嫁接后成活率如何以及是否还能保持较强的耐低磷能力和优良性状，还值得进一步研究。

本研究发现，相对正常磷，低磷环境下大部分油茶实生子代的根冠比增大。植物缺磷时，受缺磷信号诱导，同化产物向根系转运量增加，由于缺磷使代谢紊乱，从而使可溶性碳水化合物合成及运输受阻，导致根系生物量增加同时减少地上生物量的积累，但是绝对生长量是低于正常磷的^[28-30]。根冠比增加被认为是植物适应低磷胁迫的反应标志^[31]。相关性分析结果表明，根冠比与根干质量显著正相关，与地上干质量负相关但不显著，根系干物质的大量积累或许是造成根冠比增加的主要因素。12种油茶半同胞实生子代的地上干质量、叶面积、叶长、叶宽以及总磷积累量均受到低磷的抑制作用，可能是由于低磷胁迫抑制了植物的磷吸收，胞内磷浓度降低，导致光合磷酸化水平下降，叶肉细胞减少，因此，叶片生长受阻^[32-33]。缺磷还会抑制油茶幼苗侧根分化和生长^[34]，低磷下12种油茶芽苗砧的总根长、总根表面积均减少了。

相关性结果表明，地上干质量与总根长、总根表面积、总根体积显著或极显著正相关，植物地上与地下生长存在异速相关性，对养分的吸收也会互相影响^[35]。总磷利用率与植株全磷、地上全磷、根全磷极显著负相关。有研究表明，随着磷浓度的降低，油茶磷积累量会减少，而磷利用效率增加^[17]。植物在调控耐低磷胁迫时有磷转运蛋白、转录因子等很多基因参与其中，是一个极为复杂的过程，与植物吸收和利用磷的相关指标有很多，用单个指标无法准确评判耐低磷性^[36]。相关性分析发现，指标间存在显著关联性，说明指标间存在重叠信息，需要综合评价。用综合评价值评判磷效率类型的方法已在多个植物上应用^[37-38]，因此，本研究以综合指标值聚类分析12个品种油茶半同胞子代实生苗的耐低磷性。

低磷胁迫下12个品种油茶半同胞子代实生苗生长受到抑制，根冠比和总磷利用效率增大是油茶适应低磷的普遍反应。GF20、CL3、84-3为相对不耐低磷类型；W1、CL53、GX48为相对中间型；G8、CL4、W2、CL40、CL18、83-4为相对耐低磷类型。以综合评价值为自变量逐步回归方程，鉴别出总磷积累量、地上全磷、总根表面积、叶宽、根全磷这5个指标可用来判断油茶的耐低磷性。