采自云南省麻栗坡县，海拔高度约1 270 m。于2016年10月采集长梗杜鹃植株的幼嫩叶片，立即置于液氮中，带回实验室于﹣80℃冰箱中保存备用。

用“试剂盒提取法”对所采集的材料进行RNA提取，送华大基因有限公司(BGI)进行高通量测序。测序完成后先对原始数据进行过滤，然后使用Trinity对过滤后的reads进行de novo组装，最后使用Tgicl进行聚类去冗余得到最终的Unigenes。

利用Perl操作平台下的MISA软件(misa-microsatellite identification tool, MISA, http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索长梗杜鹃Unigenes中潜在的1~6 bp的SSR位点，参数设置为：单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基的最短重复分别为12、6、5、5、4、4，复合SSR两个位点间最大间隔碱基数为100。采用Excel软件统计长梗杜鹃SSR位点的数量、出现频率、分布的平均距离、重复单元类型和比例、重复单元碱基组成以及序列长度变异，并结合SSR和CDS的位置信息判断SSR的落点，全面了解其转录组SSR的序列特征。

测序获得58.30 Mb的Raw Reads，过滤后得到44.85 Mb的Clean Reads，总碱基数为6.73 Gb，Q20(质量值大于20的碱基数目占总碱基数目的比例)为98.22%，所得序列的数量及质量均较高。对Clean Reads进行组装得到94 906个转录本(Transcripts)，其长度主要分布在200~2 000 bp之间，占转录本总数的89.85%。将这些转录本进一步聚类去冗余得到74 092条Unigenes，其中聚类(clusters)的Unigenes为51 505条，单独(singletons)的Unigenes为22 587条；GC(碱基)含量为43.20%，长度在1 kb以上的有23 879条，占Unigenes总数的32.23%(表 1)。

利用Perl操作平台下的MISA软件对长梗杜鹃转录组所得74 092条Unigenes中1~6 bp的SSR进行查找，共搜索到23 192个SSR位点，包含2 826个复合型SSR，分布于17 354条Unigenes上，其中4 402条Unigenes含有2个或2个以上的SSR，部分SSR信息见表 2。

序列组装去冗余后总长度为69 505 225 bp(表 1)，SSR的发生频率(含SSR位点的Unigenes数与总Unigenes之比)为23.42%，包含SSR的一致序列出现频率(检出的SSR个数与总Unigenes序列数之比)为31.30%。SSR的分布密度为0.334 SSR/kb，平均每3 kb出现1个SSR位点；搜索到的SSR序列总长度为543.322 kb(0.78%)，说明在长梗杜鹃转录组中SSR序列小于整个转录组序列的百分之一(表 3)。

在长梗杜鹃转录组SSR数据库中，以二碱基为重复单元的SSR含量最多，占总数的69.25%，其次是三碱基和单碱基，分别占15.07%和12.45%。而四、五、六碱基重复单元所占比例均较低且依次递增(表 3)。相应地不同重复单元的SSR含量、出现频率、分布密度以及分布的平均距离变化也很大。其中，SSR含量、出现频率、分布密度的变化规律一致，依次为：二碱基＞三碱基＞单碱基＞六碱基＞五碱基＞四碱基；与之对应的平均距离以四碱基最高，为451.33 kb；以二碱基最低，为4.33 kb，且二者的差异达104倍，即该转录组序列中每出现104个二碱基重复类型才出现1个四碱基重复类型的SSR。

考虑碱基互补作用，在长梗杜鹃转录组23 192个SSR中共发现187种重复基元，其中单、二、三、四、五、六碱基重复分别有2、4、10、22、56和93种，不同碱基的重复基元所占比例差异较大(图 1)。单碱基重复类型中以A/T为主要重复基元，占该类型的99.07%；二碱基重复类型中各基元所占比例依次为：AG/CT(89.55%)＞AC/GT(6.53%)＞AT/AT(3.64%)＞CG/CG(0.27%)；三碱基重复类型中AAG/CTT最多(28.09%)，其次是AGG/CCT(13.27%)、ACC/GGT(13.27%)；AAAG/CTTT(16.88%)、AAAAG/CTTTT(12.63%)和AGAGGG/CCCTCT(12.94%)分别为四、五、六碱基重复类型的优势重复基元，且分别有5、20、41种基元里只有1个SSR。

图  1  长梗杜鹃转录组SSR不同重复类型各基元的比例

Figure 1.  Motif proportions of each types of repeat in R. longipedicellatum transcriptome

整体来看，在长梗杜鹃转录组中最丰富的SSR类型是二碱基重复，其次是三碱基重复，最主要的优势重复基元分别是(AG/CT)n、(A/T)n、(AC/GT)n及(AAG/CTT)n，分别占总SSR数量的62.01%、12.34%、4.52%和4.23%。此外，还发现了44个在植物转录组中不常见的CG/CG基元，以及240个在双子叶植物中很少见的CCG/CGG基元。

对SSR和CDS(编码区)的交集基因进行检测，共发现15 908个SSR位点，其中仅有2 792个位点存在于编码区，位于非编码区的位点达到12 555个，另有561个位点跨越了蛋白编码区和非编码区。编码区SSR的出现频率(编码区中检出的SSR个数与CDS总长度之比)为0.076 SSR/kb，而在非编码区中为0.344 SSR/kb，这说明非编码区SSR出现频率大约是编码区的4.5倍。在基因编码区2 792个位点中，所占比例最高的是三碱基重复(1 356, 48.57%)，其次是二碱基重复(808, 28.94%)和单碱基重复(275, 9.85%)，此外还发现(225, 8.06%)个复合型SSR。非编码区则是二碱基重复最多(8 306, 66.16%)，其次是单碱基重复(1 283, 10.22%)。

SSR重复次数的不同会导致重复片段长度发生变异，进而影响其多态性。长梗杜鹃转录组中SSR各重复类型的重复次数分布范围较广，波动于4~117次，且多集中于4~25次(图 2)。

图  2  长梗杜鹃转录组SSR各重复类型不同重复次数分布频率

Figure 2.  Percentage of various repeat types with different number of repeats in R. longipedicellatum transcriptome

其中，单、二、三、四、五、六碱基分别重复12~117、6~50、5~22、5~10、4~8和4~15次，且表现为随着重复次数以及碱基数量的增加，SSR出现的频率降低，仅当二碱基重复从10次增加到11次时，SSR数量出现了较大增加的情况。重复基元以重复6次的频率最高，共有SSR 3 630个，占SSR总数的15.65%，其次是7次(2 587，11.15%)、5次(2 176，9.38%)、8次(2 144，9.24%)，25次以上的SSR仅有340个，占总SSR的1.47%。总体来看，SSR的重复次数以4~10次较多，占59.12%，11~20次的占35.97%，而重复次数在20次以上的不足5%，表现为SSR数量随着重复次数的增加呈明显下降的趋势(图 3)。

图  3  长梗杜鹃转录组SSR重复次数分布频率

Figure 3.  Frequency of repeat number of SSR in R. longipedicellatum transcriptome

长梗杜鹃转录组中SSR序列的长度存在显著变异，长度由12~117 bp不等，平均长度为21.23 bp，通过正态性检验，其偏度(Sk)和峰度(Ku)均大于零，不符合正态分布；单碱基重复长度变化范围最大(12~117 bp)，其中以A/T基元长度变化范围最大(12~117 bp)，其次是AG/CT(12~100 bp)。单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的平均长度分别为14.67、22.99、17.83、21.63、21.32和28.89 bp(表 3)，且各碱基重复类型均表现为随着重复片段长度的增加，SSR出现的频率降低，即各碱基重复区段片段长度与其对应的SSR数量成相反的变化趋势。从全部碱基来看，12 bp长的SSR在长梗杜鹃转录组中所占比例最高，为14.46%，其次是15 bp(10.56%)、14 bp(10.48%)和18 bp(9.53%)，其中长度≥20 bp的SSR位点有7 698个，占SSR总数的42.90%(图 4)。

图  4  长梗杜鹃转录组中SSR的长度分布

Figure 4.  Length distribution of SSR in R. longipedicellatum transcriptome

进一步对长梗杜鹃不同长度重复单元SSR的长度变异情况进行分析，分别描述了各碱基重复不同长度SSR在饼图中的占比，图中各扇区对应不同长度的SSR，频率≤1%的SSR合并在同一黑色扇区内(图 5)。从图中可知，二碱基重复SSR的长度变异程度最高，有40种不同SSR变化长度；其次是单碱基，有28种；三碱基、六碱基、四碱基重复SSR长度变异程度依次降低，五碱基最低，仅4种变化长度。长梗杜鹃转录组SSR的序列长度与其出现频率的Pearson相关性分析表明二者在0.01水平(双侧)上显著负相关，相关系数为-0.566。

图  5  长梗杜鹃转录组不同长度重复单元SSR长度变异情况

Figure 5.  Length diversification of SSR in R. longipedicellatum transcriptome

本研究通过长梗杜鹃叶片转录组测序，组装、聚类去冗余后获得74 092条Unigenes，利用Perl操作平台下的MISA软件共搜索到23 192个SSR位点，包含SSR的一致序列出现频率为31.30%，分布密度为0.334 SSR/kb，平均每3 kb出现1个SSR位点。与大多数双子叶植物如杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)^[8](0.038 SSR/kb)、碧桃(Prunus persica cv. duplex Rehd.)^[9](0.287 SSR/kb)和短丝木犀(Osmanthus serrulatus Rehd.)^[10](0.183 SSR/kb)的EST-SSR相比，长梗杜鹃转录组中SSR的分布密度较高；但低于高粱(Sorghum bicolor(L.) Moench)(0.646 SSR/kb)、水稻(Oryza sativa L.)(0.739 SSR/kb)等单子叶植物^[11]，这可能是二者的进化因素不同使得双子叶植物的SSR分布偏低^[12]，另外出现这种差异也可能与物种间SSR的分布、含有SSR基因的表达丰度、搜索的序列来源、搜索软件的选择以及搜索的标准等不一致有关。总体而言，长梗杜鹃转录组中SSR数量比较丰富。

在获得的长梗杜鹃转录组所有SSR中，二碱基重复为最主要重复类型，占所有SSR的69.52%，其次是三碱基重复，占15.07%，这与许多物种以二、三碱基重复类型居多一致^[13-15]。袁阳阳等^[16]在莕菜(Nymphoidespeltata(Gmel.) O. Kuntze)转录组发现的12 319个EST-SSR位点中，二碱基和三碱基重复单元是主导类型，分别占总SSR的57.31%和30.87%；李美芹等^[17]从NCBI公共数据库现有杜鹃花相关EST中获得的435个SSR序列也以二、三碱基重复为主。一般认为，低级重复单元的大量存在暗示着该物种进化水平较高，而高级重复单元出现频率高的物种具有较短的进化时间或较低的变异频率^{[18, 19]}。长梗杜鹃中单、二和三碱基重复类型共占总SSR的96.77%，可能预示着其具有较高的变异频率或较长的进化历史，这或许在一定程度上支持了方瑞征和闵天禄^[20]所得结论，杜鹃属植物起源于距今约6 700万年至13 700万年中生代的白垩纪，具有悠久的进化历史。相比较而言，4~6 bp重复类型较少，且随着重复单元碱基数的增加，SSR出现频率、SSR含量以及分布密度随之升高，即六碱基SSR类型较多。在云南松(Pinus yunnanensis Franch.)^[21]转录组SSR分布特征研究中，也表现为六碱基较四、五碱基多。这可能与密码子以三碱基为一个单元有关，造成了三碱基位移^[22]。

SSR分布在不同物种间存在较大差异，且物种本身碱基组成也是选择的结果。在长梗杜鹃单碱基重复类型中，A/T基元占绝大多数，四、五、六碱基中AAAT/ATTT、AAAAT/ATTTT和AAAAAT/ATTTTT基元含量也相对较高，表现出一定的A/T优势，这可能与碱基所含的能量有关^[23]。但是主要重复类型二、三碱基的优势重复基元是AG/CT和AAG/CTT，分别占SSR总数的62.01%和4.23%，与蜡梅(Chimonanthus praecox (Linn.) Link)^[24]、碧桃^[9]、短丝木犀^[10]等植物转录组SSR分布的研究结果一致。在三碱基重复中，AAG/CTT、AGG/CCT和ACC/GGT基元所占比例最高，与王书珍等^[25]报道的杜鹃花EST-SSR序列三碱基中的优势基元AAG、ACC、AGA比较相似，许玉兰等^[14]对多数物种的统计也表明三碱基中AAG、AGC和AGG较多，这些较多的重复基元可能在EST序列中较为普遍，也可能是优势的蛋白或DNA家族^[26]。此外，长梗杜鹃中还发现了44个在植物转录组二碱基重复中比较罕见的CG/CG和240个在双子叶植物中分布较少的CCG/CGG重复基元，其含量远高于大多数植物，如甘蓝(Brassica oleracea L.)^[27](1个CG)、蜡梅^[24](6个CG)、杜仲^[8](1个CG)和短丝木犀^[12](13个CG、43个CCG)等，较多的CG和CCG重复基元可能与某些特定的功能相关，如抗逆性、转录调控和信号转导等^[28]。也进一步证明所得长梗杜鹃转录组SSR具有较高的特异性。

许多研究表明三碱基重复SSR是目前为止基因编码区中发现最多的SSR类型^{[29, 30]}。长梗杜鹃也不例外，结合SSR和CDS的位置信息，对SSR的分布区间进行统计，发现长梗杜鹃转录组SSR序列主要分布在非编码区，编码区SSR出现频率仅为非编码区的11/50，且编码区中三碱基SSR显著富集，占总检测量的48.57%，而非编码区以二碱基重复较多。这可能是密码子选择作用的结果，由于三碱基重复单元重复次数的变化对基因读码框和表达产物的影响较小，从而使其在编码区的容受性优于其他类型。这一现象也说明三碱基重复SSR富集是基因编码区SSR在基因组中得以保存的重要机制^[31]。Reddy等^[32]报道了人类基因组研究已经发现三碱基重复SSR与某些疾病的发生相关；将长梗杜鹃转录组测序所得全部Unigenes映射到KEGG代谢库，发现了176条与人类疾病相关的Unigenes，这是否与基因编码区富集的三碱基重复有关，对长梗杜鹃的生长发育又有什么意义仍有待进一步研究。

SSR位点多态性主要原因是基元重复数和碱基数不同而形成的序列长度多态性^[33]，一般重复次数越多，变异性越大，其多态性潜力越高。长梗杜鹃SSR重复次数波动于4~117次，以4~10次重复较多，其次是11~20次；其中单碱基因容易发生错配不考虑在内，其余的碱基重复类型重复次数也集中于4~36次的。从片段长度来看，当SSR长度≥20 bp时多态性较高，在12~20 bp之间多态性中等，＜12 bp时多态性极低^[34]，本研究在筛选过程中已经将＜12 bp的低多态SSR过滤掉，最终发现长梗杜鹃SSR序列长度变化范围是12~117 bp之间，平均长度为21.23 bp，其中≥20 bp的高多态重复序列占42.90%，其比例高于云南松^[21](14.76%)、碧桃^[9](12.13%)、短丝木犀^[10](13.47%)等大多数植物，由此推测长梗杜鹃转录组挖掘出的23 192个SSR位点大部分具有高多态性潜能。通过SPSS软件对SSR发生频率与重复片段长度进行Pearson相关性分析，发现二者显著负相关，相关系数为-0.566。在长梗杜鹃不同长度重复单元SSR长度变异分析中，二碱基重复SSR长度变异程度较高，有40种不同SSR变化长度，即二碱基类型获得或失去重复基元的活跃程度较高；其次是单碱基(28种)，而五碱基最低(仅4种)，且各重复类型均表现为SSR长度越长，出现的频率越低。表明由短重复单元组成的SSR比由长重复单元组成的SSR可能具有更丰富的多态性。

本研究通过Perl操作平台下的MISA软件对长梗杜鹃转录组中SSR序列进行查找，共搜索到23 192个SSR位点，对其分布频率、重复单元类型、重复基元碱基组成、在编码区中的分布特征、重复次数和序列长度分布及变异情况进行分析，得出大多数位点具有高多态性潜能，用于遗传分析的潜力很大，为长梗杜鹃SSR分子标记的大规模开发提供了重要的信息资源和数据保障。尤其是分布于编码区的序列，可能与某一特定功能相关联，有助于长梗杜鹃功能性SSR标记的开发，进而为该物种遗传多样性和遗传结构、遗传资源分类和进化以及分子标记辅助育种等方面的研究奠定基础。加之，EST-SSR具有较高的转移性，进一步开发的SSR标记有望用于杜鹃属植物及其它亲缘关系较近物种的研究中。