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白蜡虫(Ericerus pela (Chavannes))是一种重要的林业资源昆虫, 其主要寄主植物为白蜡树(Fraxinuschinensis Roxb.)和女贞(Ligustrum lucidum Ait.)。白蜡虫雄性二龄幼虫在寄主植物上分泌的次生代谢物质为白蜡。白蜡是我国的一种重要林副产品, 采用氢化铝锂还原法或皂化法提炼后能够得到高级烷醇[1-2]。高级烷醇能降低胆固醇, 促进细胞成熟[3-4]; 但是白蜡和高级烷醇均不溶于水, 限制了人们对白蜡及高级烷醇的开发和利用。笔者通过研究发现: 白蜡和白蜡高级烷醇能溶解到含有吐温80的水溶液中, 但吐温80易诱导细胞的脱粒作用[5]。因此, 用吐温作为白蜡及高级烷醇的增溶剂进行生物活性筛选时需要考虑其对细胞的安全性。
人真皮乳头细胞是毛囊生长调节的重要细胞, 它存在于毛囊的基底部位, 调控毛囊的生长、循环, 指导毛基质细胞分化形成毛干, 决定毛发的直径[6]。因此, 人真皮乳头细胞成为体外筛选脱发药物的首选细胞。考察药物对细胞生长的影响通常采用的方法有MTT法和MTS法, 这2种方法均是采用比色法检测细胞的生长, 其原理是MTT和MTS试剂被活细胞内的脱氢酶产生的NADPH或NADH还原为有色的甲臜, 而死细胞不能产生脱氢酶, 因此, 死细胞不能产生颜色。活细胞数量越多, 产生的甲臜越多, 培养基的颜色越深[7], 表明细胞增殖越旺盛。相对于MTT法, MTS法检测时间短, 安全性高, 重复性好[8]。因此, 本文采用MTS法研究不同用量的吐温80对人真皮乳头细胞生长的影响, 并考察在吐温80安全用量范围内白蜡及白蜡高级烷醇在水中的增溶量对人真皮乳细胞的增殖作用, 为白蜡及白蜡高级烷醇产品的开发和利用奠定理论基础。
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白蜡及白蜡高级醇由本课题组提供; 人真皮乳头细胞(批号2365)、真皮乳头细胞生长培养基(批号184)、包被液(批号361)、消化液(批号322)购自美国Cell Applications。非那雄胺(M1122A)购自大连美仑生物科技有限公司。吐温80(分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司。DMSO(批号: 302A0328)购自北京索莱宝科技有限公司。倒置显微镜, 日本基恩士, 型号VHX-1000。
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人真皮乳头细胞保存在液氮中, 临用前从液氮中取出, 在37℃水浴中融化后, 转移到用包被液处理过的T-75培养瓶中, 37℃, 5%CO2培养箱内培养过夜, 第2天更换完全培养基, 继续培养, 待细胞融合度达到90%, 用消化液消化, 采用台盼蓝法测定细胞的活力, 备用。
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将吐温80配制成浓度为5%(w/v)的水溶液, 用灭菌水稀释成浓度250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 μg·mL-1水溶液。
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将白蜡溶解到5%吐温水溶液中, 制备成浓度1.00 mg·mL-1的白蜡水溶液(制备方法已申请专利), 用灭菌水稀释成浓度3.10、6.30、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1的白蜡水溶液;
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将白蜡高级烷醇溶解到1%吐温水溶液中, 制备成浓度2.00 mg·mL-1的白蜡高级烷醇水溶液(制备方法已申请专利), 用灭菌水稀释成浓度31.20、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1的白蜡高级烷醇水溶液。
非那雄胺溶解到DMSO中配置成浓度0.74 μg·mL-1的溶液。
将上述溶液与培养基按1∶9混匀后, 备用。
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人真皮乳头细胞(2.5×103个·孔-1)接种到96孔板中, 过夜, 更换含有不同浓度的吐温80培养基(终浓度为25.00、12.50、6.25、3.12、1.56 μg·mL-1)、白蜡培养基(终浓度为0.31、0.63、1.25、2.50、5.00 μg·mL-1)和白蜡高级烷醇培养基(终浓度为3.12、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1), 同时设阴性对照(90 μL细胞悬液+10 μL培养基)、空白对照1(100 μL培养基)和空白对照2(90 μL培养基+10 μL相应浓度的吐温80水溶液), 阳性对照(0.074 μg·mL-1非那雄胺), 每个处理4个平行孔, 继续在37℃, 5%CO2培养箱内培养48 h后, 每孔加20 μL MTS试剂, 继续培养4 h, 用酶标仪490 nm测定各孔光密度(OD), 计算细胞增殖率, 吐温80对细胞作用效果计算公式[10]为:
$ \text { 细胞增殖率 }=\frac{\text { 实验组 } O D-\text { 空白对照组 }{ }_{1} O D}{\text { 阴性对照组 } O D-\text { 空白对照组 }{ }_{1} O D} \times 100 \% $
白蜡及白蜡高级烷醇对细胞作用效果计算公式为:
$ \text { 细胞增殖率 }=\frac{\text { 实验组 } O D-\text { 空白对照组 }{ }_{2} O D}{\text { 阴性对照组 } O D-\text { 空白对照组 }{ }_{2} O D} \times 100 \% $
同时采用倒置显微镜观察细胞生长情况。
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采用SAS9.1统计软件中的ANOVA分析不同处理组细胞的增殖率和抑制率的平均值±SE, P < 0.05表明有显著性差异。
白蜡及白蜡高级烷醇对人真皮乳头细胞生长的影响
Effect of White Wax and Policosanol from White Wax Tween Aqueous Solution on HFDPCS
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摘要:
目的 明确白蜡及白蜡高级烷醇吐温水溶液对人真皮乳头细胞(HFDPCs)生长的影响。 方法 采用台盼蓝法测定细胞的的接种数量,接种第2天给药,给药48 h后采用MTS法研究不同浓度吐温80、白蜡及白蜡高级烷醇吐温水溶液对人真皮乳头细胞的作用。 结果 人真皮乳头细胞在吐温80用量1.56~6.25 μg·mL-1范围内能正常生长。在安全范围内,白蜡(增溶量为0.31~1.25 μg·mL-1)吐温水溶液、白蜡高级烷醇(增溶量为3.12~12.5 μg·mL-1)吐温水溶液均能促进人真皮乳头细胞的增殖,其中, 水溶液中含有6.25 μg·mL-1吐温80和1.25 μg·mL-1白蜡、水溶液中含有6.25 μg·mL-1吐温80和12.5 μg·mL-1白蜡高级烷醇时细胞的增殖率明显高于非那雄胺。 结论 吐温80作为增溶剂,其用量低于6.25 μg·mL-1时对人真皮乳头细胞安全。在保证吐温80对细胞安全的条件下,白蜡及白蜡高级烷醇可显著促进人真皮乳头细胞的增殖。 Abstract:Objective To investigate the cell proliferation effect of white wax and policosanol from white wax tween aqueous solution in human dermal papilla cells (HFDPCs). Method The cell seeding density was decided by Trypan blue test. Next day, change fresh medium which including treatment agent for HFDPCs. MTS assay was used to compare the proliferation effects of different concentrations of tween80, white wax and policosanol from white wax tween80 aqueous solutions on HFDPCs tween aqueous solutionafter 48 h. Result HFDPCs could grow wellwhenthe concentration of tween 80 was 1.56-6.25 μg·mL-1. In the concentration range, white wax (solubility in water was from 0.31-1.25 μg·mL-1) and policosanol from white wax (solubility in water was 3.125-12.5 μg·mL-1) tween aqueous solutions had the cell proliferation effect for HFDPCs. In which, the white wax aqueous solution including 6.25 μg·mL-1 tween80 and 1.25 μg·mL-1 white wax, and the policosanol aqueous solution which including 6.25 μg·mL-1 tween80 and 12.5 μg·mL-1 policosanol increased significantly the proliferation of HFDPCs comparing with finasteride. Conclusion The selected concentration of tween80 is below 6.25 μg·mL-1 in HFDPCs culture when tween80 is used as a solubilizing agent. In the optimistic concentration range of tween80, the white wax and policosanol from white wax could increase the proliferation of HFDPCs remarkably. -
Key words:
- white wax
- / policosanol from white wax
- / tween80
- / human dermal papilla cells
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