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植物内生菌(Endophytes)是指某一阶段或所有阶段生活在健康植物的组织或器官中,与植物建立特殊的相互关系,并不会对宿主引起明显病害的一类微生物[1]。据报道,植物内生菌作为一种新兴微生物资源,对植物的生长和健康至关重要[2],且在医学、农业、工业等领域具有潜在的应用前景[3]。
种子是植物的重要繁殖器官,是遗传信息的保存和传递者,其内携带丰富多样的微生物[4-5]。种子内生菌主要包括多种真菌和细菌,能从不同环境(如空气、水、昆虫)通过水平传播获得,同时也能从母株通过垂直传播获得,并代代相传[6-7]。种子中常见真菌属有链格孢属(Alternaria)、枝孢霉属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)等[8];常见细菌属有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、泛菌属(Pantoea)等[9];而种子内生菌的群落组成和多样性常受多种生物与非生物因素的影响,如植物品种、基因型、种子成熟过程、地理位置及病原体入侵等[10-12]。研究表明,种子作为微生物的载体会因自身及特殊的生存环境在内部形成独特的微生物群落,这些特殊类群可为宿主植物提供保护功能[13]。当种子内生菌作为益生微生物资源,能通过直接(如固氮、溶磷和产生植物激素)或间接作用(对抗植物病害、提高植物抗逆性和生物与非生物的耐受性)促进种子的萌发和幼苗的建立[8,14-16]。除此之外,种子相关内生菌可以产生与宿主次级代谢成分相同或者相似的化合物,它们能调控宿主植物的次级代谢,促进有效成分的合成与积累。陈海敏等发现,种子中的草茎点霉(Phoma herbarum )D603可以有效促进丹参根部丹参酮类成分,尤其是丹参酮IIA的合成与积累[17]。然而,并非所有的微生物都是有益的,种子携带的一些病原菌会降低种子活力、抑制种子萌发和引起植物病害,进而对粮食作物和林木安全生产造成威胁。因此,了解种子相关的微生物群落组成和功能可以帮助我们了解种子健康,防止有害微生物的影响,并充分利用与种子相关的有益微生物。
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是我国特有的药用和经济树种,作为药材,具有降压、增强免疫力、降血糖等药理作用;杜仲果、叶、皮中均含有丰富的杜仲橡胶,且杜仲果实富含油脂,是开发保健品、功能食品、高档食用油的优质原料。前期研究发现,杜仲的不同组织中都伴有丰富的内生微生物,并且这些微生物与宿主健康、生产力和药用成分的合成和积累有关。杨娟等研究表明,杜仲树皮中的某些真菌类群与树皮的药理活性成分成正相关[18]。Dong等通过探究杜仲树皮中细菌群落组成和核心微生物群的功能,发现细菌菌群中的大部分核心菌群与树皮的药理活性成分相关[19]。然而,迄今为止,大多数相关研究通常集中在根际、茎、叶,对于杜仲种子相关微生物的组成结构以及生态功能的了解仍然知之甚少。因此,本研究结合分离培养法和高通量测序技术对杜仲种子内生真菌和细菌群落组成结构和多样性进行探究。同时,利用FUNGuild 和FAPROTAX平台进行功能注释。高通量测序技术能更加全面的揭示杜仲种子内生菌群落组成和多样性,可培养法可以分离获得实体菌株,这2种方法的结合能全面认识杜仲种子微生物,丰富杜仲相关微生物资源,并为今后杜仲种子内生菌的功能研究以及杜仲的高效栽培提供参考依据。
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传统培养法获得的杜仲种子微生物群落组成(表1)表明:采用分离培养法共获得真菌40株,初步鉴定为3门、5纲、8目、10科、11属、18种。在门水平,杜仲种子中可培养真菌归为3个门:子囊菌门(Ascomycota)(87.50%)、担子菌门(Basidiomycota)(10%)、毛霉门(Mucoromycota)(2.50%),其中,子囊菌门(Ascomycota)为主要优势菌门,其次为担子菌门(Basidiomycota)。在纲水平,散囊菌纲(Eurotiomycetes)为主要优势菌纲,占比52.50%;其次为座囊菌纲(Dothideomycetes)(22.50%)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)(12.50%)、伞菌纲(Agaricomycetes)(10%)以及占比为2.50%的毛霉纲(Mucoromycetes)。在属水平,以曲霉属(Aspergillus)(30%)、链格孢属(Alternaria)(12.50%)为主要优势属,随后是占比均为10%的青霉属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)、烟管菌属(Bjerkandera),枝孢霉属(Cladosporium)(7.50%)和节菱孢菌属(Arthrinium)(7.50%)较为常见。在种水平上,烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(12.50%)、交链格孢(Alternaria alternata)(10%) 、艾米斯托克蓝状菌(Talaromyces amestolkiae)(10%)占据一定优势。
表 1 杜仲种子可培养内生真菌和细菌的群落组成
Table 1. Composition of culturable endophytic fungi and bacteria from Eucommia ulmoides seeds
分类
Classify门
Phylum纲
Class属
Genus种
Spices株数
Number真菌
Fungi毛霉门 Mucoromycota 毛霉纲 Mucoromycetes 小克银汉霉属 Cunninghamella 刺孢小克银汉 C. echinulata 1 子囊菌门
Ascomycota散囊菌纲 Eurotiomycetes 曲霉属 Aspergillus 赭曲霉菌 A. westerdijkiae 1 黄曲霉 A. flavus 2 烟曲霉 A. fumigatus 5 杂色曲霉 A. versicolor 3 晶状体曲霉 A. lentulus 1 青霉属 Penicillium 布雷正青霉 P. glaucoroseum 1 产黄青霉 P. chrysogenum 2 霍迪青霉 P. hordei 1 篮状菌属 Talaromyces 艾米斯托克蓝状菌 T. amestolkiae 4 枝孢瓶霉属 Cladophialophora 卡氏枝孢瓶霉 C. carrionii 1 座囊菌纲 Dothideomycetes 链格孢属 Alternaria 细极链格孢 A. tenuissima 1 交链格孢 A. alternata 4 黑团孢属 Periconia 油棕黑团孢 P. elaeidis 1 枝孢霉属 Cladosporium 耐盐枝孢霉 C. halotolerans 3 粪壳菌纲 Sordariomycetes 节菱孢菌属 Arthrinium 节菱孢 A. arundinis 3 木霉属 Trichoderma 滩涂木霉 T. arenarium 2 担子菌门 Basidiomycota 伞菌纲 Agaricomycetes 烟管菌属 Bjerkandera 烟管菌 B. adusta 4 细菌
Bacteria厚壁菌门
Firmicutes芽孢杆菌纲
BacilliPeribacillus P. huizhouensis 10 P. simplex 8 芽孢杆菌属 Bacillus 解蛋白芽孢杆菌 B. proteolyticus 4 芽孢杆菌 Bacillus sp. 1 Cytobacillus C. firmus 14 哥特氏芽孢杆菌 C. gottheilii 2 Metabacillus M. indicus 4 M. litoralis 1 土壤芽孢杆菌属 Solibacillus 森林土壤芽孢杆菌 S. silvestris 53 土壤芽孢杆菌 Solibacillus sp. 14 unclassified Paenibacillaceae P. bacterium 31 杜仲种子中分离到内生细菌共142株,隶属于1门(厚壁菌门(Firmicutes))1纲(芽孢杆菌纲(Bacilli))1目(芽孢杆菌目(Bacillales))5科6属(含1个未定属)11种(含2个未定种)。6个属中,土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)以47.18%的相对多度占据优势地位,其次为类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)中一未定属 (21.83%)、Peribacillus(12.67%)和Cytobacillus(11.27%)。在种水平,森林土壤芽孢杆菌(Solibacillus silvestris)(37.32%)在整个细菌菌群中占有绝对优势,类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)中一未定属(21.83%)、坚强芽孢杆菌(Cytobacillus firmus)(9.86%)和一种土壤芽孢杆菌(Solibacillus sp.)(9.86%)次之。此外,Peribacillus huizhouensis(7.04%)和Peribacillussimplex(5.63%)也占据较高比例。
高通量测序获得的杜仲种子微生物群落组成:对杜仲种子内生真菌和细菌测序获得平均有效序列分别为64 368条、40 121条,平均长度为234、376 bp。杜仲种子内生真菌归为141个OTUs,包括6门、15纲、38目、76科、101属。在门水平,内生真菌隶属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、鞭毛菌门(Mortierellomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和未分类真菌 6大类,其中,子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)为主要优势门,分别占比47.56%和46.91%;在属水平,主要包括 Apiotrichum、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和Leucosporidium等15个优势属,其中Apiotrichum(31.28%)和德巴利氏酵母属(Debaryomyces)(26.07%)占有绝对优势,为主要优势属(图1a)。其余优势属如Leucosporidium、Kernia、青霉属(Penicillium)等总占比为30.04%。常见属如链格孢属(Alternaria)(0.87%)也占据较高比例。
图 1 杜仲种子内生真菌(a)和细菌(b)优势属的群落组成及相对丰度
Figure 1. Community composition and relative abundance of dominant genera of endophytic fungi (a) and bacteria (b) in E. ulmoides seeds.
杜仲种子内生细菌归为442个OTUs,包括24门、46纲、117目、193科、313属。在门水平,内生细菌隶属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)和蓝细菌(Cyanobacteria)等24大类,其中,优势门主要为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),分别占比52.49%和17.22%;随后为拟杆菌门(Bacteroidota)(10.72%)、放线菌门(Actinobacteriota)(10.55%);在纲水平,以 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(33.68%),α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)(18.81%)为优势纲;在属水平,所有类群主要归为假单胞菌属(Pseudomonas )、乳杆菌属(Lactobacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)等13个优势属,主要优势类群为假单胞菌属(Pseudomonas )(16.66%),其次为乳杆菌属(Lactobacillus )(9.68%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas )(8.22%)(图1b)。
综上表明,与传统培养法相比,高通量测序技术能获得更多种类和数量的杜仲种子内生真菌和细菌。
从门水平上分析,2种方法获得的优势真菌都主要集中在子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota),但其占比不同;高通量测序获得的优势细菌主要集中在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),而可培养法主要分离到厚壁菌门(Firmicutes)的细菌。而从属水平上分析发现,高通量获得的菌株,如优势真菌青霉属( Penicillium )、曲霉属( Aspergillus )、枝孢霉属( Cladosporium )可通过可培养法获得,并同样占据优势地位(表1和图1)。另外,以上结果还可看出,高通量测序法获得的大部分菌株都属于未被培养的菌株。因此,2种方法的结合能更加全面的揭示杜仲相关内生菌的组成和结构。
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在α多样性指数中,Margalef指数、Chao 1和ACE指数表示微生物群落的丰富度,值越大,丰富度越高。Shannon 和Simpson指数表示微生物群落的多样性程度,Shannon指数值越大,多样性越高,而Simpson指数值越小,多样性越大。在97%相似性下,分析杜仲种子内生真菌和内生细菌的多样性指数(表2)。α多样性指数分析结果表明,与传统培养法相比,高通量测序技术得到的多样性指数Shannon、高通量测序技术能更完整的展现出杜仲种子中微生物群落的丰富度和多样性。
表 2 杜仲种子内生真菌和细菌群落的多样性
Table 2. Diversity of endophytic fungi and bacteria in E. ulmoides seeds
分类
Classify可培养 Culture 免培养 Non-Culture Margalef Shannon Simpson ACE Chao 1 Shannon Simpson 真菌 Fungi 9.26±1.14 2.94±0.28 0.98±0.01 59.83±15.14 59.67±15.18 2.39±0.2 0.20±0.03 细菌 Bacteria 2.80±0.13 2.66±0.21 0.91±0.04 233.30±85.79 223.01±84.83 3.93±0.2 0.06±0.02 -
使用FUNGuilds平台对杜仲种子内真菌类群的营养型和生态功能类群进行分析,其中,110个OTUs被成功注释,营养型包括腐生型(Saprotroph)(95 OTUs,82.97%)、致病-腐生-共生型(Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph)(18 OTUs,6.10%)、致病型(Pathotroph)(12 OTUs,2.41%)、致病-腐生型(Pathotroph-Saprotroph)(7 OTUs,6.60%)、腐生-共生型(Saprotroph-Symbiotroph)(6 OTUs,0.63%)、共生型(Symbiotroph)(4 OTUs,0.34%)、致病-共生型(Pathotroph-Symbiotroph)(3 OTUs,0.83%)、致病-腐生-共生型(Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph)(1 OTU,0.11%)8大类。除未定类群(unknow),所有真菌类群主要涉及到未定义腐生菌(Undefined Saprotroph)(48 OTUs,33.83%)、植物病原菌(Plant Pathogen)(5 OTUs,0.49%)、动物病原菌(Animal Pathogen)(5 OTUs,1.28%)、木质腐生菌(Wood Saprotroph)(4 OTUs,0.45%)、真菌寄生菌(Fungal Parasite)(2 OTUs,0.27%)、粪生真菌(Dung Saprotroph)(2 OTUs,0.21%)、丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal fungi)(2 OTUs,0.06%)、土壤腐生菌(Soil Saprotroph)(1 OTU,31.28%)、地衣(Lichenized fungi)(1 OTU,0.16%)、外生菌根(Ectomycorrhizal fungi)(1 OTU,0.07%)10类生态功能类群。此外,还包括多种混合功能类群如真菌寄生-未定义腐生菌(Fungal Parasite-Undefined Saprotroph)(4 OTUs,1.51%)、内生菌-地衣腐生菌-土壤腐生菌-未定义腐生菌(Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph)(4 OTUs,0.48%)、内生菌-植物病原菌(Endophyte-Plant Pathogen)(2 OTUs,0.21%)等21类。31个OTUs在FUNGuilds数据库中未能注释到对应功能。整体来看,在OTU水平上杜仲种子内的真菌功能群主要集中于未定义腐生菌(48 OTUs)、植物病原菌(5 OTUs)、动物病原菌(5 OTUs)(图2a)。在属水平,物种丰度占比最高的Apiotrichum(31.28%)、德巴利氏酵母属( Debaryomyces )(26.07%)分别属于腐生型中的土壤腐生菌和未定义腐生菌。此外,一些常见属在生态系统中扮演多重角色,如枝孢霉属(Cladosporium )、链格孢属(Alternaria ),既属于动物病原菌,又属于内生菌、植物病原菌、腐生菌。
图 2 杜仲种子内生真菌(a)和细菌(b)的功能注释
Figure 2. Function notes of endophytic fungi (a) and bacteria (b) in E.ulmoides seeds
使用FAPROTAX 平台对细菌功能分类注释(图2b),选取总丰度前50的功能,结果发现,杜仲种子中的细菌群落生态功能归为化能异氧(chemoheterotrophy)、有氧化能异养(aerobic chemoheterotrophy)、发酵(fermentation)、硝酸还原(nitrate reduction)、亚硝酸呼吸(nitrate respiration)、尿素分解(ureolysis)、动物寄生生物或共生体(animal parasites or symbionts)、芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)、固氮作用(nitrogen fixation)、人类病原菌(human pathogens)、植物病原菌(plant pathogen)等44个功能类群,其中,细菌功能主要集中于化能异氧(31.96%)、有氧化能异养(23%)、发酵(8.79%)。部分集中于硝酸还原(4.50%)、亚硝酸呼吸(3.06%)、氮呼吸(3.06%)、尿素分解(2.63%)、动物寄生生物或共生体(2.51%)、芳香族化合物降解(1.88%)、固氮作用(1.61%)、人类病原菌(1.38%)、植物病原菌(1.03%) 9类。少部分属于暗氢氧化(dark hydrogen oxidation)(0.95%)、亚硝酸盐氨化(0.92%)等32个功能类群,总占比为14.60%。
杜仲种子内生微生物群落组成及生态功能分析
Community Composition and Ecological Functional Analysis of the Endophytic Microorganisms in Eucommia ulmoides Seeds
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摘要:
目的 揭示杜仲种子内的微生物群落组成和多样性,丰富杜仲相关微生物资源。 方法 本研究采用传统培养法和高通量测序技术对杜仲种子内生微生物群落组成和多样性进行分析,同时基于FAPROTAX 和FUNGuild数据库对其进行功能注释。 结果 从杜仲种子中共分离获得真菌40株(3门11属),优势属为曲霉属(Aspergillus)(30%);细菌142株(1门6属),其中,土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)(47.18%)为主要优势属。高通量测序获得141个真菌OTUs,隶属于6门101属;442个细菌OTUs,隶属于24门313属。在属水平,种子优势真菌属为Apiotrichum(31.28%)和德巴利氏酵母属(Debaryomyces)(26.07%);优势细菌属主要为假单胞菌属(Pseudomonas)(16.66%)和乳杆菌属(Lactobacillus)(9.68%)。功能注释结果显示:真菌以降解有机物、促进宿主植物生长、促进宿主对土壤养分的吸收、改善土壤环境微生物群落结构以及致病菌群为主;细菌以化能异氧、有氧化能异养以及具有发酵和固氮作用的菌群为主。 结论 杜仲种子内携带多种有益功能菌和潜在致病菌,这些微生物对植物的生长发育具有重要影响。同时本研究还分离到多株有益功能菌,这将为后续人为调控种子微生物组以增强植物健康提供微生物资源。 Abstract:Objective To reveal the microbial community composition and diversity in Eucommia ulmoides seeds and enrich the related microbial resources. Methods In this study, the diversity of endophytic microorganisms in E. ulmoides seeds was analyzed by traditional culture method and high-throughput sequencing technology, and functional annotated by FAPROTAX and FUNGuild database. Results A total of 40 fungi strains (3 phyla and 11 genera) were isolated from E. ulmoides seeds, and the dominant genus was Aspergillus (30%); 142 bacterial strains (1 phylum, 6 genera) were isolated, of which Solibacillus was the dominant genus (47.18%). Through high-throughput sequencing, 141 fungal OTUs were obtained belonging to 6 phylum and 101 genera; 442 bacterial OTUs were obtained belonging to 24 phylum and 313 genera. At the genus level, the dominant fungi were Apiotrichum (31.28%) and Debaryomyces (26.07%); The dominant bacterial genera were Pseudomonas (16.66%) and Lactobacillus (9.68%). The results of functional annotation showed that fungi mainly degraded organic matter, promoted the growth of host plants and the absorption of soil nutrients by host, improved soil microbial community structure and Pathogen community. The bacteria mainly consisted of chemoheterotrophic, heterotrophic, fermentation. and nitrogen fixation bacteria. Conclusion E. ulmoides seeds carry a variety of probiotics and potential phytopathogens, which have important effects on plant growth and development. In addition, a number of beneficial functional bacteria were isolated in this study, which will provide microbial resources for the subsequent artificial control of seed microbiome to enhance plant health. -
Key words:
- high-throughput sequencing
- / culturable method
- / diversity
- / ecological function
-
表 1 杜仲种子可培养内生真菌和细菌的群落组成
Table 1. Composition of culturable endophytic fungi and bacteria from Eucommia ulmoides seeds
分类
Classify门
Phylum纲
Class属
Genus种
Spices株数
Number真菌
Fungi毛霉门 Mucoromycota 毛霉纲 Mucoromycetes 小克银汉霉属 Cunninghamella 刺孢小克银汉 C. echinulata 1 子囊菌门
Ascomycota散囊菌纲 Eurotiomycetes 曲霉属 Aspergillus 赭曲霉菌 A. westerdijkiae 1 黄曲霉 A. flavus 2 烟曲霉 A. fumigatus 5 杂色曲霉 A. versicolor 3 晶状体曲霉 A. lentulus 1 青霉属 Penicillium 布雷正青霉 P. glaucoroseum 1 产黄青霉 P. chrysogenum 2 霍迪青霉 P. hordei 1 篮状菌属 Talaromyces 艾米斯托克蓝状菌 T. amestolkiae 4 枝孢瓶霉属 Cladophialophora 卡氏枝孢瓶霉 C. carrionii 1 座囊菌纲 Dothideomycetes 链格孢属 Alternaria 细极链格孢 A. tenuissima 1 交链格孢 A. alternata 4 黑团孢属 Periconia 油棕黑团孢 P. elaeidis 1 枝孢霉属 Cladosporium 耐盐枝孢霉 C. halotolerans 3 粪壳菌纲 Sordariomycetes 节菱孢菌属 Arthrinium 节菱孢 A. arundinis 3 木霉属 Trichoderma 滩涂木霉 T. arenarium 2 担子菌门 Basidiomycota 伞菌纲 Agaricomycetes 烟管菌属 Bjerkandera 烟管菌 B. adusta 4 细菌
Bacteria厚壁菌门
Firmicutes芽孢杆菌纲
BacilliPeribacillus P. huizhouensis 10 P. simplex 8 芽孢杆菌属 Bacillus 解蛋白芽孢杆菌 B. proteolyticus 4 芽孢杆菌 Bacillus sp. 1 Cytobacillus C. firmus 14 哥特氏芽孢杆菌 C. gottheilii 2 Metabacillus M. indicus 4 M. litoralis 1 土壤芽孢杆菌属 Solibacillus 森林土壤芽孢杆菌 S. silvestris 53 土壤芽孢杆菌 Solibacillus sp. 14 unclassified Paenibacillaceae P. bacterium 31 表 2 杜仲种子内生真菌和细菌群落的多样性
Table 2. Diversity of endophytic fungi and bacteria in E. ulmoides seeds
分类
Classify可培养 Culture 免培养 Non-Culture Margalef Shannon Simpson ACE Chao 1 Shannon Simpson 真菌 Fungi 9.26±1.14 2.94±0.28 0.98±0.01 59.83±15.14 59.67±15.18 2.39±0.2 0.20±0.03 细菌 Bacteria 2.80±0.13 2.66±0.21 0.91±0.04 233.30±85.79 223.01±84.83 3.93±0.2 0.06±0.02 -
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