Study on the Inhibition Mechanism of Trichoderma songyi Against Sphaeropsis sapinea

松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）由中国林业科学研究院森林保护重点实验室菌种保藏中心提供。森吉木霉M75由本实验室分离筛选获得，现保藏于中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC54490。

将保藏的M75菌株接种于PDA培养基上，28℃活化5 d，用打孔器选取直径5 mm菌饼，接入装有250 mL PDB培养液的三角瓶中，180 r·min⁻¹、28 ℃振荡培养4 d，10000 r·min⁻¹4℃离心10 min，取上清经0.45 μm无菌微孔滤膜过滤，得到发酵粗提液，于4 ℃冰箱中保存备用。

将保藏的松球壳孢菌菌株接种于PDA培养基上，28 ℃活化5 d，用打孔器选取直径5 mm菌饼，接入装有250 mLPDB培养液的三角瓶中，160 r·min⁻¹、28 ℃振荡培养3～4 d，将产生的直径约为2 cm的病原菌菌丝团用无菌水洗净后置于20 mL含20%发酵粗提液的无菌水溶液中，静置2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h后测定松球壳孢菌各项代谢酶活性和生理指标。以不添加发酵粗提液作为空白对照，每个时间段处理重复3次，指标测定时技术重复3次。

测定的病原菌代谢系统酶包括：保护酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）；糖酵解途径中的己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH）；三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）；辅酶Ⅰ含量和ATP酶。酶活性测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

生理指标包括电导率、丙二醛（MDA）含量2个指标。电导率测定使用电导仪测定^[16]，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法^[17]。

采用Excel 2010软件对实验数据进行统计和分析，绘图使用Origin 2018软件。

如图1所示，经森吉木霉M75粗提液处理的前8 h内，与对照组相比，松球壳孢菌代谢系统SOD酶活性显著上升，并在处理8 h时达到峰值，此时酶活性为72.717 U·（g·min）⁻¹。说明病原菌在粗提液的处理下，前期SOD酶活性增加以达到保护菌体的作用。处理8 h后，SOD酶活性大幅降低，在处理96 h时酶活性最低，为1.510 U·（g·min）⁻¹，说明随着处理时间增加，SOD酶活性不断降低。对照组在前8 h内SOD酶活性也呈上升趋势，8 h时酶活性达37.167 U·（g·min）⁻¹，显著低于同时段处理组酶活性。但8 h后，对照组SOD酶活性呈平稳变化趋势，无大幅下降，48 h时达峰值62.180U·（g·min）⁻¹，在处理96 h时酶活性为52.985 U·（g·min）⁻¹。

Figure 1.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen protective enzyme activities

经森吉木霉M75粗提液处理的前12 h内，CAT酶活性快速上升并在12 h时达到峰值，0.067 U·（g·s）⁻¹，说明发酵粗提液导致松球壳孢菌代谢系统中过氧化氢含量增加，但处理12 h后酶活性大幅下降，并逐渐趋于零，在处理96 h时为0.004 U·（g·s）⁻¹，是由于SOD酶活性逐渐降低，及膜脂过氧化严重，导致CAT酶活性不断降低。而对照组在48 h内CAT酶活性都处于上升状态，在48 h时达到峰值0.064 U·（g·s）⁻¹，在之后随时间增加酶活性缓慢下降，96 h时为0.054 U·（g·s）⁻¹，且在24 h后对照组CAT酶活性始终高于处理组。

在经森吉木霉M75粗提液处理的前12 h内，与对照组相比，松球壳孢菌代谢系统POD酶活性显著上升，在12 h时达到峰值，为5.733 U·（g·s）⁻¹，在12 h后，处理组酶活性大幅下降，并在48 h后趋于平稳。对照组POD酶活性一直呈上升趋势。PPO酶活性与POD酶活性变化趋势基本一致，处理组在10 h时达到酶活性峰值，11.909 U·（g·s）⁻¹，此后酶活性大幅快速下降，并在处理96 h时达到最低值0.046 U·（g·s）⁻¹。

如图2所示，经M75发酵粗提液处理后，松枯梢病原菌松球壳孢菌菌丝团的PK、HK、LDH均随时间增加呈下降趋势，PK酶活性从初始2 h时的0.550 U·（g·min）⁻¹，至96 h时下降至0.033 U·（g·min）⁻¹。HK酶活性从初始2 h时的0.066 U·（g·min）⁻¹，至96 h时下降至0.005 U·（g·min）⁻¹。LDH酶活性由初始2 h的2.351 U·（g·min）⁻¹，至96 h时下降至0.122 U·（g·min）⁻¹。而对照组的PK、HK活力都随时间增加呈持续上升趋势，PK酶活性由初始2 h的0.492 U·（g·min）⁻¹，至96 h时上升至0.952 U·（g·min）⁻¹；HK酶活性由初始2 h的0.060 U·（g·min）⁻¹，至96 h时上升至0.204 U·（g·min）⁻¹；对照组的LDH酶活性整体趋于平稳，且酶活性始终高于处理组，说明M75发酵粗提液对糖酵解途径中的PK、HK及LDH的合成产生了抑制作用，严重干扰了其正常代谢。

Figure 2.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen key enzyme activities in sugar metabolic pathways

琥珀酸脱氢酶SDH是细胞能量代谢的重要酶类，其活性变化可直接反应细胞能量代谢状况^[18]。如图3所示，经生防菌M75粗提液处理后，松球壳孢菌菌丝团的MDH与SDH酶活性在处理后的12 h内急速下降，MDH酶活性由初始2 h时的15.550 U·（g·min）⁻¹下降至24 h时的1.275 U·（g·min）⁻¹，之后下降趋势变缓，但仍随时间呈逐渐下降趋势，在96 h时为0.196 U·（g·min）⁻¹。SDH酶活性在处理12 h内由初始2 h的30.327 U·（g·min）⁻¹急速下降至9.997 U·（g·min）⁻¹，之后下降趋势减缓，处理96 h时为0.948 U·（g·min）⁻¹。而对照组MDH与LDH酶活性则随时间呈逐渐上升趋势。这说明粗提液抑制了病原菌代谢系统中MDH和SDH的正常合成，导致三羧酸循环停滞。

Figure 3.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens key enzyme activities in TCA cycle

如图4所示，经森吉木霉菌M75发酵粗提液处理后的12 h内，松枯梢病原菌松球壳孢菌菌丝团的辅酶I含量快速下降，由2 h的5.700%下降至1.340%，在之后随处理时间的增加不断趋于零。对照组辅酶I含量则不断增加。

Figure 4.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on the content of pathogens enzyme I

如图5所示，经森吉木霉菌M75发酵粗提液处理的Na⁺，K⁺-ATP、Mg²⁺-ATP、Ca²⁺-ATP酶活性总体上呈先上升后急速下降的趋势。处理4 h时，Na⁺，K⁺-ATP酶活性达到峰值0.902 μmol Pi·（g·h）⁻¹，处理12 h时，Mg²⁺-ATP、Ca²⁺-ATP酶活性达到峰值，分别为1.759和3.184 μmol Pi·（g·h）⁻¹，此后急剧下降并逐渐趋于零。对照组酶活性在24 h内处于快速上升趋势，后上升趋缓，但酶活性在10或12 h后高于处理组。

Figure 5.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on ATP enzyme activities

如图6所示，松球壳孢菌经森吉木菌M75发酵粗提液处理后，电导率随处理时间呈明显增大趋势，并且在各处理时段都远高于对照组，说明经处理的病原菌体电解质泄露，导致电导率值增加。

Figure 6.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens conductivity

如图7所示，经森吉木霉M75粗提液处理后，松球壳孢菌MDA含量在24 h内呈急速增加趋势，在24 h时达到峰值，1.063 nmol·g⁻¹，而后呈下降趋势。对照组MDA含量整体随时间增加呈平稳上升趋势，且对照组MDA含量始终低于处理组。

Figure 7.  Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens MDA contents

木霉菌作为应用最广泛的一类生防真菌，对18个属的29种植物病原真菌表现出显著的抑菌活性^[19]，生防菌株能够抑制病原菌的生长，必然是破坏了菌体正常的生理代谢途径^[20]。森吉木霉M75发酵粗提液对松枯梢病原菌松球壳孢菌的抑制作用主要体现在，发酵粗提液有效抑菌成分可使松球壳孢菌代谢保护酶系统中的SOD、CAT、POD、PPO酶活性先上升后下降，并在处理10 h至12 h后显著低于正常水平，说明随着处理时间增加，氧自由基不断增多，细胞膜脂过氧化加重，导致保护系统酶活性不断降低，影响了病原菌保护酶系统的正常代谢。同时导致糖酵解途径中的HK、PK和LDH酶活性持续下降，影响了松球壳孢菌正常的糖酵解途径^[21]。作为三羧酸循环中的关键酶，SDH和MDH代表TCA循环活化状态^[22]，其酶活数值变化能直接反应细胞能量代谢的情况^[23]，SDH与MDH活性降低，代表菌体的TCA循环受阻，正常的细胞代谢无法进行。ATP是生命体维持生命活动的能量库，其含量能在一定程度上反应出自身的生理状态^[24]，辅酶I含量可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱，ATP和辅酶I的变化曲线反映出菌体在受到发酵粗提液胁迫时，细胞代谢路径受阻，糖酵解和TCA循环合成减慢，细胞能量供给不足^[25]。MDA是细胞膜脂过氧分解的主要产物，MDA的含量可直接反映细胞膜过氧化程度^[26]，当生物体受到胁迫时，会引起细胞质膜过氧化，使得MDA含量大幅上升^[27]，本研究中松球壳孢菌MDA含量在处理24 h内急剧上升，且处理组MDA含量始终高于对照组，说明发酵液导致病原菌菌体过氧化程度加剧^[28]。细胞内物质成分渗出是菌体膜脂受损的标志，能直接反映菌体细胞膜通透性的变化^[29]，本研究中松球壳孢菌的电导率随处理时间增加，电导率值不断上升，说明发酵粗提液破坏了菌体细胞膜的完整性，使菌体细胞膜透性改变，导致电解质渗漏^[30]，抑制了松球壳孢菌的正常生长。本研究中所用为此前分离得到的森吉木霉M75，这是森吉木霉首次应用于生物防治，目前还未见有关森吉木霉菌抑菌机理的报道，本研究对丰富生防木霉菌的资源库具有重要意义。

通过对松枯梢病病原菌松球壳孢菌代谢系统中保护酶系统、糖代谢、三羧酸循环、能量代谢中各关键酶和电导率、MDA含量等指标的测定，说明森吉木霉M75发酵粗提液对松枯梢病原松球壳孢菌有较好的抑制作用，可使其代谢系统相关酶活性降低，并导致电解质外渗，电导率升高，MDA大量累积，阻碍松球壳孢菌正常的生理代谢途径，使得病原菌无法进行正常的生理生化反应，从而抑制病原菌的生长。