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氮、磷、钾三大营养元素在植物的生长发育过程中起着不可或缺的作用,而钾元素在提高关键光合酶活性、提高叶绿素含量、维持细胞电荷平衡[1]等方面的作用尤为突出。我国南方红壤区92%~98%的钾元素以矿物质的形式存在[2],不易被植物吸收利用,进而影响植物的生长、产量、品质等。目前,优化提升土壤钾素含量多以施用钾肥为主,但我国钾肥储量并不富余,需以进口手段满足需求[3],且随着钾肥频繁使用,土壤污染加重。因此,如何高效转化土壤中的缓效钾元素,从而低成本高效的促进植物的吸收利用和生长发育,是近来土壤和植物营养学界关注的热点之一。
土壤微生物组通过自身代谢参与植物养分元素循环[4]、通过竞争或合作关系等促进根际微环境稳定[5],对植物的生长和健康有明显增益作用。解钾菌作为土壤微生物的重要组成部分,对含钾硅酸盐矿物具有分解作用,是将土壤中的缓效钾转化为速效钾的有效绿色微生物肥料[6]。在探索利用解钾菌改善农作物低钾胁迫方面,前人已有诸多尝试[7-9],但微生物肥料种类繁多并具专一性,不同作物根际筛选出的解钾菌能力各不相同,只有以土壤环境、植物种类等为选择依据,施用最适解钾菌才能产生最大效益[10]。
我国南方红壤区主要造林树种杉木(Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook.)具有经济、速生、丰产的特点,在提供生产用材、建筑用材、水土保持等方面具有较高的经济、生态价值。杉木多采用实生苗进行造林[11],在育苗和造林初期往往存在立地困难,诸如幼苗需水量大、固碳能力不完善等[12],而钾素在调节其细胞吸水[13]、加速植物木质化速率[14]、促进根系生长发育[15]等方面发挥着不可或缺的作用,能够显著提升杉木幼苗抗性和存活率。近年来,微生物组技术在解决农田养分匮乏、提高植物抗性、缓解农业废弃物污染等方面已有了大量探索和初步成效[16],这为利用林木生物工程菌种解决钾素匮乏问题提供了全新的思路,因此,本研究以南方红壤区杉木人工林下根际土壤为研究对象,分离筛选高效解钾菌并分析其解钾能力,经16S rDNA鉴定确定其属,通过单因素实验与正交试验来优化高效解钾菌的生长条件,以期获得高效解钾菌的最佳培养量,为解钾工程菌的开发奠定研究基础,亦为改善南方红壤区杉木人工林下根际土壤营养元素环境提供新的路径。
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根据1.1.1,得出研究区土壤基本理化性质(表1)。
林龄
Age /aTP/(g·kg−1) AP/(mg·kg−1) PAP/% OM/(g·kg−1) TN/(g·kg−1) HN/(mg·kg−1) TK/(g·kg−1) AK/(mg·kg−1) pH 2 0.34 20.56 6.14 32.03 0.99 73.46 2.74 20.39 5.26 4 0.37 12.58 3.45 23.27 0.75 63.99 1.83 22.15 5.35 10 0.53 11.10 2.10 34.27 1.10 140.11 1.54 12.16 5.34 15 0.30 13.08 4.30 33.15 1.07 193.87 3.62 23.88 5.29 注:TP:全磷;AP:有效磷;PAP:有效磷所占比例;OM:有机质;TN:全氮;HN:水解氮;TK:全钾;AK:速效钾。
TP: Total phosphorus; AP: Available phosphorus; PAP: Proportion of available phosphorus; OM: Organic matter; TN: Total nitrogen; HN: Hydrolyzed nitrogen; TK: Total kalium; AK: Available kalium.Table 1. Basic physiochemical properties of Chinese fir plantation soil
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从不同林龄杉木人工林下根际土壤中共分离出79株解钾菌,根据分离纯化过程中菌株的形状、颜色、大小、生长速度快慢等特征[11],挑选出20株优势菌株(编号JK1−JK20)用于摇瓶液体培养,测定其解可溶性钾含量并计算解钾率以筛选高效解钾菌。本次实验筛选出的解钾菌都为细菌,绝大多数菌株的菌落形态呈现圆形、透明、凸起、边缘整齐、表面湿润粘稠且富有弹性,亦存在颜色为淡红色、乳白色半透明的情况;菌体形态多为长杆状,两端钝圆,常成对状、链状排列;绝大多数菌株具备芽孢,芽孢呈椭圆或卵圆状,并有肥厚荚膜存在。
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测定不同菌株发酵液的可溶性钾含量(图1),不同菌株解钾量存在差异。各菌株发酵液的可溶性钾含量范围为38.29~81.06 μg·mL−1。整体来看,20株菌株中共有13株解钾量显著高于CK,占比65%,可溶性钾含量较CK增加量的范围为1.66~30.55 μg·mL−1,分解钾长石矿能力明显。JK13解钾量为81.06 μg·mL−1,为CK的1.6倍,显著高于其他菌株(P < 0.05),其次为JK2、JK16。以上13株菌株中,解钾率高于20%的菌株共计7株,占比53.85%,解钾率低于10%的菌株共计3株,占比23.08%(图2)。
不同菌株解钾率(图2)存在显著差异(P < 0.05),大部分菌株解钾率为正。综合解钾率与解钾量二者来看,JK13解钾率最高,为60.49%,其次JK2和JK16的解钾率为46.37%、39.33%。此外,菌株JK1、JK3、JK6、JK8、JK10、JK18、JK19这7株菌的培养液可溶性钾含量低于CK,说明这7株菌株不具备解钾能力,原因可能是这些菌株本身在成长繁殖过程中需要吸收一定量的钾素[27]。另外,前期处理过程中的H2O2灰化处理并不能使菌株体内的钾完全释放,也可能在转移过程中有部分速效钾被破坏导致流失。
对上述20株菌株发酵液进行pH测定,发现各菌株pH值显著低于CK(P < 0.05),解钾菌在代谢过程中会产生酸性物质,进而提高对钾长石矿中不可溶钾向可溶性钾转化的效率,提高溶液钾离子含量[28]。其中,JK15的pH值最低,为4.12,其解钾率为22.93%,具有较好的解钾能力,其次JK20的pH值为4.20,但其解钾率为12.54%。对13株有效解钾菌的解钾量与发酵液pH值进行相关性分析(图3),得出二者之间不存在相关关系(R2=0.852,P > 0.05)。由此可见,虽然解钾菌株在解钾过程中都能分泌酸性物质,但是菌株解钾能力的强弱与发酵液pH值大小并无直接相关关系。
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经鉴定,菌株JK13属芽孢杆菌属(Bacillus altitudinis),且进行比对的序列片段与高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似性达到100%,与嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)、同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)4个种的相似性达到99%(图4)。
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不同培养条件下菌株JK13生长量差异显著(P < 0.05)(图5)。碳源是微生物生长发育、新陈代谢的主要能量来源[29-30],JK13对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇均能吸收利用,但以0.5%浓度的甘露醇为碳源时OD600值显著高于其他碳源,菌株生长量最大(图5a、b),生长情况最好;经单因素方差分析和LSD多重比较表明,0.5%浓度的甘露醇与1.5%浓度之间存在显著差异。氮源在微生物生长过程中也发挥着重要的作用[31],经单因素方差分析和LSD多重比较表明,以酵母粉为氮源时JK13菌液浓度显著高于其余5种氮源(P < 0.05)。对菌株JK13而言,氯化铵、硝酸钾、尿素3个处理之间无显著差异(P > 0.05);而氯化铵处理同硫酸铵、硝酸钾、尿素3个处理间呈显著差异,后三者之间则无显著差异(图5c)。菌株JK13对1.0%浓度的酵母粉吸收利用效率更高,生长情况最好,而0.75%、1.0%、1.25%这3种浓度处理之间差异不显著(图5d)。
初始pH对菌株生长量影响差异性显著(P < 0.05)(图5e),菌株JK13的最适pH值为9.0,菌液OD600值随pH的增加呈上升趋势;经单因素方差分析和LSD多重比较,pH为9.0的处理同其余处理呈显著差异。不同菌株对氧气的需求量存在差异,摇瓶环境中氧气含量的多少是影响菌株生长速率的重要因素之一[32]。菌株JK13生长量在30~40 mL间无显著差异;30 mL装液量与10 mL、60 mL处理间的差异达到显著水平(P < 0.05)(图5f)。经单因素方差分析和LSD多重比较表明,JK13的不同接种处理间差异并不显著(图5g)。JK13的最适温度范围为28~35 ℃,但在35 ℃处理下的菌液OD600值显著高于其他温度处理(P < 0.05)(图5h)。
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基于上述单因素实验,设计4因素(初始pH、装液量、接种量、培养温度)3水平正交试验(表2)。其中因素A为初始pH值(7.5、8.0、9.0),因素B为装液量(20 mL、30 mL、40 mL),因素C为接种量(1%、3%、5%),因素D为培养温度(25℃、30℃、35℃)。极差分析结果为RA>RD>RB>RC,表明对菌株JK13的菌体生长程度影响最大的因素为初始pH值,其次为培养温度、装液量、接种量。菌株JK13的最佳培养条件优化方案为A3B2C1D3,即初始pH值为9.0,装液量为30 mL·100 mL−1,接种量为1%,培养温度为35℃。菌株JK13在最佳优化方案下的菌液OD600值为1.059,其在未优化的普通培养条件下为0.672,增长幅度为57.56%。
实验序号 A B C D OD600 1 1(7.5) 1(20) 1(1) 1(25) 0.815 2 1(7.5) 2(30) 2(3) 2(30) 0.879 3 1(7.5) 3(40) 3(5) 3(35) 0.885 4 2(8.0) 1(20) 2(3) 3(35) 0.954 5 2(8.0) 2(30) 3(5) 1(25) 0.892 6 2(8.0) 3(40) 1(1) 2(30) 0.933 7 3(9.0) 1(20) 3(5) 2(30) 1.026 8 3(9.0) 2(30) 1(1) 3(35) 1.059 9 3(9.0) 3(40) 2(3) 1(25) 0.970 K1 0.860 0.932 0.936 0.892 K2 0.926 0.943 0.934 0.946 K3 1.018 0.929 0.934 0.966 R 0.158 0.014 0.002 0.074 最优水平 3 2 1 3 主次顺序 A>D>B>C 注:k为均值,R 为极差。表中数据为3个重复的平均值。A:初始pH值;B:装液量,mL;C:接种量,%;D:温度,℃;OD600:菌液OD600值。
K means average, R means range. Data in tables are average values deviation on three times. A:Initial pH; B: Liquid medium volume; C: Inoculum concentration;D:Temperature;OD600:OD600 value of bacterial liguid.Table 2. The results of orthogonal test on culture condition for strain JK13
Screening, Identifying and Optimizing the Culture Conditions of High-efficiency Potassium-solubilizing Bacteria in the Rhizosphere of Cunninghamia lanceolata in Red Soil Area of South China
- Received Date: 2021-03-12
- Accepted Date: 2021-05-20
- Available Online: 2022-02-20
Abstract: