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海州常山(Clerodendrum trichotomum Thunb.),又名臭梧桐,为马鞭草科(Verbenaceae)赪桐属(Clerodendrum L.),灌木或小乔木,广泛分布于我国华北、华东、中南、西南等各省区[1]。海州常山夏季花朵洁白美丽,花期较长,秋冬亮蓝色的果实悬挂于枝头,是秋冬季节别具特色的观果植物,有较好的观赏性,且海州常山根系强壮,自然条件下在干旱瘠薄的砂石、石灰岩山地和贫瘠的山地野生分布,栽培管理简单,具有强的耐盐碱、抗旱、耐瘠薄、耐阴、抗有害气体等能力,可作为荒地与盐碱地的生态修复树种[2]。总体来说,海州常山是集观赏与优良抗性为一体的极具开发潜力的木本花卉。
然而,现在对海州常山的研究主要集中于种质资源收集[3]、快繁体系培育[4]、植物生理抗逆性[5]、药物成分开发[6]等,对于海州常山分子生物学的研究十分匮乏,海州常山内参基因的筛选及表达尚未见有文献发表,连对马鞭草科植物可稳定使用的内参基因筛选也是知之甚少。本研究对海州常山进行盐胁迫、干旱胁迫和热害胁迫,运用实时荧光定量PCR,并通过 GeNorm、NormFinder、BestKeeper 及ReFinder 软件综合分析,筛选出适合海州常山叶片非生物胁迫下使用的内参基因,为海州常山深入分析分子机制研究及优良的抗性基因开发奠定良好基础。
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样品 RNA 的浓度使用 Mettler 公司生产的核酸检测仪 UV5NANO 测定,样本浓度均在 432~1732 ng·mL−1 之间,OD260/280值在 1.8~2.0 之间,OD260/230≥2.0,用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检验 RNA 完整性,显示至少存在2条带,28 S 和 18 S 清晰,且 28 S/18 S ≈ 2,说明 RNA 质量达到荧光实时定量分析的要求。
共计筛选出 17 个候选内参基因,对 17 个内参基因进行荧光实时定量,基因的扩增产物长度为 112~246 bp,溶解曲线均为单一峰,扩增产物特异性高,符合筛选内参基因的要求。所有候选内参基因的 E 值(扩增效率)范围为 96.67%~99.68%,标准曲线的相关系数 R2为 0.986~0.999,综上所述 17 对引物的扩增效率较高(表1)。
表 1 17个候选内参基因引物及扩增效率
Table 1. 17 candidate internal reference gene primers and amplification efficiency
基因名称
Gene name基因缩写
Gene symbol引物(正向/反向)
Primer (forward/reverse)长度
Size/bp扩增效率
E/%线性相关
系数R2平均值
Ct肌动蛋白
(ACT)CtACT F: CGATTCTTGCTTCCCTCAGTA
R: ACCATTTTCGCCGCCTTA113 98.53 0.994 19.66 蛋白质磷酸酯酶
(Protein phosphatase 2)CtPP2A F: GGACAAGCACCAAGACGCC
R: TCAGCACTTCTAAAACCGCATC246 98.85 0.995 22.72 核糖体蛋白质
(Ribosomal protein l)CtRPL F: AGTCAATGGTGGCGATGTAGC
R: CCCTTGGTCACTCCGATAATGT123 97.82 0.991 22.85 磷酸甘油酸激酶
(Phosphoglycerate kinase)CtPK F: CTGAAGGTGGTGTACTCCTGCTC
R: CGAAACTGCCCCAACAAGATA233 98.34 0.993 23.23 18S核糖体RNA
(18S rRNA gene)Ct18S F: ACAATCACCGAACAAAGCAGC
R: CGAGAAGTAATCTTGGAACGCC237 96.67 0.986 25.20 ras核蛋白
(Ras-related nuclear protein)CtRAN F: GGAGACGACAGTTTGGGTGC
R: TGCCATACTTGCGGGTGAA163 98.11 0.992 25.91 腺嘌呤磷酸核糖转移酶
(Adenine phosphoribosy transferase)CtAPT F: CCACGCATTCAAGCCATTC
R: GAGCCTCTATCCCAGCAACG150 99.33 0.997 27.24 SAND家族蛋白基因
(SAND family protein gene)CtSAND F: GACCAGTCGCTTGATGCCC
R: GGATGCTCCAGGTACTGCTCTT122 98.90 0.995 26.45 肌动蛋白
(Profilin)CtPROF F: GAATGTGGTGTTTTGAGTGAGAGG
R: ATGTGAAGTTTTGGGGGA235 97.77 0.990 28.34 苹果酸脱氢酶
(Malate dehydrogenase)CtMDH F: ACCTGGAATGACGAGGGATG
R: GCCACAAACGTATTAGCTCTGACT231 99.26 0.997 23.36 延伸因子
(1-alphaElongation factor 1-alpha)CtEF-1A F: AGGATGGACAGACCCGTGAG
R: AAAACCAGAAATGGGGACAAAT203 99.68 0.999 22.37 泛素结合酶e2
(Ubiquitin-conjugating enzyme e2)CtUBCE2 F: GCAAAGGCTGATTGATGAGATTC
R: CCTCAACATTGTCTTGGGTGG131 98.51 0.994 22.22 衔接蛋白复合物-2
(Adaptor protein-2 complex)CtAP-2 F: CCACAACTAACGCCTCCACC
R: AAATTCACCCTCCGACTCCC191 99.63 0.998 23.48 热激蛋白70
(Heat shock protein 70)CtHSP70 F: GCCATTTTGAGTGGTGAGGG
R: GGTTGGTTGTCCGAGTAGGTAGA176 99.22 0.997 20.41 α微管蛋白
(Tubulin alpha)CtTUA F: GTCCCCAAAGATGTGAACGC
R: AAGCAGCCAAATCCTCCCTC213 97.89 0.991 23.21 泛素蛋白
(Protein ubiquitin)CtUBQ F: TGCTGTTGAGAAGGTGCTACG
R: CGAAAATGGTTGACGGGAC226 98.74 0.995 24.91 组蛋白h3
(Histone h3)CtH3 F: CAAGTTAAGCCCTTTCACCCC
R: TGCTCAGGATTTCAAGACGGA191 99.47 0.998 23.61 -
基因表达水平由周期阈值(Ct)决定,Ct值与基因表达量呈反比,从图1中可看出:这些候选基因显示出不同的表达水平,17个候选参考基因的Ct值分布均在15~35个循环之间,具体数值见表1。ACT、UBCE2和HSP70的表达量较高,且在不同样本中表达变化范围相对较小,表达较稳定;SAND、PROF的表达量较低;APT、H3和EF-1A在不同样本中表达变化范围相对较大,表达差异较大(图1)。
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GeNorm软件根据平均表达稳定指数(M)确定最稳定基因,M值的大小与基因稳定性呈反比,M值的阈值为1.5,超过1.5则视为不能选为内参基因。此外,GeNorm软件通过配对变异值(Vn/n + 1)计算最优内参基因的校准数量,若Vn/n + 1值小于0.15,则所需参考基因的数量为n,否则需引入的参考基因的数量为n + 1[9]。
从表2可看出:在盐害、干旱和热害胁迫中,M值均小于1.5,说明符合GeNorm软件筛选内参基因的标准。盐害胁迫中,RPL和AP-2基因最稳定,稳定值为0.132;干旱胁迫中,ACT和AP-2表现最稳定,稳定值为0.401;热害胁迫下EF-1A和UBCE2最稳定,稳定值为0.247。综合所有胁迫数据看,基因RPL和AP-2最稳定,稳定值为0.767,且V2/3均小于0.15,说明选用2个内参基因便可满足基因标准化的要求(图2)。
表 2 GeNorm软件分析结果
Table 2. GeNorm software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values1 RPL 0.132 ACT 0.401 EF-1A 0.247 RPL 0.767 2 AP-2 0.132 AP-2 0.401 UBCE2 0.247 AP-2 0.767 3 UBCE2 0.309 UBCE2 0.446 MDH 0.331 ACT 0.838 4 MDH 0.342 MDH 0.492 SAND 0.350 RAN 0.891 5 PK 0.394 UBQ 0.515 RPL 0.384 SAND 0.948 6 SAND 0.453 RAN 0.541 AP-2 0.453 MDH 0.997 7 RAN 0.487 PP2A 0.573 ACT 0.541 UBCE2 1.017 8 PP2A 0.515 HSP70 0.612 TUA 0.603 PP2A 1.051 9 UBQ 0.548 PK 0.667 PP2A 0.649 HSP70 1.086 10 ACT 0.571 APT 0.701 PK 0.698 TUA 1.121 11 PROF 0.591 TUA 0.737 APT 0.746 18S 1.163 12 TUA 0.627 RPL 0.760 RAN 0.786 UBQ 1.210 13 HSP70 0.677 SAND 0.786 18S 0.810 PROF 1.244 14 APT 0.715 18S 0.814 HSP70 0.860 APT 1.289 15 H3 0.770 EF-1A 0.861 PROF 0.921 EF-1A 1.333 16 EF-1A 0.831 PROF 0.907 UBQ 0.992 PK 1.396 17 18S 0.897 H3 1.008 H3 1.103 H3 1.493 -
NormFinder软件原理和GeNorm相似[10],通过计算稳定值排序得出基因的稳定性,稳定值较大的基因,稳定性较差。一般来说,NormFinder软件只计算一个最适的内参基因。在盐害胁迫中,基因RPL最稳定,稳定值为0.238,18S最不稳定,稳定值为1.283;干旱胁迫下,AP-2基因显示最稳定,稳定值为0.246,基因H3稳定性表现较差,稳定值为1.658;热害胁迫下,MDH基因最稳定,稳定值为0.155,H3表现出最不稳定的特性,稳定值为1.841;将所有胁迫实现综合来看,AP-2是最稳定的基因,稳定值为0.317,H3是最不稳定的基因,稳定值为2.252(表3)。总体来看,基因RPL、UBCE2、AP-2、MDH等基因在各个胁迫处理中,稳定性均排第一、第二位,相对稳定,H3基因稳定性总是排在较后的位置,稳定性较差,不适合作为海州常山内参基因使用。
表 3 NormFinder软件分析结果
Table 3. NormFinder software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values1 RPL 0.238 AP-2 0.246 MDH 0.155 AP-2 0.317 2 UBCE2 0.244 MDH 0.296 AP-2 0.219 UBCE2 0.361 3 AP-2 0.321 UBCE2 0.358 EF-1A 0.292 MDH 0.484 4 ACT 0.369 RAN 0.401 SAND 0.334 RPL 0.519 5 PP2A 0.388 ACT 0.421 UBCE2 0.351 SAND 0.583 6 MDH 0.415 PP2A 0.468 RPL 0.546 TUA 0.657 7 UBQ 0.483 UBQ 0.475 ACT 0.584 ACT 0.694 8 RAN 0.504 HSP70 0.610 TUA 0.617 RAN 0.710 9 PK 0.539 SAND 0.688 PP2A 0.651 PP2A 0.756 10 TUA 0.556 RPL 0.700 PK 0.737 APT 0.822 11 PROF 0.605 18S 0.768 APT 0.944 HSP70 0.898 12 SAND 0.639 APT 0.794 18S 1.018 PK 0.926 13 HSP70 0.783 PK 0.824 RAN 1.034 PROF 0.999 14 APT 0.793 TUA 0.831 PROF 1.042 18S 1.063 15 H3 1.040 PROF 1.081 HSP70 1.106 UBQ 1.108 16 EF-1A 1.213 EF-1A 1.167 UBQ 1.303 EF-1A 1.618 17 18S 1.283 H3 1.658 H3 1.841 H3 2.252 -
BestKeeper软件通过比较Ct值产生的相关系数(r)、变异系数(CV)和标准差(SD)来决定最优的内参基因,SV和SD越小,则稳定性较好[11],当SD > 1时,则该内参基因表达不稳定。与NormFinder软件相同,BestKeeper软件一次只能计算一个最适的内参基因。
在海州常山盐害胁迫处理中,基因ACT(SD = 0.26,CV = 为1.37)为最稳定的基因,干旱胁迫下最稳定的基因也是ACT(SD = 0.36,CV = 1.86),在热害胁迫下最稳的基因是AP-2(SD = 0.36,CV = 1.3);综合分析所有胁迫下数据发现,AP-2基因是最稳定的基因(SD = 0.64,CV = 2.73)(表4);相比较之下,基因H3在盐害胁迫、干旱胁迫、热害胁迫和所有胁迫数据处理中,SD和CV值都是最大的,最不稳定。
表 4 Bestkeeper软件分析结果
Table 4. Bestkeeper software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV1 ACT 0.26 1.37 ACT 0.36 1.86 AP-2 0.36 1.30 AP-2 0.64 2.74 2 UBCE2 0.27 1.23 UBCE2 0.44 1.98 UBCE2 0.36 1.53 ACT 0.65 2.68 3 RAN 0.33 1.31 AP-2 0.57 2.42 UBQ 0.37 1.58 UBCE2 0.67 2.82 4 RPL 0.34 1.48 UBQ 0.60 2.41 ACT 0.40 1.66 TUA 0.78 3.30 5 AP-2 0.36 1.60 MDH 0.64 2.77 TUA 0.45 1.69 SAND 0.83 3.16 6 TUA 0.36 1.52 PP2A 0.70 3.01 RAN 0.45 1.94 RPL 0.84 3.70 7 UBQ 0.36 1.46 APT 0.78 2.78 PP2A 0.66 2.80 UBQ 0.87 4.49 8 EF-1A 0.42 2.00 RAN 0.80 3.17 MDH 0.76 3.21 MDH 0.90 4.00 9 HSP70 0.49 2.54 EF-1A 0.85 4.10 PK 0.77 3.24 PP2A 0.95 4.19 10 PP2A 0.52 2.38 RPL 0.86 3.88 PROF 0.78 3.27 PROF 0.95 3.40 11 MDH 0.54 2.29 SAND 0.92 3.50 EF-1A 0.83 3.97 PK 0.99 4.37 12 18S 0.56 2.25 HSP70 0.93 4.38 RPL 0.84 3.60 18S 1.12 4.50 13 PK 0.61 2.74 TUA 0.93 4.01 SAND 0.88 3.70 HSP70 1.13 5.45 14 PROF 0.61 2.16 18S 0.94 3.69 HSP70 1.10 3.90 RAN 1.41 5.53 15 SAND 0.75 2.88 PK 1.02 4.37 18S 1.10 5.27 EF-1A 1.46 6.58 16 APT 0.89 3.19 PROF 1.05 3.75 APT 1.16 4.43 APT 1.73 6.26 17 H3 1.39 4.91 H3 1.30 5.86 H3 1.16 4.62 H3 1.97 8.17 -
3个软件分析的结果有相似也有不同,所以需要使用ReFinder 软件综合分析,对3个软件得出的基因稳定性排名值进行几何平均值分析,几何平均值越小则说明候选内参基因的稳定性较高。运用ReFinder软件综合分析得出(表5),盐害胁迫下,最稳定的基因是RPL和UBCE2,应选用这2个基因作为内参基因;干旱胁迫下,AP-2和ACT基因是排名第1、2位的基因,适合作为干旱胁迫下的内参基因;热害胁迫下,MDH和EF-1A是表达最稳定的基因。综合所有胁迫数据看,AP-2和UBCE2基因是排名最靠前的,而H3、EF-1A、PROF和18S基因都是排名较后的,不适合于作为海州常山胁迫的内参基因。
表 5 ReFinder软件综合分析结果
Table 5. Results of the comprehensive ReFinder software analysis
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average1 RPL 1.19 AP-2 1.32 MDH 2.06 AP-2 1.32 2 UBCE2 2.21 ACT 2.34 EF-1A 2.45 UBCE2 2.00 3 AP-2 2.59 UBCE2 2.71 UBCE2 2.78 MDH 2.06 4 MDH 5.42 MDH 2.99 AP-2 3.60 RPL 4.23 5 ACT 5.89 RAN 5.26 RPL 3.81 SAND 4.79 6 UBQ 6.03 UBQ 5.60 SAND 4.47 TUA 6.45 7 PP2A 6.62 PP2A 5.96 ACT 7.54 ACT 8.10 8 PROF 7.34 HSP70 9.03 TUA 8.49 RAN 9.05 9 RAN 8.18 APT 10.02 PROF 8.76 PP2A 9.67 10 PK 8.52 SAND 10.37 PP2A 9.58 APT 10.00 11 TUA 9.57 RPL 10.47 PK 10.47 PROF 10.43 12 SAND 9.66 PK 12.29 APT 11.68 HSP70 10.93 13 HSP70 12.98 18S 12.41 RAN 13.16 PK 11.72 14 APT 13.98 TUA 12.68 UBQ 13.45 UBQ 11.93 15 H3 14.74 H3 14.50 18S 13.63 18S 13.74 16 EF-1A 16.24 PROF 15.49 HSP70 14.74 EF-1A 16.00 17 18S 16.74 EF-1A 15.98 H3 14.89 H3 17.00 -
为了验证所筛选的参考基因,采用qRT-PCR检测了不同非生物胁迫条件下CtNHX1基因表达(图3)。CtNHX1基因的表达使用最稳定的参考基因组合进行标准化,并与最不稳定的参考基因H3进行比较。干旱胁迫,CtNHX1的表达量在0~2 h和12~24 h上调,其他时间内基因表达量下降。盐胁迫,CtNHX1在0~48 h内基因表达量上调,此后下调。热害胁迫,0~2 h,6~12 h,CtNHX1基因表达量上调,其余时间下调。当使用筛选出的稳定参考基因进行标准化时,基因表达水平显示出相似的趋势。然而,使用H3进行归一化会导致完全不同的结果,说明所筛选的内参基因可靠,可作为海州常山非生物胁迫下的内参基因使用。
海州常山叶片实时荧光定量PCR的内参基因选择
Selection of Reference Genes for Real-time Quantitative PCR in Clerodendrum trichotomum Thunb. Leaves
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摘要:
目的 通过实时PCR(qRT-PCR)筛选海州常山叶片不同非生物胁迫条件下稳定的内参基因。 方法 利用已有的转录组数据,筛选出17个候选内参基因,在不同非生物胁迫(盐害、干旱和热害)下进行qRT-PCR,通过利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ReFinder软件分析筛选不同胁迫中最适的内参基因,选择CtNHX1基因,验证所筛选的内参基因的稳定性。 结果 RPL、AP-2盐害胁迫下最稳定,MDH、AP-2干旱胁迫下最稳定,UBCE2、ACT热害胁迫下最稳定;综合来看,非生物处理中,AP-2、UBCE2是最稳定的参考基因。 结论 AP-2、UBCE2可作为海州常山叶片非生物胁迫研究中基因定量使用的内参基因,为进一步开展海州常山分子机制研究、耐盐基因的开发利用奠定基础。 Abstract:Objective To select the stable internal reference genes by real-time PCR (qRT-PCR) under different abiotic stress conditions in Clerodendrum trichotomum leaves. Method Based on previous transcriptome data, 17 reference genes were selected under different abiotic stresses (salt, drought and heat) for C. trichotomum. Four reference gene analysis software i.e. GeNorm, NormFinder, BestKeeper and ReFinder were used to select the optimal internal reference gene, to select the genes for Na + /H + Exchanger1 (ClNHX1) and to verify the stability of internal reference genes elected. Result Genes RPL and AP-2 were the most stable under salt stress; MDH and AP-2 were the most stable under drought stress; UBCE2 and ACT were the most stable under heat stress. For abiotic treatments, AP-2 and UBCE2 were the most stable reference genes. Conclusion AP-2 and UBCE2 can be used as internal reference genes for gene quantification in abiotic stress studies of C. trichotomum leaves. This study can provide reliable normalization for gene expression analysis and ensured more accurate data for further molecular mechanism research in C. trichotomum. -
Key words:
- Clerodendrum trichotomum
- / abiotic stress
- / reference genes
- / qRT-PCR
-
表 1 17个候选内参基因引物及扩增效率
Table 1. 17 candidate internal reference gene primers and amplification efficiency
基因名称
Gene name基因缩写
Gene symbol引物(正向/反向)
Primer (forward/reverse)长度
Size/bp扩增效率
E/%线性相关
系数R2平均值
Ct肌动蛋白
(ACT)CtACT F: CGATTCTTGCTTCCCTCAGTA
R: ACCATTTTCGCCGCCTTA113 98.53 0.994 19.66 蛋白质磷酸酯酶
(Protein phosphatase 2)CtPP2A F: GGACAAGCACCAAGACGCC
R: TCAGCACTTCTAAAACCGCATC246 98.85 0.995 22.72 核糖体蛋白质
(Ribosomal protein l)CtRPL F: AGTCAATGGTGGCGATGTAGC
R: CCCTTGGTCACTCCGATAATGT123 97.82 0.991 22.85 磷酸甘油酸激酶
(Phosphoglycerate kinase)CtPK F: CTGAAGGTGGTGTACTCCTGCTC
R: CGAAACTGCCCCAACAAGATA233 98.34 0.993 23.23 18S核糖体RNA
(18S rRNA gene)Ct18S F: ACAATCACCGAACAAAGCAGC
R: CGAGAAGTAATCTTGGAACGCC237 96.67 0.986 25.20 ras核蛋白
(Ras-related nuclear protein)CtRAN F: GGAGACGACAGTTTGGGTGC
R: TGCCATACTTGCGGGTGAA163 98.11 0.992 25.91 腺嘌呤磷酸核糖转移酶
(Adenine phosphoribosy transferase)CtAPT F: CCACGCATTCAAGCCATTC
R: GAGCCTCTATCCCAGCAACG150 99.33 0.997 27.24 SAND家族蛋白基因
(SAND family protein gene)CtSAND F: GACCAGTCGCTTGATGCCC
R: GGATGCTCCAGGTACTGCTCTT122 98.90 0.995 26.45 肌动蛋白
(Profilin)CtPROF F: GAATGTGGTGTTTTGAGTGAGAGG
R: ATGTGAAGTTTTGGGGGA235 97.77 0.990 28.34 苹果酸脱氢酶
(Malate dehydrogenase)CtMDH F: ACCTGGAATGACGAGGGATG
R: GCCACAAACGTATTAGCTCTGACT231 99.26 0.997 23.36 延伸因子
(1-alphaElongation factor 1-alpha)CtEF-1A F: AGGATGGACAGACCCGTGAG
R: AAAACCAGAAATGGGGACAAAT203 99.68 0.999 22.37 泛素结合酶e2
(Ubiquitin-conjugating enzyme e2)CtUBCE2 F: GCAAAGGCTGATTGATGAGATTC
R: CCTCAACATTGTCTTGGGTGG131 98.51 0.994 22.22 衔接蛋白复合物-2
(Adaptor protein-2 complex)CtAP-2 F: CCACAACTAACGCCTCCACC
R: AAATTCACCCTCCGACTCCC191 99.63 0.998 23.48 热激蛋白70
(Heat shock protein 70)CtHSP70 F: GCCATTTTGAGTGGTGAGGG
R: GGTTGGTTGTCCGAGTAGGTAGA176 99.22 0.997 20.41 α微管蛋白
(Tubulin alpha)CtTUA F: GTCCCCAAAGATGTGAACGC
R: AAGCAGCCAAATCCTCCCTC213 97.89 0.991 23.21 泛素蛋白
(Protein ubiquitin)CtUBQ F: TGCTGTTGAGAAGGTGCTACG
R: CGAAAATGGTTGACGGGAC226 98.74 0.995 24.91 组蛋白h3
(Histone h3)CtH3 F: CAAGTTAAGCCCTTTCACCCC
R: TGCTCAGGATTTCAAGACGGA191 99.47 0.998 23.61 表 2 GeNorm软件分析结果
Table 2. GeNorm software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values1 RPL 0.132 ACT 0.401 EF-1A 0.247 RPL 0.767 2 AP-2 0.132 AP-2 0.401 UBCE2 0.247 AP-2 0.767 3 UBCE2 0.309 UBCE2 0.446 MDH 0.331 ACT 0.838 4 MDH 0.342 MDH 0.492 SAND 0.350 RAN 0.891 5 PK 0.394 UBQ 0.515 RPL 0.384 SAND 0.948 6 SAND 0.453 RAN 0.541 AP-2 0.453 MDH 0.997 7 RAN 0.487 PP2A 0.573 ACT 0.541 UBCE2 1.017 8 PP2A 0.515 HSP70 0.612 TUA 0.603 PP2A 1.051 9 UBQ 0.548 PK 0.667 PP2A 0.649 HSP70 1.086 10 ACT 0.571 APT 0.701 PK 0.698 TUA 1.121 11 PROF 0.591 TUA 0.737 APT 0.746 18S 1.163 12 TUA 0.627 RPL 0.760 RAN 0.786 UBQ 1.210 13 HSP70 0.677 SAND 0.786 18S 0.810 PROF 1.244 14 APT 0.715 18S 0.814 HSP70 0.860 APT 1.289 15 H3 0.770 EF-1A 0.861 PROF 0.921 EF-1A 1.333 16 EF-1A 0.831 PROF 0.907 UBQ 0.992 PK 1.396 17 18S 0.897 H3 1.008 H3 1.103 H3 1.493 表 3 NormFinder软件分析结果
Table 3. NormFinder software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values基因
Gene稳定性M值
Stability values1 RPL 0.238 AP-2 0.246 MDH 0.155 AP-2 0.317 2 UBCE2 0.244 MDH 0.296 AP-2 0.219 UBCE2 0.361 3 AP-2 0.321 UBCE2 0.358 EF-1A 0.292 MDH 0.484 4 ACT 0.369 RAN 0.401 SAND 0.334 RPL 0.519 5 PP2A 0.388 ACT 0.421 UBCE2 0.351 SAND 0.583 6 MDH 0.415 PP2A 0.468 RPL 0.546 TUA 0.657 7 UBQ 0.483 UBQ 0.475 ACT 0.584 ACT 0.694 8 RAN 0.504 HSP70 0.610 TUA 0.617 RAN 0.710 9 PK 0.539 SAND 0.688 PP2A 0.651 PP2A 0.756 10 TUA 0.556 RPL 0.700 PK 0.737 APT 0.822 11 PROF 0.605 18S 0.768 APT 0.944 HSP70 0.898 12 SAND 0.639 APT 0.794 18S 1.018 PK 0.926 13 HSP70 0.783 PK 0.824 RAN 1.034 PROF 0.999 14 APT 0.793 TUA 0.831 PROF 1.042 18S 1.063 15 H3 1.040 PROF 1.081 HSP70 1.106 UBQ 1.108 16 EF-1A 1.213 EF-1A 1.167 UBQ 1.303 EF-1A 1.618 17 18S 1.283 H3 1.658 H3 1.841 H3 2.252 表 4 Bestkeeper软件分析结果
Table 4. Bestkeeper software analysis results
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV基因
Gene标准偏差
SD变异系数
CV1 ACT 0.26 1.37 ACT 0.36 1.86 AP-2 0.36 1.30 AP-2 0.64 2.74 2 UBCE2 0.27 1.23 UBCE2 0.44 1.98 UBCE2 0.36 1.53 ACT 0.65 2.68 3 RAN 0.33 1.31 AP-2 0.57 2.42 UBQ 0.37 1.58 UBCE2 0.67 2.82 4 RPL 0.34 1.48 UBQ 0.60 2.41 ACT 0.40 1.66 TUA 0.78 3.30 5 AP-2 0.36 1.60 MDH 0.64 2.77 TUA 0.45 1.69 SAND 0.83 3.16 6 TUA 0.36 1.52 PP2A 0.70 3.01 RAN 0.45 1.94 RPL 0.84 3.70 7 UBQ 0.36 1.46 APT 0.78 2.78 PP2A 0.66 2.80 UBQ 0.87 4.49 8 EF-1A 0.42 2.00 RAN 0.80 3.17 MDH 0.76 3.21 MDH 0.90 4.00 9 HSP70 0.49 2.54 EF-1A 0.85 4.10 PK 0.77 3.24 PP2A 0.95 4.19 10 PP2A 0.52 2.38 RPL 0.86 3.88 PROF 0.78 3.27 PROF 0.95 3.40 11 MDH 0.54 2.29 SAND 0.92 3.50 EF-1A 0.83 3.97 PK 0.99 4.37 12 18S 0.56 2.25 HSP70 0.93 4.38 RPL 0.84 3.60 18S 1.12 4.50 13 PK 0.61 2.74 TUA 0.93 4.01 SAND 0.88 3.70 HSP70 1.13 5.45 14 PROF 0.61 2.16 18S 0.94 3.69 HSP70 1.10 3.90 RAN 1.41 5.53 15 SAND 0.75 2.88 PK 1.02 4.37 18S 1.10 5.27 EF-1A 1.46 6.58 16 APT 0.89 3.19 PROF 1.05 3.75 APT 1.16 4.43 APT 1.73 6.26 17 H3 1.39 4.91 H3 1.30 5.86 H3 1.16 4.62 H3 1.97 8.17 表 5 ReFinder软件综合分析结果
Table 5. Results of the comprehensive ReFinder software analysis
排序
Ranking盐害胁迫
Salt stress干旱胁迫
Drought stress热害胁迫
Heatstress所有胁迫
Allstress基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average基因
Gene平均值
Average1 RPL 1.19 AP-2 1.32 MDH 2.06 AP-2 1.32 2 UBCE2 2.21 ACT 2.34 EF-1A 2.45 UBCE2 2.00 3 AP-2 2.59 UBCE2 2.71 UBCE2 2.78 MDH 2.06 4 MDH 5.42 MDH 2.99 AP-2 3.60 RPL 4.23 5 ACT 5.89 RAN 5.26 RPL 3.81 SAND 4.79 6 UBQ 6.03 UBQ 5.60 SAND 4.47 TUA 6.45 7 PP2A 6.62 PP2A 5.96 ACT 7.54 ACT 8.10 8 PROF 7.34 HSP70 9.03 TUA 8.49 RAN 9.05 9 RAN 8.18 APT 10.02 PROF 8.76 PP2A 9.67 10 PK 8.52 SAND 10.37 PP2A 9.58 APT 10.00 11 TUA 9.57 RPL 10.47 PK 10.47 PROF 10.43 12 SAND 9.66 PK 12.29 APT 11.68 HSP70 10.93 13 HSP70 12.98 18S 12.41 RAN 13.16 PK 11.72 14 APT 13.98 TUA 12.68 UBQ 13.45 UBQ 11.93 15 H3 14.74 H3 14.50 18S 13.63 18S 13.74 16 EF-1A 16.24 PROF 15.49 HSP70 14.74 EF-1A 16.00 17 18S 16.74 EF-1A 15.98 H3 14.89 H3 17.00 -
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