红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

姜荣波; 姜景民; 刘军; 陈益泰; 栾启福; 岳华峰

红楠ISSR-PCR反应体系的建立和优化

1.
中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳 311400
2.
国家林业局泡桐研究开发中心,河南郑州 450003
基金项目:
中国林业科学研究院所基金"亚热带珍贵阔叶用材树种收集、评价和选育技术研究"(RISF6808);浙江省科技计划面上项目"樟楠类优质用材树种优良品种选育和无性繁殖技术研究"(2009C32068)
中图分类号: S718.46

Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Machilus thunbergii

1.
Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China
2.
Paulownia Research and Development Center, State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, He’nan, China
CLC number: S718.46

摘要: 为建立稳定的红楠ISSR-PCR最佳反应体系,在探索红楠基因组DNA提取的基础上,利用单因子试验和正交试验设计对反应体系进行优化。首先采用单因子试验对Mg2+、引物、模板DNA、dNTPs的不同浓度水平进行优化,找出ISSR-PCR反应各因素的最佳浓度;同时为进一步增加结果的可靠性,采用正交试验设计方法对Mg2+、引物、模板DNA、dNTPs 4个因素3个浓度水平进行优化和筛选。综合两种试验方法结果,最终获得了红楠ISSR-PCR最佳反应体系:反应体系为20 μL,Taq酶0.05 U·μL-1,Mg2+ 2.0 mmol·L-1,模板DNA 1 ng·L-1,dNTPs 0.3 mmol·L-1,引物(835) 0.5 μmol·L-1,1×PCR缓冲液。建立重复性好、稳定性优良的ISSR-PCR反应体系,为下一步红楠群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。
- 红楠
- / ISSR-PCR反应体系
- / 单因子试验
- / 正交设计
Abstract: In order to establish stable ISSR-PCR reaction system of Machilus thunbergii, single factor and orthogonal experiment design were used to optimize the reaction system after exploring M. thunbergii DNA extraction. For finding optimal concentration of factors of ISSR-PCR, the different levels of concentration of Mg2+, primer, template DNA, dNTPs were trailed by single factor experiment. Meanwhile, in order to improve the reliability of the results of the single-factor test, the authors also adopted orthogonal design by four factors, three levels for further optimizing and screening the best conditions of Mg2+, primer, template DNA, and dNTPs. The best ISSR-PCR reaction system of M. thunbergii was eventually established by comparing the two method’s results, which included 20 μL reaction system, Taq enzyme, 0.05 U·μL-1,Mg2+ 2.0 mmol·L-1 template DNA 1 ng·L-1,dNTPs 0.3 mmol·L-1,primers(835) 0.5 μmol·L-1, and 1×PCR buffer. The establishment of the better repeatability and stability ISSR-PCR reaction system could provide technical support for further research of genetic structure and genetic variety of M. thunbergii group.
- Machilus thunbergii
- / ISSR-PCR reaction polymorphism
- / single factor experiments
- / orthogonal design

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