选取采集于山东青州、广西恭城、河南栾川及陕西富平的4个具有代表性的菌株; 杀菌剂包括苯并咪唑类、三唑类、二甲酰亚胺类等10类22种。(1)MIC值测定: 将供试菌株接种在含1、5、10 μg·mL^-1杀菌剂的PSA平板上, 不含药的PSA平板为对照, 每皿2个菌株, 每处理2次重复, 25℃培养4 d后, 采用十字交叉法测量各处理的菌落直径, 求平均值后, 计算抑制率, 得出药剂对炭疽病菌的最低抑制浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径/(对照菌落直径-5)×100%;(2)EC₅₀值测定: 采用菌丝生长速率法^[18]进行测定, 采用MIC测定中的抑制率公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率, 所得数据经Finney概率分析后用DPS v12.01统计软件求出毒力回归方程式及EC₅₀。实验步骤包括: 1)配置杀菌剂母液。将备试原药用丙酮溶解, 配制成10 g·L^-1的母液备用。2)炭疽菌株进行活化。把炭疽的菌丝接种于培养皿的PSA培养基平面中央, 培养4 d左右待用。3)制备带毒培养基。依据前期各杀菌剂对柿炭疽病菌MIC值的测定结果, 设置系列浓度梯度(表 1), 根据浓度梯度加入一定量的杀菌剂母液, 制备系列浓度的带毒培养基。4)炭疽病菌接种。将活化后的炭疽病菌用打孔器在菌落边缘打出直径为0.5 cm的菌饼, 然后接种于含药剂系列浓度的PSA培养基上。5)病菌抑制效果观测。炭疽病菌于25℃培养箱中培养6 d左右, 观察菌丝生长状况, 测量菌落直径, 算出抑制率。以不加药剂的PSA平板为空白对照, 每个药剂浓度3个重复。

试验在广西平乐县(110°38'35.91″ E, 24°38'0.32″ N)沙子镇一个10年生水柿园进行, 株行距为3.5 m×4 m。柿园地形为平地, 红壤, pH值6.2, 肥力中等, 管理水平中等, 整个园区发病情况基本一致。

结合已经得到的室内防治药剂筛选结果, 选择其中效果较好和未做室内试验但较新型药剂共5种进行柿炭疽病室外防治药剂的筛选试验, 设5个药剂处理(表 2)和1个清水对照, 每处理3次重复, 共18个小区, 每小区3株柿树, 每个处理9棵树喷1喷雾器药液(22 kg)。施药时间为2015年8月10日、9月1日、9月20日和10月8日, 皆为晴天或多云, 喷药后3 d内均未下雨。前两次施药时间为下午4:00左右, 后两次施药时间为下午3:00左右。

在每株调查柿树的树冠中等偏上部位东、西、南、北4个方向定枝4个, 每枝果数不少于10个(广西水柿发生该病主要表现在果实上, 所以本试验不调查叶片及果蒂), 于每次喷药前调查病果率(由于柿果发生炭疽病导致的果实过早脱落和病斑的大小无关, 所以本试验调查时只调查病果率, 不调查发病等级), 考虑到每次病果率调查时由于发生炭疽病导致的果实脱落情况, 病果率的计算方法为: 病果率=[调查当次树上病果数+(初次调查果实总数-当次调查果实总数)-其它因素落果数]/初次调查果实总数。最后一次调查时间为喷药后的第10天即10月18日。防治效果=(对照病果率-处理病果率)/对照病果率×100%。

应用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和DPS v12.01统计软件对数据进行处理和制表、制图等。

供试的10类22种杀菌剂对采集于山东青州、广西恭城、河南栾川及陕西富平的4个菌株的抑制作用见表 3, 对柿炭疽病菌菌丝生长抑制效果较好的杀菌剂有苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类(三唑类、DMIs)、苯吡咯类3类杀菌剂, 它们有的品种已应用在柿炭疽病的化学防治上, 有的则正在作为复配剂进行开发。琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoIs)对柿炭疽病菌毒力差异较大, 需作进一步的探索。其中琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)中的噻呋酰胺对于广西水柿炭疽病病菌抑制作用较强, 所以选用该药进行室外试验。三唑类药物虽然对于柿炭疽病病菌抑制作用较强, 但其代表性药剂多菌灵、苯菌灵等能诱发病原菌的抗性, 同类品种间有正交互抗性, 应注意与其它类型杀菌剂混用或轮换使用, 所以室外试验未选择三唑类药剂。结合表 2与市场上的新型杀菌剂使用情况, 室外试验选择了苯醚甲环唑、咪鲜胺、咯菌腈、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺5种杀菌剂。

由表 4可以看出, 除噻呋酰胺以外其余4种药剂对柿果炭疽病的防治效果均较好, 5种药剂的防治效果基本上呈现出先上升后下降的趋势, 但不同药剂发挥效果的时间有差异, 其中苯醚甲环唑和噻呋酰胺起效较慢, 咪鲜胺起效较快。总体来看咪鲜胺和咯菌腈起效较快且最终防治效果较好, 吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑次之, 噻呋酰胺效果最不理想; 病果率基本呈现上升的趋势, 尤其是清水对照, 发病率上升较为明显, 10月18日最后一次调查时对照发病率达到63.5%, 其它几种处理发病率为30%~50%, 不同处理之间均达到极显著差异。

本试验选择了10类22种杀菌剂, 基本上覆盖了近年来市场上病害防治的常用药剂, 并采用室内试验和田间试验相结合的方法进行药剂筛选, 为制定较为有效的柿炭疽病防治方法打下了基础。室内试验中发现三唑类对炭疽病菌抑制效果较好, 但由于三唑类杀菌剂的作用机理是抑制病原菌体内甾醇的脱甲基化过程, 作用位点相对单一, 因此存在较高的抗药性风险^[19], 所以田间试验未选择该类药剂, 这符合试验方案中寻找有效、可持续药剂的目标和理念。田间试验结果显示虽然进行了药剂处理, 但最终发病率都超过了30%, 这可能因为试验柿园往年发病较重且未经过正规的防治, 所以出现了前期防效较好, 但随着时间推移炭疽病的发病率呈现上升的趋势。后续工作包括: (1)补测咪鲜胺和吡唑醚菌酯对柿炭疽病病菌的室内毒力数据, 并与其它药剂的室内毒力数据和大田试验结果进行比对分析; (2)从药剂使用时间对最终防治效果的影响方面开展研究, 如发病前防治和发病后防治的效果差异来比较不同药剂的防治效果和预防效果, 进而探讨不同药剂的最佳喷药时期^[20]; (3)通过不同药剂的配合使用筛选出效果较好的药剂组合, 为复配新型药剂做好准备工作。由于时间限制本次室外防治试验结果是1年得出的, 后续研究需关注连续多年使用的效果差异以比较不同药剂的长期效果; (4)对各种杀菌剂进行综合比较, 诸如对植物生长的影响、对环境的影响、成本分析等, 力求经济合理地施用高效低毒杀菌剂。

室内试验结果表明, 苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类(三唑类)、苯吡咯类3类杀菌剂对柿炭疽病菌的抑制作用较强, 其中效果较好的噻菌灵、多菌灵、苯菌灵、甲基托布津、苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑、咯菌腈8种药剂的MIC值均在10 μg·mL^-1以下, EC₅₀值在0.011 2 ~0.520 3 μg·mL^-1范围内。在此基础上进行田间试验结果表明, 所选5种药剂都起到了显著的防治效果, 第1年使用最终防治效果在18.72%~47.76%之间, 其中咯菌腈防治效果最好。不同药剂药效的发挥速度及防效稳定性不同, 综合来看咯菌腈和咪鲜胺2种药剂起效速度和最终防治效果均较好, 适合在生产中推广使用。