试验材料来源于本课题组野外调查的16个血皮槭天然群体(表 1)，每个群体随机选取1株个体为试材。新鲜叶片经硅胶充分干燥后，置于-80℃冰箱保存备用。

取干燥叶片30 mg，采用DNA提取试剂盒DP305 (Tiangen Biotech Co., China) 提取血皮槭叶片总DNA。采用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，G-box凝胶成像仪(Chemi XX6，Syngene)拍照检测DNA的质量，酶标仪(Spectra Max i3)检测DNA纯度和浓度。DNA浓度稀释到50 ng·μL^-1，放于-20℃冰箱保存备用。

从参考文献^[14-17]挑选了20对适合种内水平的cpDNA非编码通用引物，由上海美吉生物医药科技有限公司合成(表 2)。为对20对通用引物进行初步筛选，随机挑选2个样品进行PCR反应。反应体系20 μL，包括模板DNA 50 ng、2×Buffer Master Mix 10 μL、10 μmol·L^-1 F-primer 0.4 μL、10 μmol·L^-1 R-primer 0.4 μL、其余ddH₂O补齐。NdhF-rpl32，psbJ-petA序列的PCR程序：80℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，0.3℃·s^-1升温到65℃，65℃延伸4 min，30个循环；65℃延伸5 min。其他序列的PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶检测，筛选出条带清晰单一的引物；然后利用初筛合格的引物对所有样品进行PCR扩增，选择条带清晰明亮、无非特异性扩增的PCR扩增产物，送到上海美吉生物医药科技有限公司纯化，然后采用ABI 3730xl DNA analyzer进行测序。

根据原始峰图，使用Contig Express软件(Informax Inc.，North Bethesda，MD，USA)对cpDNA测序结果进行峰图检查及拼接，手工校对。然后，采用BioEdit v7.0.5.2软件^[18]分别对cpDNA序列进行比对和手工调整；利用MEGA v5.0^[19]计算信息位点。cpDNA序列的变异位点，都是潜在的信息位点(PICs)，包括核苷酸的替换、倒置、插入和缺失^[11]。利用MEGA v5.0进行聚类分析，采用邻接法(Neighbor joining)构建系统发育树，自展检验(bootstrap)通过1 000次重复获得。为获得血皮槭潜在信息位点(PICs)和变异率(V)，引入公式：

式(1)、(2)中：I表示序列插入和缺失数，S表示序列核苷酸替换数，R表示序列倒置数，A表示序列比对后长度。

酶标仪检测提取的DNA纯度和浓度都较高。OD₂₆₀ /OD₂₈₀为1.606~1.992，DNA浓度为42.8~154.2 ng·μL^-1，符合PCR反应所需的要求。电泳结果显示DNA条带清晰，满足后续试验要求。

所有20对cpDNA通用引物都能扩增出目的片段。其中9个cpDNA序列(表 2编号1-9)检测到不同程度的变异位点(表 3)，序列(表 2编号5-9)只检测到一个位点的变异(数据省略)。其余11个cpDNA序列(表 2编号10-20)未能检测到变异位点。

对9个序列的PICs值和变异率(图 1)进行比较，筛选出4个变异丰富的cpDNA序列，按照PICs值由高到低依次为ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA，trnD-trnT，变异率由高到低依次为trnH-psbA，ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnD-trnT。

图  1  血皮槭cpDNA非编码区序列的PICs值和变异率

Figure 1.  PICs values and sequence variation of Non-coding cpDNA sequences in A. griseum

血皮槭cpDNA非编码区序列的种内变异(PICs值)与其他木本植物相比很低(见表 4)。rps12-rpl20和rpl32-trnL序列在血皮槭中表现无变异，而在伞花木^[20](Eurycorymbus cavaleriei(Le′vl.) Rehd. et Hand.-Mazz.)群体和珙桐^[9](D. involucrata)群体检测到不同程度的变异；trnH-psbA，atpB-rbcL，ndhF-rpl32和psbJ-petA序列在血皮槭中的PICs值与其他木本植物如色木槭^[21](Acer mono Maxim.)、红枫^[22](Acer rubrum L.)、美洲糖槭^[23](Acer saccharum Marsh.)和观光木^[24](Michelia odora)相比很低。

基于4个序列ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA和trnD-trnT的比对结果，构建了血皮槭群体的系统发育树(图 2)。此系统发育树显示，16个群体明显分为两大支，SNJ、WX、ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX、XS群体聚为一支，LC、YC、HS、NX群体聚为一支。SNJ、WX群体和NX群体分别从两大支单独分离出来。位于大巴山脉东部的重庆巫溪(WX)和湖北神农架(SNJ)同聚为一支，位于秦岭山脉东部的河南栾川(LC)和内乡(NX)、山西阳城(YC)和陕西华山(HS)群体聚为一支。

图  2  血皮槭基于4个cpDNA片段的NJ系统发育树(群体的代码见表 1)

Figure 2.  NJ phylogenetic tree based on 4 cpDNA seqences of A. griseum(population codes are shown in Table 1)

与其他一些木本植物相比，血皮槭种内变异率较低。血皮槭的种内变异率较低的原因可能与只选用了较少的16个样品用于cpDNA序列筛选有关，在植物的谱系地理学研究中，天然群体的数量非常重要，样本数量越多越能全面反映其遗传变异情况；也可能与血皮槭及天然群体分布范围窄且呈片段化分布的特点有关，一般来说，广域分布的物种比狭域分布的物种拥有更丰富的遗传变异。例如广域分布的槭属植物如色木槭和糖槭的cpDNA序列变异率比狭域分布的日本红枫和血皮槭高很多。

通过构建系统发育树分析，16个群体明显分为两大支，而且两个分支内群体间地理距离较近，推测这两个分支的群体经历了长期的地理隔离，与其它群体之间缺乏有效的基因流。ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX和XS群体位于秦岭山脉、大巴山脉和武陵山脉，此区域位于华中地区的中心，独特的地形和复杂的气候是众多动植物的避难所，为物种的分化和地理隔离提供先决条件。此外，叶绿体基因流是通过种子进行母系传播，基于血皮槭翅果种子传播距离有限、空种率高和种子难以萌发等特性，加之恶劣生境的影响，限制了种子的传播，阻断了基因流，从而使血皮槭在区域内分化和地理隔离成为可能。

本研究通过对20个血皮槭叶绿体DNA非编码区差异序列进行筛选，共筛选出4个多态性较好的序列(psbJ-petA、ndhF-rpl32、trnD-trnT和trnH-psbA)。利用筛选得到的4个cpDNA序列对血皮槭16个群体进行系统发育分析，结果显示16个群体应分为两大类。本研究筛选获得的4个cpDNA序列在血皮槭种群内拥有相对丰富的变异，是研究种内变异良好的分子标记，可以进一步用于血皮槭系统发育、遗传变异和谱系地理学研究。