不同省份的128个核桃样品采集于2015年9—10月，包括河北、山东、河南、甘肃、陕西、新疆、四川和云南8个省份。样品采样点依据各省核桃主产区分布设置，详细采样信息见表 1。将采集的核桃放置在阴凉处风干，待青皮自然脱落，手工破壳后，取核桃仁放置烘箱60℃条件下使其干燥均匀，粉碎备用。

Milli-Q型纯水仪(Millipore公司，Bedford，美国)，实验用水为Milli-Q型纯水仪产生的超纯水；Mars 6型微波消解仪(CEM公司，Matthews，美国)；NexIon 300D电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(PerkinElmer公司，Shelton，美国)。

硝酸(Trace metal grade，Fisher公司，加拿大)；过氧化氢(优级纯，国药集团化学试剂有限公司，上海)；10 mg·L^-1 Al、As、B、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mo、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、Tl、V、Zn共19种元素标准储备液(o2si公司，美国)；10 mg·L^-1稀土元素标准储备液(Ce、Dy、Er、Eu、Gd、Ho、La、Lu、Nd、Pr、Sc、Sm、Tb、Tm、Y、Yb)(PerkinElmer公司，美国)；1 μg·L^-1(Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb、U)质谱调谐液(PerkinElmer公司，美国)；豆角成分分析标准物质(GBW10021，中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所，北京)。

准确称取核桃样品0.25 g(精确到0.000 1 g)于聚四氟乙烯消解罐中，加入6 mL HNO₃及3 mL H₂O₂，旋紧盖子，放入微波消解仪中。采用程序升温法进行消解，具体操作参数为：10 min内升至130℃，并在此条件下保持10 min；5 min内从130℃升至200℃并保持40 min。冷却后取出，缓慢打开消解罐盖排气，将消解罐放入赶酸仪，设定180℃赶酸至近干。消解罐取出冷却，将消化液转移至15 mL聚四氟乙烯试管中，用超纯水少量多次洗涤消解罐，洗液合并定容至10 mL，混匀备用。以同样方法制备试剂空白和豆角标准物质(GBW10021)。

测定样品前通过质谱调谐液调整仪器达到测定要求，使氧化物形成CeO/Ce < 1%，双电荷化合物形成Ce⁺⁺/Ce⁺ < 3%，仪器设定详细参数见表 2。测定Eu时，元素受BaO干扰较严重^[14]，采用校正方程进行校准：

式中：[(Ba(135)O)/Ba(135)] 为氧化物比；[151]、[135]分别为质量数151和135处的质谱的信号强度。采用外部校准法进行定量分析，用2%硝酸溶液配制混合标准溶液，其中Al、As、B、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mo、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、Tl、V、Zn元素浓度梯度为0.20、0.50、1.00、5.00、20.0、100.0 μg·L^-1，Ce、Dy、Er、Eu、Gd、Ho、La、Lu、Nd、Pr、Sc、Sm、Tb、Tm、Y、Yb元素浓度梯度为0.020、0.050、0.100、0.500、2.00、10.00 μg·L^-1。针对超过线性范围的Cu、Fe等元素，用1%硝酸(v/v)稀释20倍，进行上机测试。

试验采用标准物质豆角(GBW10021)对方法准确度进行验证，待测元素测定值在推荐值范围内，能满足实验要求。

试验数据采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、主成分分析和线性判别分析。

采用ICP-MS对8个省128份核桃样品进行测定，得到35种元素的含量(表 3)。为了解不同地域核桃样品中元素组成的差异，筛选与地域相关的元素指标，对不同省份核桃中35种元素含量进行单因素方差分析。结果(表 3)表明：Al、Fe、Ti、Co、Ni、Cu、Sr、Mo、Ba、B、As、V、Tl、Pb、La、Y、Sc、Nd、Sm、Eu等元素含量在不同产地核桃间差异显著(P < 0.05)。甘肃地区核桃中Al含量显著高于其它省份；河北、山东、河南、甘肃等地区核桃样品中Fe含量显著高于陕西、新疆、四川和云南等地区；云南地区核桃中Ni的含量高于其它省份；新疆地区核桃中Sr、Rb、As、V、Tl等元素含量与其它地区差异显著，其中，Sr、As、V含量显著高于其它省份，而Rb、Tl含量显著低于其它省份；甘肃、四川两省核桃中Pb含量显著高于其它省份；云南、四川、新疆、甘肃等地区稀土元素La、Y、Ce、Nd、Sm等含量明显高于河北、山东、河南和陕西等省份。可见，不同产区核桃中多元素组成具有其各自的特征。

为了将不同产地核桃中35种元素代表的大量信息压缩为少数的主成分，了解不同元素在空间的分布情况以及不同地区核桃样品中的特征元素，对8个产地128个核桃样品中35种元素进行主成分分析，选择特征值大于1的成分为主成分，得到8个主成分，累积变量达到80.5%，其中，第1主成分、第2主成分代表了49.3%的变量，第3主成分、第4主成分代表了14.9%的变量，核桃中35种元素前4个主成分载荷值见图 1。在第1主成分中，Y、Ce、Tb、Tm、La、Lu、Gd、Yb、Dy等稀土元素有较高的载荷值；在第2主成分中，Co、Fe、Rb、Zn、Tl、Cu和Cd等元素有较高的载荷值；在第3主成分中，Ba、Sm、Eu等元素有较高的载荷值；在第4主成分中，Mo、Ti等元素有较高的载荷值。前4个主成分包含了解释的总方差的64.2%的贡献率，故可认为不同地区核桃样品中的特征元素为稀土元素以及Co、Fe、Rb、Zn、Tl、Cu、Cd、Ba、Sm、Sc、Mo和Ti等元素。

图  1  核桃中35种元素前4个主成分载荷值

Figure 1.  Loading plot of the first 4 principal components of 35 elements in walnuts

主成分分析结果表明：多元素包含的信息能够反映出元素分布与不同产区核桃之间的关系，以核桃中多元素为变量对不同产地核桃进行鉴别是可行的。因此，应用线性判别分析(LDA)，选择以上35种元素为变量建立8个产地核桃判别模型。通过逐步判别分析，筛选出Al、Fe、As、Co、Ni、Cu、Zn、Sr、Pb、Cr、B、Ce、Sc、Nd、Eu、Tb、Yb和La共18种元素为鉴别不同地区核桃原产地的有效指标。

从核桃样品的第1判别函数和第2判别函数得分(图 2)可以看出：同一省份样品得分坐标距离较近，不同省份距离较远。表 4为LDA判别模型对8个不同地区核桃的分类和交叉验证结果，该模型交叉验证方式采用留一法验证，即只使用原始样本中的1个样本当作验证样本，而剩余样本用来建立模型，这个步骤一直持续到每个样本都被当作1次验证样本。从表 4核桃初始分类结果可以看出：河北、甘肃、陕西、新疆、四川和云南各省样品判别正确率均为100%，仅河南的1个样品被误判为山东产地。从表 4核桃交叉验证结果可以看出：河北、陕西各省样品交叉验证判别正确率均为100%，其它各省样品出现少量误判，整体交叉验证判别正确率为90.6%。因此，采用多元素线性判别分析对不同产地核桃进行鉴别效果较好。

图  2  核桃样品的第1判别函数和第2判别函数得分

Figure 2.  Scatter plots of walnuts sample scores of discriminant function 1 and discriminant function 2

为进一步研究线性判别分析对核桃地理标志与非地理标志产品鉴别效果，本研究选择了河南卢氏核桃(HN-LS)、河南非地理标志产品(HN-NGI)、甘肃成县核桃(GS-CX)、甘肃非地理标志产品(GS-NGI)、云南大姚核桃(YN-DY)、云南昌宁核桃(YN-CN)等知名地理标志产品以及非地理标志产品共47个样品，选择以上35种元素为变量建立不同产地核桃地理标志与非地理标志产品判别模型。通过逐步判别分析，筛选出Fe、As、Ti、Se、B、Sc、Th共7种元素为不同地区地理标志与非地理标志核桃鉴别的有效指标。

如图 3所示，从核桃样品的第1判别函数和第2判别函数得分可以看出：河南卢氏核桃与河南非地理标志产品得分坐标距离较远，云南大姚核桃与云南昌宁核桃样品得分坐标距离较近，甘肃成县核桃与甘肃非地理标志产品之间难以区分。表 5给出了LDA判别模型对不同地区核桃地理标志与非地理标志产品的分类和交叉验证结果。从初始分类结果可以看出：河南卢氏核桃与非地理标志产品区分明显，判别率达到100%；甘肃成县核桃1个样品被误判为非地理标志产品；云南昌宁核桃1个样品被误判为云南大姚核桃，初始分组案例中的95.7%个样品得到了正确分类。从表 5交叉验证结果可以看出：河南卢氏核桃、河南非地理标志产品、云南大姚核桃样品交叉验证判别正确率均为100%，云南昌宁核桃交叉验证分组案例中也有80.0%得到了正确分类，但甘肃成县核桃与甘肃非地理标志产品分组不理想，判别正确率只有16.7%~66.7%，整体交叉验证判别正确率为78.7%。

图  3  核桃地理标志/非地理标志产品的第1判别函数和第2判别函数得分

Figure 3.  Scatter plots of geographical/non-geographical indication walnuts scores ofdiscriminant function 1 and discriminant function 2

核桃中一些营养成分及微、痕量矿质元素对人体健康起到非常关键的作用。通过与其它果树坚果中元素含量相比，核桃中Fe的含量约为澳洲坚果(Macadamia ternifolia F. Muell.)、棕榈坚果(Orbignya speciosa Mart.)、腰果(Anacardium occidentalie Linn)、巴西坚果(Bertholletia excels H.B.K.)的1.82~6.37倍，Zn的含量约为澳洲坚果、棕榈坚果的1.76~5.30倍^[15-17]；Yin等^[16]对采自北京市大型超市的多种坚果研究结果显示，Zn、Cu元素含量低于本实验测定结果的平均值，而Rb、Sr和Mo含量与本实验结果相似。Pb、Cd、As作为有毒金属元素也受到人们广泛关注^[18-19]，测定结果显示，核桃样品中Pb、Cd和As含量分别为7.0、1.3和21.0 μg·kg ^-1，均未超过食品安全国家标准限量值^[20]。核桃中重金属元素及稀土元素含量较低，Mo、Co、Se等元素平均含量低于1.00 mg·kg ^-1，甚至La、Y、Ce等元素平均含量低于0.01 mg·kg ^-1。本实验测定的16种稀土元素中含量最高的为Sc、Sm、Y、Eu、Ce和La等，其平均含量分别为12.6、2.6、1.9、1.7、1.3和0.66 μg·kg ^-1，其中La和Ce约为蔬菜或主要食物中各种稀土元素平均含量的2.36%~5.57%^[21]，这也对核桃中痕量及超痕量元素的测定以及样品前处理方法、测定仪器条件提出了更高的要求。

目前，有很多研究针对不同产地核桃果壳特性及脂肪酸等成分组成的分析比较，王中奎等^[22]对新疆、西藏和黑龙江的不同品种核桃进行对比发现，不同产地的核桃果形指数、果壳厚度等差异显著，即使是同一地区的不同居群的核桃仁中各类氨基酸及氨基酸组成差异较大^[23-24]。郝常艳等^[25]针对不同产地主要品种核桃中总蛋白、总糖和脂肪酸含量进行了测定，结果表明，不同产地主要品种核桃中总蛋白、总糖含量差异不显著，油酸含量差异明显，但引起这种差异是来源于品种或产地尚不明确。王金星等^[26]利用西藏地区海拔落差大，形成许多独特的区域小气候的特征，对不同核桃实生农家类型以及天然居群研究发现，这种差异可能由于不同地区核桃生长与环境相互作用以及其本身基因的遗传变异共同作用的结果。因此，不同产地核桃中多种元素的差异也可能来源于不同地区的光照、湿度、土壤条件以及品种差异等因素。

通过对128个核桃样品中35种元素进行主成分分析，得到不同产地核桃样品中的特征元素为稀土元素以及Co、Fe、Rb、Zn、Tl、Cu、Cd、Ba、Sm、Sc、Mo和Ti元素。其中，稀土元素贡献率占到第1主成分的71.1%，Co、Fe、Rb、Zn、Tl、Cu和Cd元素的贡献率占到第2主成分的45.2%。通过逐步判别分析筛选出的18种元素为核桃产地鉴别的有效元素，其中包括Ce、Sc、Nd、Eu、Tb、Yb和La 7种稀土元素。由此可见，稀土元素在核桃产地鉴别时起到重要作用。

线性判别分析结果表明，8个省份核桃整体判别正确率为99.2%，3个省份6种核桃地理标志与非地理标志产品整体判别正确率为95.7%。从8个省份核桃样品的第1判别函数和第2判别函数得分可以直观地看出，河北、甘肃、新疆、陕西、四川、云南等省份核桃样品区分较好；山东、河南省份核桃样品区分时，容易出现误判，这可能是因为山东、河南、河北3个省接壤，种植土壤和气候条件的性质相似，导致元素含量水平接近。本研究选择了河南省、甘肃省和云南省知名地理标志产品以及3个省其它地区非地理标志产品进行判别分析，从47个核桃样品的第1判别函数和第2判别函数得分可以直观地看出，河南省卢氏核桃与河南非地理标志产品区分明显，但甘肃省、云南省地理标志产品与非地理标志产品第1判别函数和第2判别函数得分接近，容易出现误判。近年来，随着核桃种植业的不断发展，核桃产区也进行了一系列品种改良工作，核桃良种的相互引种^[4]也使得许多核桃产区品质与产量大幅提升，因此，在同一地区具有一定生产规模的地理标志产品与初步发展的非地理标志产品的品质具有一定的相似性，这也可能是造成甘肃成县核桃与甘肃非地标产品分组判别正确率低的重要原因之一。

应用ICP-MS测定了全国8个核桃主产省128份核桃样品中35种元素含量，对元素含量进行单因素方差分析、主成分分析(PCA)和线性判别分析(LDA)。比较发现，不同地区核桃样品中元素组成存在显著性差异(P < 0.05)。PCA可以简化核桃中多元素信息，能够反映出原始变量的主要信息，并筛选出其特征元素；应用LDA分别建立了不同产地核桃判别模型和核桃地理标志与非地理标志产品判别模型，整体判别正确率分别为99.2%和95.7%；但核桃地理标志产品与非地理标志产品判别模型进行交叉验证时，甘肃成县核桃与甘肃非地理标志产品判别正确率较低，仅为16.7%~66.7%，可能是由于同一地区地理标志产品与非地理标志产品的品种通过相互引种，以及相似的种植土壤和气候条件，使得该地区核桃品质具有一定的相似性。

核桃中许多成分存在的差异可能由于不同地区核桃生长与环境相互作用以及其本身基因的遗传变异共同作用的结果，本研究仅基于元素含量的统计学差异分析仍然存在一些不足。研究表明，通过筛选出多种元素作为不同省份核桃产地鉴别指标时，具有很高的正确率，但是对于地理位置较近区域的核桃产地鉴别并不理想。同时，由于核桃地理标志产品的认证目前主要基于其外观、蛋白质、脂肪等指标，因此，在进一步的研究中应基于多元素指标并结合脂肪酸组分、氨基酸组分等有机指标进行综合分析，以提高核桃产地鉴别的准确性与客观性。