• 中国中文核心期刊
  • 中国科学引文数据库(CSCD)核心库来源期刊
  • 中国科技论文统计源期刊(CJCR)
  • 第二届国家期刊奖提名奖

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

河南省臭椿炭疽病病原鉴定

王树和 张佳正 何金鹤

引用本文:
Citation:

河南省臭椿炭疽病病原鉴定

    通讯作者: 王树和, wang_shuhe@163.com
  • 中图分类号: S432.1

Identification of the Pathogen Causing Anthracnose on Ailanthus altissima in Henan Province, China

    Corresponding author: WANG Shu-he, wang_shuhe@163.com ;
  • CLC number: S432.1

  • 摘要: 目的 鉴定引起河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园臭椿炭疽病病原菌,为该病害的防控提供依据。 方法 采用常规组织分离法进行病原分离,利用形态学和多基因系统发育分析相结合的方法对分离菌株鉴定并进行致病性测定。 结果 从病组织中共分离获得11株菌株,所有菌株在PDA培养基上菌落特征表现一致,正面菌落先白色后灰色,背面黑色,分生孢子为圆柱状,两端钝圆,单孢,无色,初步鉴定分离菌株为炭疽菌Colletotrichum spp.。选取代表菌株CH-1和CH-3接种臭椿叶片,有伤条件下接种均能引起臭椿叶片发病,发病叶片症状与田间一致,柯赫氏法则验证成立;经多位点基因(ITS、ACTTUB2CHS-1GAPDH)系统发育分析,发现分离菌株与果生炭疽菌C. fructicola聚集在同一个分支上,支持率达到99%。 结论 本研究首次采用形态学结合多基因系统发育研究,明确发生在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园的臭椿炭疽病为果生炭疽菌C. fructicola所致。
  • 图 1  叶片接种示意图

    Figure 1.  Schematic diagram of the protocol used to leaf inoculation

    图 2  臭椿炭疽病症状

    Figure 2.  Symptoms of anthracnose on Ailanthus altissima

    图 3  臭椿炭疽病病原菌的纯培养和形态特征

    Figure 3.  Morphology and cultural characteristics of Colletotrichum fructicola from Ailanthus altissima

    图 4  基于最大似然法构建臭椿炭疽病病原菌及其相关种的多基因系统发育树

    Figure 4.  Phylogenetic tree based on sequences of Colletotrichum isolates from Ailanthus altissima and related species using maximum likelihood method

    表 1  本研究中用于构建系统发育树的菌株信息及基因序列登记号

    Table 1.  Collection details and GenBank accession numbers of isolates used for phylogenetic analysis in this study

    种类
    Species
    菌株
    Isolates
    寄主
    Hosts
    基因序列登录号
    GenBank accession numbers
    ITSTUB2ACTGAPDHCHS-1
    CH-1 Ailanthus altissima MW380421 MW387023 MW387025 MW387027 MW387029
    CH-3 A. altissima MW380422 MW387024 MW387026 MW387028 MW387030
    Colletotrichum aenigma ICMP 18608 Perseaamericana JX010244 JX010389 JX009443 JX010044 JX009774
    C. aeschynomenes ICMP 17673 Aeschynomene virginica JX010176 JX010392 JX009483 JX009930 JX009799
    C. alatae ICMP 17919 Dioscoreaalata JX010190 JX010383 JX009471 JX010190 JX009837
    C. alienum ICMP 18691 P. americana JX010217 JX010385 JX009580 JX010018 JX009754
    C. asianum ICMP 18696 Mangiferaindica JX010192 JX010384 JX009576 JX009915 JX009753
    C. clidemiae ICMP 18706 Vitis vinifera JX010274 JX010439 JX009476 JX009909 JX009777
    C. fructicola ICMP 18581 Coffea arabica JX010165 JX010405 FJ907426 JX010033 JX009866
    C. fructicola ICMP 18613 Limonium sinuatum JX010167 JX010388 JX009491 JX009998 JX009772
    C.gloeosporioides ICMP 17821 Citrus sinensis JX010152 JX010445 JX009531 JX010056 JX009818
    C. horii ICMP 12942 Diospyros kaki GQ329687 JX010375 JX009533 JX010001 JX009748
    C. kahawae subsp. cigarro ICMP 18539 Olea europaea JX010230 JX010434 JX009523 JX009966 JX009800
    C.kahawae subsp. kahawae ICMP 17816 C. arabica JX010231 JX010444 JX009452 JX010012 JX009813
    C. musae ICMP 17817 Musa sapientum JX010142 JX010395 JX009432 JX010015 X009815
    C. nupharicola ICMP 18187 Nuphar lutea sub sp.
    polysepala
    JX010187 JX010398 JX009437 JX009972 JX009835
    C. queenslandicum ICMP 1778 Carica papaya JX010276 JX010414 JX009447 JX009934 JX009899
    C. salsolae ICMP 19051 Salsola tragus JX010242 JX010403 JX009562 JX009916 JX009863
    Colletotrichum siamense ICMP 12567 P. americana JX010250 JX010387 JX009541 JX009940 JX009761
    C. ti ICMP 4832 Cordyline sp. JX010269 JX010442 JX009520 JX009952 JX009898
    C. theobromicola CBS 124945 Theobroma cacao JX010294 JX010447 JX009444 JX010006 JX009869
    C. tropicale ICMP 18672 Litchi chinensis JX010275 JX010396 JX009480 JX010020 JX009826
    C. xanthorrhoeae ICMP 17903 Xanthorrhoeapreissii JX010261 KC790913 KC790635 JX009927 JX009823
    Glomerellacingulata f. sp. camelliae ICMP 10643 Camellia × williamsii JX010224 JX010436 JX009540 JX009908 X009891
    C. boninense ICMP 17904 Crinum asiaticum var. sinicum JX010292 HM585421 JX009583 JX009905 JX009827
    下载: 导出CSV
  • [1] 申洁梅, 刘占朝, 张万钦, 等. 臭椿研究综述[J]. 河南林业科技, 2008(4):27-29. doi: 10.3969/j.issn.1003-2630.2008.04.012

    [2]

    Zhang P Q, Liu Y J, Chen X, et al. Pollution resistance assessment of existing landscape plants on Beijing streets based on air pollution tolerance index method[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 132: 212-223. doi: 10.1016/j.ecoenv.2016.06.003
    [3] 李诗瑶, 牛玉斌, 樊 瑾, 等. 基于叶面微结构的火电厂周边绿化树种的滞尘能力分析[J]. 生态学杂志, 2020, 40(2):1-13.

    [4]

    Zhu T H, Wang Y F, Dong M, et al. A new tetracyclic triterpenoid from the fresh bark of Ailanthus altissima[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2020, 56: 477-480. doi: 10.1007/s10600-020-03066-3
    [5] 图斯库, 张树军, 李 涛, 等. 臭椿树根化学成分研究[J]. 中草药, 2015, 46(10):1426-1430. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.10.004

    [6] 王教敏. 两种臭椿病害诊断及其病原菌生物学和病理学特性[D]. 重庆, 西南大学, 2009.

    [7]

    Chen Y J, Qiao W J, Zeng L, et al. Characterization, pathogenicity, and phylogenetic analyses of Colletotrichum species associated with brown blight disease on Camellia sinensis in China[J]. Plant Disease, 2017, 101: 1022-1028. doi: 10.1094/PDIS-12-16-1824-RE
    [8]

    Torres-Calzada C, Tapia-Tussell R, Higuera-Ciapara I, et al. Characterization of Colletotrichum truncatum from papaya, pepper and physic nut based on phylogeny, morphology and pathogenicity[J]. Plant Pathology, 2018, 67(4): 8221-830.
    [9]

    Yan J, Jayawardena M M R S, Goonasekara I D, et al. Diverse species of Colletotrichum associated with grapevine anthracnose in China[J]. Fungal Diversity, 2015, 71(1): 233-246. doi: 10.1007/s13225-014-0310-9
    [10]

    Yang Y L, Liu Z Y, Cai L, et al. Colletotrichum anthracnose of Amaryllidaceae[J]. Fungal Diversity, 2009, 39: 123-146.
    [11]

    Zammouri S, Kalai-Grami L, Mnari-Hattab M. Optimization of simple DNA extraction method suitable for diverse microorganisms[J]. Tunisian Journal of Plant Protection, 2018, 13(2): 145-155.
    [12]

    White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. New York: Academic Press, 1990.315-322.
    [13]

    Carbone I, Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes[J]. Mycologia, 1999, 91(3): 553. doi: 10.1080/00275514.1999.12061051
    [14]

    Glass N L, Donaldson G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(4): 1323-1330. doi: 10.1128/aem.61.4.1323-1330.1995
    [15]

    O’Donnell K, Cigelnik E. Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1997, 7(1): 103-116. doi: 10.1006/mpev.1996.0376
    [16]

    Guerber J C, Liu B, Correll J C, et al. Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns, mtDNA and intron RFLPs, and mating compatibility[J]. Mycologia, 2003, 95(5): 872-895. doi: 10.1080/15572536.2004.11833047
    [17]

    Zhang D, Gao F, Jakovlic I, et al. PhyloSuite: An integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies[J]. Molecular Ecology Resources, 2020, 20(1): 348-355. doi: 10.1111/1755-0998.13096
    [18]

    Kumar S, Stecher G, Li M, et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution, 2018, 35(6): 1547-1549. doi: 10.1093/molbev/msy096
    [19]

    Cannon P F, Damm U, Johnston P R, et al. Colletotrichum-current status and future directions[J]. Studies in Mycology, 2012(73): 181-213.
    [20]

    Prihastuti H, Cai L, Chen H, et al. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand[J]. Fungal Diversity, 2009, 39: 89-109.
    [21]

    Weir B S, Johnston P R, Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology, 2012(73): 115-180.
    [22]

    Fu D D, Wang W, Qin R F, et al. Colletotrichum fructicola, first record of bitter rot of apple in China[J]. Mycotaxon, 2013, 126: 23-30. doi: 10.5248/126.23
    [23] 向梅梅, 张云霞, 刘 霄. 炭疽菌属真菌分类的研究进展[J]. 仲恺农业工程学院学报, 2017, 30(1):59-66. doi: 10.3969/j.issn.1674-5663.2017.01.012

    [24]

    Cai L, Hyde K D, Taylor P W J, et al. A polyphasic approach for studying Colletotrichum[J]. Fungal Diversity, 2009, 39: 183-204.
    [25]

    Guarnaccia V, Groenewald J Z, Polizzi G, et al. High species diversity in Colletotrichum associated with citrus diseases in Europe[J]. Persoonia, 2017, 39: 32-50. doi: 10.3767/persoonia.2017.39.02
    [26]

    Fu M, Crous P W, Bai Q, et al. Colletotrichum species associated with anthracnose of Pyrus spp. in China[J]. Persoonia, 2019, 42: 1-35. doi: 10.3767/persoonia.2019.42.01
    [27]

    Vieira W A D S, Bezerra P A, Silva A C D, et al. Optimal markers for the identification of Colletotrichum species[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2020, 143: 106694. doi: 10.1016/j.ympev.2019.106694
    [28]

    Jayawardena R S. Notes on currently accepted species of Colletotrichum[J]. Mycosphere, 2016, 7(8): 1192-1260. doi: 10.5943/mycosphere/si/2c/9
    [29]

    Damm U, Sato T, Alizadeh A, et al. The Colletotrichum dracaenophilum, C. magnum and C. orchidearum species complexes[J]. Studies in Mycology, 2019, 92: 1-46. doi: 10.1016/j.simyco.2018.04.001
    [30]

    Crous P W, Wingfield M J, Burgess T I, et al. Fungal planet description sheets: 716-784[J]. Persoonia, 2018, 40: 240-393.
    [31]

    Huang F, Chen G Q, Hou X, et al. Colletotrichum species associated with cultivated citrus in China[J]. Fungal Diversity, 2013, 61: 61-74. doi: 10.1007/s13225-013-0232-y
    [32]

    Wang H C, Huang Y F, Chen Q, et al. Anthracnose caused by Colletotrichum fructicola on Tobacco (Nicotiana tabacum) in China[J]. Plant Disease, 2016, 100(6): 1235-1236.
    [33]

    Braganca C A D, Silva L L, Oliveira S A S. First report of Colletotrichum fructicola causing anthracnose in Cassava (Manihot esculenta) in Brazil[J]. Plant Disease, 2016, 100(4): 857-858.
    [34]

    Wu C J, Chen H K, Ni H F. Identification and characterization of Colletotrichum species associated with mango anthracnose in Taiwan[J]. European Journal of Plant Pathology, 2018, 157(1): 1-15.
  • [1] 孟珂张亚波常君李志红王迪翟凤艳舒金平 . 8种杀菌剂对9种薄壳山核桃炭疽病病原菌的毒力测定. 林业科学研究, 2021, 34(1): 153-164. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2021.01.019
    [2] 刘在哲亓玉昆吕娟张玉娇张伟刘云付翠翠刘慇刘保友王清海 . 山东省侧柏枝枯病病原菌鉴定及其致病性测定. 林业科学研究, 2022, 35(4): 197-204. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2022.004.021
    [3] 吴鹏飞龚洪恩姚小华常维霞王开良 . 普通油茶无性系抗炭疽病评价. 林业科学研究, 2018, 31(4): 158-163. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.04.022
    [4] 邓全恩丁向阳徐建强李建安谷战英 . 柿炭疽病防治药剂的筛选. 林业科学研究, 2017, 30(1): 160-165. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.022
    [5] 吴丽云曹帮华黄彦新邵伟解文科李涛 . 滨海盐碱地刺槐臭椿混交林土壤酶活性季节动态研究. 林业科学研究, 2010, 23(6): 889-894.
    [6] 曹晓璐刘慧娟郭晓军姚娜李潞滨 . 兰花炭疽病拮抗细菌5A5-3菌株的初步筛选和鉴定. 林业科学研究, 2013, 26(5): 598-602.
    [7] 王军景河铭黄定芳 . 杉木炭疽病的发生规律及防治研究. 林业科学研究, 1996, 9(1): 97-100.
    [8] 张常青 . 普通油茶对炭疽病抗性的病理学研究. 林业科学研究, 1996, 9(4): 435-438.
    [9] 王军陈绍红黄永芳孙思 . 水杨酸诱导油茶抗炭疽病的研究. 林业科学研究, 2006, 19(5): 629-632.
    [10] 常明山邓艳廖旺姣苏全方小玉吴耀军 . 油茶不同品种抗炭疽病与相关酶活性关系的研究. 林业科学研究, 2018, 31(2): 141-146. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2018.02.020
    [11] 喻锦秀何振李密邬颖彭邵锋钟杰高必达 . 油茶炭疽病拮抗细菌P-14的拮抗物质分析. 林业科学研究, 2019, 32(1): 118-124. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.01.016
    [12] 程元淮稳霞姚艳霞林若竹刘忠军赵文霞 . 新疆巩留县杏果实斑点病病原菌鉴定. 林业科学研究, 2019, 32(2): 117-122. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.02.017
    [13] 邵淑霞杨子祥陈晓鸣 . 角倍中一种炭疽菌病害初报. 林业科学研究, 2012, 25(3): 351-354.
    [14] 郭立中邓先琼 . 杨梅腐烂病病原菌鉴定及杀菌剂筛选. 林业科学研究, 2006, 19(2): 241-245.
    [15] 郑华英钱国良徐福元胡白石张亚川解春霞许志刚 . 苏北杨树新造林地溃疡病病原菌的鉴定. 林业科学研究, 2010, 23(5): 649-655.
    [16] 耿显胜张威仲建平张守科舒金平 . 早竹丛枝病的调查及病原菌的分子鉴定. 林业科学研究, 2017, 30(5): 805-811. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.014
    [17] 翟立峰张美鑫赵行邓佳成 . 重庆樟树溃疡病病原菌的鉴定及序列分析. 林业科学研究, 2019, 32(3): 18-25. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2019.03.003
    [18] 杨莉杨双昱麻文建周建华 . 核桃褐斑病病原菌的分离鉴定和发病规律的调查. 林业科学研究, 2017, 30(6): 1004-1008. doi: 10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.017
    [19] 刘端冲杨金库林若竹姚艳霞淮稳霞赵文霞 . 金银花黑斑病病原菌番茄匍柄霉的分离与鉴定. 林业科学研究, 2023, 36(6): 30-39. doi: 10.12403/j.1001-1498.20230079
    [20] 马万里刘露汤子萱刘卓钟继芝尹福强刘铭 . 香樟叶斑病病原菌的鉴定、菌丝生长速率及防治药剂筛选研究. 林业科学研究, 2023, 36(5): 169-179. doi: 10.12403/j.1001-1498.20220585
  • 加载中
图(4) / 表(1)
计量
  • 文章访问数:  4770
  • HTML全文浏览量:  2759
  • PDF下载量:  59
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-22
  • 录用日期:  2021-04-19
  • 网络出版日期:  2021-08-03
  • 刊出日期:  2021-10-20

河南省臭椿炭疽病病原鉴定

    通讯作者: 王树和, wang_shuhe@163.com
  • 河南科技大学园艺与植物保护学院,河南 洛阳 471000

摘要:  目的 鉴定引起河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园臭椿炭疽病病原菌,为该病害的防控提供依据。 方法 采用常规组织分离法进行病原分离,利用形态学和多基因系统发育分析相结合的方法对分离菌株鉴定并进行致病性测定。 结果 从病组织中共分离获得11株菌株,所有菌株在PDA培养基上菌落特征表现一致,正面菌落先白色后灰色,背面黑色,分生孢子为圆柱状,两端钝圆,单孢,无色,初步鉴定分离菌株为炭疽菌Colletotrichum spp.。选取代表菌株CH-1和CH-3接种臭椿叶片,有伤条件下接种均能引起臭椿叶片发病,发病叶片症状与田间一致,柯赫氏法则验证成立;经多位点基因(ITS、ACTTUB2CHS-1GAPDH)系统发育分析,发现分离菌株与果生炭疽菌C. fructicola聚集在同一个分支上,支持率达到99%。 结论 本研究首次采用形态学结合多基因系统发育研究,明确发生在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园的臭椿炭疽病为果生炭疽菌C. fructicola所致。

English Abstract

  • 臭椿(Ailanthus altissima(Mill.)Swingle)为苦木科(Simaroubaceae)臭椿属落叶乔木,原产于中国北部及中部,全国各省区几乎都有分布[1]。臭椿树干高大挺拔,树皮光滑,树冠如伞状,极具观赏价值;而且该树种耐盐碱和干旱、抗烟尘和病虫害,是一种抗性极强的优良绿化树种[2-3]。因此,臭椿被广泛用于城市园林建设、山区植树造林和工矿区绿化,单独种植或与其它树种一起混种均可。除用于观赏绿化外,臭椿还是药用植物,其树皮、根皮及果实均可入药,具有重要的经济价值[4-5]

    2018年9月笔者在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园进行病害调查,发现臭椿炭疽病严重发生,一些植株病叶率达到70%以上。该病主要危害叶片,病斑褐色呈圆形或近圆形,边缘颜色较深,病斑中央坏死组织常脱落形成穿孔,后期造成臭椿大量落叶,严重影响树木生长和景观价值。王教敏[6]于2009报道了青岛地区发生的臭椿炭疽病,基于形态学和rDNA-ITS序列,鉴定分离菌株SQD-107为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)。本次调查观察到的臭椿炭疽病与王教敏[6]描述的症状存在着较为明显的差异,发病后期多数病斑形成穿孔。本研究拟采用形态学与多基因系统发育分析相结合的方法,对该地区臭椿炭疽病病原菌鉴定,并经柯赫氏法则验证,以期为该病害防治策略的制定提供参考。

    • 臭椿炭疽病病叶采集于河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园。致病性测定的臭椿健康叶片采集于河南科技大学校园。

    • 参照Chen等[7]病原组织分离法分离病原菌,分离的菌株单孢纯化后,保存于PDA斜面上,置4℃冰箱中保存备用。

    • 分离菌株CH-1和CH-3用于接种试验,参照Torres-Calzada等[8]的方法进行有伤和无伤接种(图1),将采集的臭椿健康叶片用0.5% NaClO表面消毒,无菌水冲洗3次,叶面水分晾干后进行接种。有伤接种时用无菌接种针刺伤叶片,移液枪吸取供试菌株分生孢子悬浮液20 μL(浓度为1 × 106个·mL−1)滴在叶片刺伤部位,对照处理接种20 μL无菌水;无伤接种对健叶未进行刺伤,其余操作同有伤接种。每个处理接种10片叶子,试验重复2次。接种后的叶片放置于加有湿润滤纸的保鲜盒内,在叶柄处包裹脱脂棉并滴加无菌水,将装有叶片保鲜盒置于培养箱内,培养条件为:温度25℃,12 h光暗交替。逐日观察叶片的发病情况,接种叶片发病后再进行分离培养,完成柯赫氏法则的验证。

      图  1  叶片接种示意图

      Figure 1.  Schematic diagram of the protocol used to leaf inoculation

    • 参照Yan等[9]描述的方法进行形态学鉴定。在光学显微镜(Leica DM2500,Germany)下观察分生孢子梗、分生孢子、子囊、子囊孢子等微观形态,并测量分生孢子和子囊孢子(n = 50)的大小。依照Yang等[10]描述的方法诱导分生孢子附着胞的产生,观察记录附着胞形态特征并测量其大小(n = 30)。

    • 采用改良CTAB法[11]提取菌株CH-1和CH-3基因组DNA。使用rDNA-ITS通用引物ITS5/ITS4[12]、肌动蛋白(actin,ACT)引物ACT-512F/ACT-783R[13]、β-微管蛋白(beta-tubulin 2,TUB2)引物TUBT1/TUB2b[14-15]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物GDF1/GDR1[16]和几丁质合成酶(chitin synthase,CHS-1)引物CHS-79F/CHS-345R[13]对病原菌基因组DNA进行扩增。

      PCR扩增得到的目的片段通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后委托北京擎科生物技术公司进行测序。测序结果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST比对,根据比对结果下载参比序列(表1),使用PhyloSuite软件中MAFFA插件对建树序列进行多重比对[17],必要时进行手工校正。比对后的基因序列在PhyloSuite软件中按照ACTTUB2CHS-1GAPDH和ITS的顺序串联整合成一个多基因数据集[17],基因序列合并的数据集在MEGA X软件中采用最大似然法(maximum likelihood,ML)并选用TN93+G核苷酸替代模型构建系统进化树,各分支节点的置信值通过1000次自举(Bootstrap)抽样进行评估[18]

      表 1  本研究中用于构建系统发育树的菌株信息及基因序列登记号

      Table 1.  Collection details and GenBank accession numbers of isolates used for phylogenetic analysis in this study

      种类
      Species
      菌株
      Isolates
      寄主
      Hosts
      基因序列登录号
      GenBank accession numbers
      ITSTUB2ACTGAPDHCHS-1
      CH-1 Ailanthus altissima MW380421 MW387023 MW387025 MW387027 MW387029
      CH-3 A. altissima MW380422 MW387024 MW387026 MW387028 MW387030
      Colletotrichum aenigma ICMP 18608 Perseaamericana JX010244 JX010389 JX009443 JX010044 JX009774
      C. aeschynomenes ICMP 17673 Aeschynomene virginica JX010176 JX010392 JX009483 JX009930 JX009799
      C. alatae ICMP 17919 Dioscoreaalata JX010190 JX010383 JX009471 JX010190 JX009837
      C. alienum ICMP 18691 P. americana JX010217 JX010385 JX009580 JX010018 JX009754
      C. asianum ICMP 18696 Mangiferaindica JX010192 JX010384 JX009576 JX009915 JX009753
      C. clidemiae ICMP 18706 Vitis vinifera JX010274 JX010439 JX009476 JX009909 JX009777
      C. fructicola ICMP 18581 Coffea arabica JX010165 JX010405 FJ907426 JX010033 JX009866
      C. fructicola ICMP 18613 Limonium sinuatum JX010167 JX010388 JX009491 JX009998 JX009772
      C.gloeosporioides ICMP 17821 Citrus sinensis JX010152 JX010445 JX009531 JX010056 JX009818
      C. horii ICMP 12942 Diospyros kaki GQ329687 JX010375 JX009533 JX010001 JX009748
      C. kahawae subsp. cigarro ICMP 18539 Olea europaea JX010230 JX010434 JX009523 JX009966 JX009800
      C.kahawae subsp. kahawae ICMP 17816 C. arabica JX010231 JX010444 JX009452 JX010012 JX009813
      C. musae ICMP 17817 Musa sapientum JX010142 JX010395 JX009432 JX010015 X009815
      C. nupharicola ICMP 18187 Nuphar lutea sub sp.
      polysepala
      JX010187 JX010398 JX009437 JX009972 JX009835
      C. queenslandicum ICMP 1778 Carica papaya JX010276 JX010414 JX009447 JX009934 JX009899
      C. salsolae ICMP 19051 Salsola tragus JX010242 JX010403 JX009562 JX009916 JX009863
      Colletotrichum siamense ICMP 12567 P. americana JX010250 JX010387 JX009541 JX009940 JX009761
      C. ti ICMP 4832 Cordyline sp. JX010269 JX010442 JX009520 JX009952 JX009898
      C. theobromicola CBS 124945 Theobroma cacao JX010294 JX010447 JX009444 JX010006 JX009869
      C. tropicale ICMP 18672 Litchi chinensis JX010275 JX010396 JX009480 JX010020 JX009826
      C. xanthorrhoeae ICMP 17903 Xanthorrhoeapreissii JX010261 KC790913 KC790635 JX009927 JX009823
      Glomerellacingulata f. sp. camelliae ICMP 10643 Camellia × williamsii JX010224 JX010436 JX009540 JX009908 X009891
      C. boninense ICMP 17904 Crinum asiaticum var. sinicum JX010292 HM585421 JX009583 JX009905 JX009827
    • 该病害主要危害叶片,发病初期在叶片上可见褐色小点,扩展以后形成浅褐色圆形或近圆形病斑,病斑边缘颜色较深,发病后期在叶片病健交界处产生一圈裂纹,病斑中央组织脱落可形成穿孔。有时多个病斑相互愈合形成大斑,脱落后形成大的穿孔(图2A)。

      图  2  臭椿炭疽病症状

      Figure 2.  Symptoms of anthracnose on Ailanthus altissima

      致病性测定结果显示,有伤接种条件下供试菌株CH-1和CH-3均可使臭椿叶片发病(图2B2C),接种1~2 d后在接种部位可见褐色斑点,接种5~7 d后一些病斑在病健交接处产生离层,进一步发展形成穿孔症状(图2B2C),与自然发病症状完全相同。发病组织再分离,获得分离物经鉴定与接种菌株相同,由此证明分离获得的菌株为致病菌。无伤接种和对照未见发病。

    • 从河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园采集的臭椿病叶样品中分离获得11个菌株,所有菌株在PDA上菌落表现一致,菌落平整且边缘整齐,气生菌丝较密,棉絮状,菌落初始为白色,几天后菌落中间出现灰绿色(图3A),背面有黑色素沉积(图3B)。25℃培养5 d的菌落直径为6.18 ± 0.67 cm。菌落上产生的分生孢子堆白色到浅黄色,显微镜检可见分生孢子为圆柱状,两端钝圆,单孢,无色(图3C),孢子大小(12.01~18.10)µm ×(4.66~6.90)µm,平均长14.55 ± 1.22 µm,宽5.79 ± 0.44 µm。附着胞浅至深棕色,椭圆形或近球形(图3D3E),大小(6.20~7.96)µm ×(4.68~6.79)µm,平均长7.85 ± 1.12 µm,宽5.62 ± 0.49 µm。在PDA上培养15 d左右可形成子囊壳,子囊棍棒状,内含8个子囊孢子,子囊孢子梭状,两端钝圆,稍弯曲(图3F3G),子囊孢子大小(13.83~22.53)µm ×(4.05~6.29)µm,平均长18.35 ± 1.65 µm,宽5.20 ± 0.53 µm。根据形态学和培养特征初步鉴定分离菌株为炭疽菌(Colletotrichum spp.)。[19-20]

      图  3  臭椿炭疽病病原菌的纯培养和形态特征

      Figure 3.  Morphology and cultural characteristics of Colletotrichum fructicola from Ailanthus altissima

    • 对菌株CH-1和CH-3的ITS、ACTTUB2GAPDHCHS-1基因进行扩增和测序,得到大小分别为557 bp、289 bp、722 bp、280 bp和299 bp的特异性片段。将序列提交至GenBank数据库(表1),通过BLAST搜索和比对,结果显示菌株CH-1和CH-3的ITS和ACT基因序列与胶孢炭疽菌复合种(C. gloeosporioides species complex)内的多个种序列相似性达到99%以上;菌株CH-1和CH-3的TUB2GAPDHCHS-1基因序列与果生炭疽菌(C. fructicola)序列相似性达到99%以上。从NCBI 上选取相关序列联合构建系统发育树,以C. boninense为外群,进行多基因系统发育分析,结果显示,供试菌株CH-1和CH-3与果生炭疽菌(C. fructicola)聚于同一分支,自展支持率为99%(图4)。结合形态学特征和多基因系统发育分析,最终鉴定在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园发生的臭椿炭疽病病原菌为果生炭疽菌(C. fructicola[21-22]

      图  4  基于最大似然法构建臭椿炭疽病病原菌及其相关种的多基因系统发育树

      Figure 4.  Phylogenetic tree based on sequences of Colletotrichum isolates from Ailanthus altissima and related species using maximum likelihood method

    • 本研究在河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园进行病害调查,发现臭椿炭疽病严重发生,对发病叶片进行病原菌分离,共获得到11个分离物,它们在PDA上菌落特征表现一致,正面菌落先白色后灰色,背面黑色。菌落上产生的分生孢子堆白色到浅黄色,分生孢子圆柱状,两端钝圆,单孢,无色。由于炭疽菌属(Colletotrichum)内种类繁多、形态简单,能够用于形态鉴定的特征较少,造成其种间界限不明确、分类鉴定困难[19, 23]。通过形态学难以确认11个分离物确切的种,初步鉴定为炭疽菌(Colletotrichum spp.)。

      近年来,分子生物学技术在真菌分类鉴定中的应用,对炭疽菌属的分类鉴定方法产生了深刻影响[19, 24]。rDNA-ITS序列分析是炭疽菌分子鉴定中应用最早、最多的方法,为许多物种的鉴定及系统进化分析提供了有力工具[23-24]。研究发现,仅基于rDNA-ITS序列并结合形态特征进行系统进化分析或物种鉴定存在一定的局限性,对于一些近缘相似种和复合种,仍不能准确反映和有效识别其亲缘关系[19, 24]。目前,基于形态学和多基因序列的系统发育分析方法被众多研究者接受[25-27]。随着炭疽菌多基因系统学研究的深入,将炭疽菌属真菌划分为14个复合种(C. acutatumC. boninenseC. caudatumC. dematiumC. destructivumC. dracaenophiluC. gigasporumC. gloeosporioidesC. graminicolaC. magnumC. orbiculareC. orchidearumC. spaethianumC. truncatum)和部分独立种[19, 28-29]。Weir等采用ITS、ACTCALCHS-1GAPDH基因对大量炭疽菌株进行多基因序列分析和形态学鉴定,明确了C. gloeosporioides复合种内包含了22个种和1个亚种[21]。目前,C. gloeosporioides复合种已接受41个合格种,其中大多数为植物病原菌[21, 25, 28, 30]。本研究中对分离菌株进行形态学观察和多基因(ITS、ACTTUB2GAPDHCHS-1)系统发育分析的结果显示,它们均为C. gloeosporioides复合种内的果生炭疽菌(C. fructicola)。

      果生炭疽菌(C. fructicola)首次在泰国咖啡果实上发现[20],之后陆续报道该病菌可侵染多种经济作物,如梨[21]、苹果[22]、柑橘[31]、烟草[32]、木薯[33]和芒果[34]等,引起叶片坏死和果实腐烂。Weir等[21]研究发现果生炭疽菌具有明显的地域多样性和生物多样性,仅依赖形态学特征或rDNA-ITS序列均很难对其准确鉴定。目前,推荐使用多基因序列的系统发育分析对其进行准确鉴定[21, 27]

    • 本研究对采自河南省洛阳市嵩县天池山国家森林公园的臭椿炭疽病样品进行了病原菌分离与纯化,致病性测定证明分离物可侵染臭椿叶片,并引起与林间症状一致的炭疽病;病原菌形态特征观察及多位点基因(ITS、ACTTUB2CHS-1GAPDH)系统发育分析表明,引起该地区臭椿炭疽病的病原菌为果生炭疽菌(C. fructicola)。该研究结果可为深入研究臭椿炭疽病的发生流行规律以及制定防治策略奠定基础。

参考文献 (34)

目录

    /

    返回文章
    返回