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G蛋白是一类GTP结合蛋白, 按照G蛋白分子量和亚基组成可分为异源三聚体G蛋白、小G蛋白和几种特殊的GTP结合蛋白[1]。小G蛋白家族又称为Ras超家族, 根据其成员之间结构和功能的相似性, 将Ras超家族分为五个不同的家族, 分别是Ras、Rab、Arf、Ran和Rho家族[2], 其中Rho家族又可被分为CDC42、RAC和RHO三个亚家族[3-4]。这五个家族成员在细胞中参与了不同的生物学过程, 例如Ras家族成员参与调控细胞增殖, Rab家族和Arf家族成员在介导不同膜细胞器之间的囊泡运输中发挥重要作用, Ran家族成员主要调控与细胞核相关的一些细胞活动, 而Rho家族成员在细胞骨架重组及信号转导中行使重要功能[5]。
与动物或真菌Ras超家族不同, 植物没有Ras家族, 而植物中Rho形成了独特的一类, 称为ROP(Rho-related proteins from plants)[5]。自1993年首次从豌豆中发现Rho相似性GTPase以来, 已在拟南芥、水稻与玉米等多种植物中进行了鉴定[6]。ROP主要在与GTP结合的活性形式和与GDP结合的非活性形式之间循环, 该循环过程需要多种蛋白的参与, 如鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)、GTPase激活蛋白(GTPase activating protein, GAP)、鸟苷酸解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor, GDI)等。一旦受体感知到上游信号, 鸟苷酸交换因子就催化ROP从GDP结合的非活性形式转换为GTP结合的活性形式, 具有活性的ROP蛋白与下游效应蛋白结合发挥其生理功能[7]。ROP蛋白的结构极为保守, 主要包含与鸟苷酸结合和水解有关的5个高度保守结构域、1个效应因子结合区、1个插入序列和C端高度可变区。GTP结合结构域和效应因子结合区决定ROP蛋白的功能, 插入序列的功能目前尚不清楚, C端高度可变区决定ROP蛋白的亚细胞定位[8]。
ROP在植物发育与抗逆等生物学过程中具有重要的功能。在叶表皮铺板细胞中, 拟南芥ROP2调节PIN1的内吞过程[9]。在拟南芥胚胎发育阶段, ROP3在维持PIN1和PIN3在细胞膜上的极性分布方面具有重要作用[10]。拟南芥中多种ROP基因在花粉管尖端表达, 其中ROP1对花粉管的极性生长起主要作用[11]。ROP还参与根毛的发育, 超表达拟南芥ROP2, 能增加根毛数量和密度, 而AtROP4控制根毛的发生和尖端的伸长[12]。此外, 拟南芥保卫细胞中的ROP2能够被光激活来抑制光诱导的气孔张开[13]。目前, 在拟南芥基因组中共发现了10个ROP基因成员, 水稻和玉米分别发现7个和9个[6]。虽然一些研究都表明ROPs广泛参与了植物对激素, 环境等信号的响应及植物生长发育过程, 但各个ROP成员的功能还有待进一步解析。杨树全基因组序列虽已公布, 但对ROP基因家族成员尚未进行系统分析[14]。
本研究利用拟南芥ROP氨基酸序列, 在杨树基因组数据库中进行同源比对, 共鉴定出13个PtROP基因序列。在此基础上, 对杨树PtROP基因进行了系统进化、基因结构及保守结构域分析, 并对其在不同组织和不同胁迫条件下的表达情况进行了分析, 构建了其基因调控网络。研究结果为将来系统解析杨树ROP基因的功能奠定了基础。
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利用拟南芥ROP氨基酸序列, 在杨树全基因组数据库中搜索相似的氨基酸序列, 以E≤10-10作为候选标准, 共得到13个PtROP基因家族成员(表 1)。13个PtROP基因长度在2 047~6 862 bp之间, 但其蛋白序列约为200个氨基酸左右, 蛋白质分子量约22 kDa, 等电点约为9, 其中毛果杨基因组数据获取的PtROP10基因序列不完整。利用两种不同的算法, 即最大似然法(ML)和邻接法(NJ), 对杨树和拟南芥ROP蛋白进行系统进化分析, 发现用两种算法得到的杨树及拟南芥ROP蛋白进化关系相似(图 1)。根据ROP家族成员在杨树染色体上的分布顺序, 将其命名为PtROP1-13。Zheng和Yang等根据氨基酸序列相似性及C端高度可变区结构, 将拟南芥ROP蛋白分为四类, 即AtROP8、AtROP9-11、AtROP7和AtROP1-6[19]。对杨树及拟南芥ROP蛋白系统进化关系分析显示, 同拟南芥ROP蛋白一样, 这四类中均有相应的杨树ROP蛋白, 分别对应为: 第一类(PtROP10)、第二类(PtROP8、PtROP11、PtROP12)、第三类(PtROP7、PtROP9、PtROP13)及第四类(PtROP1-6)。与拟南芥相比, 杨树在第三类增加了两个ROP基因成员。
表 1 杨树PtROP基因家族成员基本信息
Table 1. Basic information of Populus PtROP gene
杨树基因gene 基因号gene number 基因在染色体上的位置location 基因长度length of gene/bp 蛋白质长度length of protain/aa 等电点pI/(分子量/kDa) PtROP1 Potri.002G019500 Chr02(-)1130440-1133737 3 298 202 9.49/22.305 64 PtROP2 Potri.004G174900 Chr04(+)19344459-19348452 3 994 198 9.33/21.859 42 PtROP3 Potri.005G110700 Chr05(-)8522678-8526079 3 402 197 9.32/21.570 95 PtROP4 Potri.005G242000 Chr05(+)24796222-24799414 3 193 197 9.28/21.692 14 PtROP5 Potri.007G061500 Chr07(+)6811340-6814779 3 440 228 8.18/25.038 61 PtROP6 Potri.009G134600 Chr09(+)10876427-10880720 4 294 210 9.50/23.298 15 PtROP7 Potri.011G061500 Chr11(-)5482983-5485029 2 047 196 9.30/21.845 30 PtROP8 Potri.012G077800 Chr12(-)10352323-10359184 6 862 211 9.35/23.448 24 PtROP9 Potri.013G123800 Chr13(-)13754749-13757500 2 752 197 9.45/21.861 31 PtROP10 Potri.014G051800 Chr14(-)4107009-4109732 2 724 191 9.07/21.389 68 PtROP11 Potri.015G073000 Chr15(-)9749868-9756148 6 281 211 9.21/23.465 25 PtROP12 Potri.018G083400 Chr18(-)11015972-11018214 2 243 226 9.37/25.242 44 PtROP13 Potri.019G092300 Chr19(+)12299464-12301826 2 363 197 9.53/21.797 27 -
通过对杨树PtROP基因结构(外显子/内含子)分析显示, 杨树13个PtROP基因成员结构相似性很高, 外显子数目为6~8个。其中, 9个PtROP基因成员(PtROP2、PtROP3、PtROP4、PtROP5、PtROP7、PtROP9、PtROP10、PtROP12与PtROP13)存在7个外显子, 3个PtROP基因(PtROP6、PtROP8及PtROP11)有8个外显子, 1个PtROP基因(PtROP1)具有6个外显子(图 2)。对杨树及拟南芥ROP氨基酸序列相似性比较, 发现杨树与拟南芥ROP氨基酸序列在相对应的分类中相似性很高(图 3), 可能为直系同源关系。而杨树中有四对ROP(PtROP1/PtROP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11、PtROP9/PtROP13)氨基酸序列一致性很高(图 3), 说明他们是旁系同源关系, 可能来自染色体加倍或基因的复制。
利用MEME结构域搜索工具在杨树PtROP中检测到15个保守的结构域。结果表明, PtROP10中不存在motif 2, PtROP5不具有motif 5, 而其它ROP均具有motif 1-7。Motif 1、2、3及5代表了ROP蛋白与GTP结合的结构域(图 4), 这四个结构域中都存在与GTP结合的保守结合位点。PtROP5虽然不具有motif 5, 但它具有其它与GTP结合的保守结合位点。对杨树PtROP蛋白motif 2中第20位的苏氨酸、motif 3中第10位的天冬氨酸分别进行点突变, 能够改变ROP蛋白与GTP的亲和性, 使其成为显性失活形式。如果对杨树PtROP蛋白motif 1中将第6位的谷氨酰胺突变为亮氨酸, ROP蛋白就成为了持续活性型形式(图 4)。
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通过比较其系统进化关系、基因结构及氨基酸序列相似性, 在杨树PtROP基因家族中共鉴定得到4对旁系同源基因对, 分别是PtROP1/PtROP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11及PtROP9/PtROP13, 这些基因对之间在氨基酸序列、内含子的插入大小及插入位点都极为保守。PtROP1/PtOP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11、PtROP9/PtROP13所在染色体片段区域的大部分基因都是同源基因, 因此这四个基因对可能是由于染色体复制产生的(图 5)。计算这四个基因对非同义替换率和同义替换率的比值, 发现它们都小于0.4, 因此基因对中的两个旁系同源基因复制后经历了纯化选择在功能上产生了一定程度的差异(表 2)。根据杨树扩张度λ=9.1×10-9, 估算出PtROP旁系同源基因对可能是在8.74到17.30百万年前产生的, 其中PtROP1/PtROP4产生的最早, 约在17.30百万年前; PtROP8/PtROP11产生的最晚, 约在8.74百万年前。而PtROP2/PtROP6、PtROP9/PtROP13分别是在13.98百万年前和11.77百万年前产生的, 这个时期与杨树最近一次在13百万年前发生的大规模片段复制时间大致相符[14]。
表 2 杨树PtROP基因对差异
Table 2. Divergence between paralogous PtROP gene pairs
基因1 基因2 非同义替换率 同义替换率 非同义替换率/同义替换率 时期(百万年前) PtROP1 PtROP4 0.074 0.315 0.236 17.30 PtROP2 PtROP6 0.013 0.255 0.052 13.98 PtROP8 PtROP11 0.020 0.159 0.125 8.74 PtROP9 PtROP13 0.020 0.214 0.094 11.77 -
为了探究杨树PtROP基因可能参与的生物学过程, 利用课题组的RNA-seq数据和已公布的杨树基因芯片数据, 分析了杨树PtROP基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式。与幼叶、老叶、幼茎、木质化茎及根相比, 杨树PtROP1、PtROP2、PtROP8、PtROP11及PtROP12在顶点的表达水平较高, 表明它们可能参与了顶端发育过程。PtROP7、PtROP9及ROP13特异性地在已木质化的茎中表达, 说明这些基因可能参与杨树次生生长。PtROP1、PtROP8、PtROP9及PtROP12在老叶中的表达量最低, 表明它们可能不参与光合作用及次生物质的代谢过程(图 6)。
在应拉木和应力木中PtROP7、PtROP9、PtROP10及PtROP13表达都显著下调, 且PtROP7、PtROP9及PtROP13在次生茎中特异性高表达, 表明这三个基因的表达受外力的调控。对高温、低温、干旱和盐胁迫条件下PtROP基因的表达分析发现, 13个基因中仅有PtROP7在低温条件下下调表达, 表明大部分PtROP基因可能不直接对高、低温、干旱和盐等胁迫响应, 或者其在胁迫条件下的稳定表达对细胞功能的维持具有重要作用(图 7)。
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为了进一步解析PtROP基因的生物学功能, 构建了PtROP的功能基因网络。发现与PtROP基因紧密联系的基因主要分为四类, 即Rho GDP-解离抑制活性、信号转导、tRNA修饰及Actin细胞骨架(表 3)。其中, 在整个网络中大约50%的基因与信号转导相关, 并且这些基因与杨树PtROP基因的相关性都比较大, 这与拟南芥中ROP参与了信号转导的结果相符合, 说明PtROP基因具有功能保守性。13个基因中, 与PtROP2和PtROP3相关联的基因最多, 表明二者在整个调控网络中发挥主要作用。在网络中, 与tRNA修饰相关的基因占50%以上, 但仅有PtROP4与之相关联, 并且它们之间的相关性较小, 可能PtROP4广泛地参与到tRNA修饰中, 但不在其中起主要作用, 另外, PtROP4基因在13个PtROP基因中仅与PtROP1存在关联, 显示杨树PtROP4可能在进化过程中出现了功能分化(图 8)。
表 3 杨树PtROP功能基因网络中基因相关信息
Table 3. Genes information in the PtROP gene functional network
分类 基因号
gene number功能注释
tunction分类 基因号
gene number功能注释
functiontRNA修饰 Potri.001G073700 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 信号转导 Potri.001G236100 Ras相关小G蛋白 tRNA Potri.001G338700 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 signal Potri.004G148400 WD40重复蛋白 modification Potri.004G157200 核糖体蛋白S25家族蛋白 transduction Potri.004G153700 GTP结合蛋白 Potri.005G066200 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.005G131100 WD40重复蛋白 Potri.005G067500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.006G133400 GTP激活蛋白 Potri.006G042200 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.007G035100 WD40重复蛋白 Potri.006G042400 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.009G027900 Ras相关小G蛋白 Potri.006G277100 tRNA甲基转移酶 Potri.009G109500 WD40重复蛋白 Potri.007G101800 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.009G115300 GTP结合蛋白 Potri.007G103400 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.010G208900 RabA Potri.008G020000 核糖体蛋白S25家族蛋白 Potri.011G024000 鸟苷酸交换因子 Potri.010G239300 核糖体蛋白S25家族蛋白 Potri.014G038400 WD40重复蛋白 Potri.011G157500 甲基转移酶 Potri.002G130400 WD40重复蛋白 Potri.014G019000 锚蛋白重复序列蛋白家族 actin细胞骨架 Potri.004G057100 SCAR蛋白 Potri.018G049800 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 actin cytoskeleton Potri.006G105800 SCAR蛋白 Potri.018G116500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.011G066100 SCAR蛋白 Potri.018G120500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 其他 Potri.006G085400 生物素合成相关 Potri.T163900 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 others Potri.005G065800 DNA结合相关 Potri.013G051200 转录激活因子
杨树PtROP家族基因的表达分析与功能预测
Expression and Functional Analysis of ROP Gene Family in Populus
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摘要:
目的 为探究ROP基因在林木中的功能。 方法 本研究以杨树为模式,在全基因组水平上对ROP基因的家族成员、基因结构、保守结构域、氨基酸序列相似性及表达模式进行了分析。 结果 显示,杨树PtROP基因家族包含13个成员,不同成员间在进化上相对保守,均存在与GTP结合与水解相关的结构域。这些基因在不同组织、不同胁迫条件下的表达具有明显差异,说明它们参与不同的生物学过程。通过构建功能基因网络(functional gene network for poplar)发现PtROP基因主要参与了信号转导过程。 结论 杨树PtROP基因家族包含13个成员参与不同的生物学过程,可能主要参与了信号转导过程。 Abstract:Objective To explore the putative function ofROPs in forest trees. Method A genome-wide analysis of ROPs was performed, including the phylogeny, gene structure, conserved motifs, ROP amino sequences similarity between Populus and Arabidopsis ROP proteins and the expression patterns using Populus as a model. Result The results showed that there were 13 members of PtROP genes in Populus and the PtROP genes were conserved during evolution of species, all of them containing GTP binding and hydrolysis-related domains. Furthermore, the expression profiles revealed that Populus PtROP had distinct expression pattern across different tissues and different stress conditions, suggesting that PtROP genes were involved in different biological processes. In addition, the analysis on PtROP gene functional network was conducted. It is predicted that Populus PtROP genes were mainly involved in signal transduction. Conclude In this study, systematically bioinformatics analysis on PtROP were conducted which laid the foundation for the further exploration of poplar PtROP functions. -
Key words:
- Populus
- / ROP
- / gene family
- / gene expression pattern
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表 1 杨树PtROP基因家族成员基本信息
Table 1. Basic information of Populus PtROP gene
杨树基因gene 基因号gene number 基因在染色体上的位置location 基因长度length of gene/bp 蛋白质长度length of protain/aa 等电点pI/(分子量/kDa) PtROP1 Potri.002G019500 Chr02(-)1130440-1133737 3 298 202 9.49/22.305 64 PtROP2 Potri.004G174900 Chr04(+)19344459-19348452 3 994 198 9.33/21.859 42 PtROP3 Potri.005G110700 Chr05(-)8522678-8526079 3 402 197 9.32/21.570 95 PtROP4 Potri.005G242000 Chr05(+)24796222-24799414 3 193 197 9.28/21.692 14 PtROP5 Potri.007G061500 Chr07(+)6811340-6814779 3 440 228 8.18/25.038 61 PtROP6 Potri.009G134600 Chr09(+)10876427-10880720 4 294 210 9.50/23.298 15 PtROP7 Potri.011G061500 Chr11(-)5482983-5485029 2 047 196 9.30/21.845 30 PtROP8 Potri.012G077800 Chr12(-)10352323-10359184 6 862 211 9.35/23.448 24 PtROP9 Potri.013G123800 Chr13(-)13754749-13757500 2 752 197 9.45/21.861 31 PtROP10 Potri.014G051800 Chr14(-)4107009-4109732 2 724 191 9.07/21.389 68 PtROP11 Potri.015G073000 Chr15(-)9749868-9756148 6 281 211 9.21/23.465 25 PtROP12 Potri.018G083400 Chr18(-)11015972-11018214 2 243 226 9.37/25.242 44 PtROP13 Potri.019G092300 Chr19(+)12299464-12301826 2 363 197 9.53/21.797 27 表 2 杨树PtROP基因对差异
Table 2. Divergence between paralogous PtROP gene pairs
基因1 基因2 非同义替换率 同义替换率 非同义替换率/同义替换率 时期(百万年前) PtROP1 PtROP4 0.074 0.315 0.236 17.30 PtROP2 PtROP6 0.013 0.255 0.052 13.98 PtROP8 PtROP11 0.020 0.159 0.125 8.74 PtROP9 PtROP13 0.020 0.214 0.094 11.77 表 3 杨树PtROP功能基因网络中基因相关信息
Table 3. Genes information in the PtROP gene functional network
分类 基因号
gene number功能注释
tunction分类 基因号
gene number功能注释
functiontRNA修饰 Potri.001G073700 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 信号转导 Potri.001G236100 Ras相关小G蛋白 tRNA Potri.001G338700 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 signal Potri.004G148400 WD40重复蛋白 modification Potri.004G157200 核糖体蛋白S25家族蛋白 transduction Potri.004G153700 GTP结合蛋白 Potri.005G066200 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.005G131100 WD40重复蛋白 Potri.005G067500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.006G133400 GTP激活蛋白 Potri.006G042200 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.007G035100 WD40重复蛋白 Potri.006G042400 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.009G027900 Ras相关小G蛋白 Potri.006G277100 tRNA甲基转移酶 Potri.009G109500 WD40重复蛋白 Potri.007G101800 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.009G115300 GTP结合蛋白 Potri.007G103400 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.010G208900 RabA Potri.008G020000 核糖体蛋白S25家族蛋白 Potri.011G024000 鸟苷酸交换因子 Potri.010G239300 核糖体蛋白S25家族蛋白 Potri.014G038400 WD40重复蛋白 Potri.011G157500 甲基转移酶 Potri.002G130400 WD40重复蛋白 Potri.014G019000 锚蛋白重复序列蛋白家族 actin细胞骨架 Potri.004G057100 SCAR蛋白 Potri.018G049800 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 actin cytoskeleton Potri.006G105800 SCAR蛋白 Potri.018G116500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 Potri.011G066100 SCAR蛋白 Potri.018G120500 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 其他 Potri.006G085400 生物素合成相关 Potri.T163900 S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶 others Potri.005G065800 DNA结合相关 Potri.013G051200 转录激活因子 -
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