毛竹笋试验地位于浙江省湖州市安吉县上墅乡刘家塘村(119°20′E，30°50′N)，该地区竹林覆盖率达75%，可利用毛竹林面积多达60 hm²。属于山区地带，平均海拔高于1 400 m；亚热带海洋性季风气候，雨量充沛，年降水量达1 300~1 400 mm；光照充足，年平均气温约16℃，年均无霜期达243 d。

试验于2016年4月在3年生毛竹林中进行。出土毛竹笋(AS)和未出土毛竹笋(US)挖取：各选取6株无病虫害、无机械损伤、高度达(45±3) cm且基部粗壮的竹笋，于“螺丝钉”^[16]处挖取。毛竹鞭笋(RS)挖取：于6月下旬(鞭笋旺期)在林中寻找，挖取完全不见光的完好鞭笋9株，长约(30±3) cm。竹笋样品采集后避光带回实验室。

感官评定样品：将采回的AS和US竹笋(各3株)去壳洗净，去掉严重老化的基部后依次按节切开，分1~9节，保证各节质量大于100 g，分别用搅拌机粉碎，各节称取20 g对应放入编号1~9的一次性杯中；RS竹笋取3株分别去壳洗净，分1~5段(其中1~4段为基部起1~4节竹笋，第5段为顶部分节不明显、节数较多的一段)，搅拌机粉碎，各节称取20 g放入对应编号1~5的一次性杯中。剩余样品放入对应编号的自封袋中，置于-20℃冰箱保存。感官评定样品准备完毕立即进行感官评定，试验于采样后6 h内完成。

水煮样品：另取AS竹笋3株，去壳洗净，纵向切取1/2，搅拌机粉碎混匀，称取10份100 g样品装入自封袋备用，剩余竹笋装入自封袋，标记后放入-20℃冰箱保存。

GC-MS成分分析样品：称取感官评定时粉碎的AS和US竹笋，1~9节每节竹笋称取3 g，各节竹笋所取样品混匀，取得单株样品27 g；RS竹笋单株1~5段各称取5 g混匀，每株样品25 g，分别装入编号自封袋中，放入-20℃冰箱中保存待测。

呈味物质含量测定样品：按节粉碎好的AS、US和RS 3种类型样品；AS鲜笋不同时间梯度水煮后分离的笋渣、笋汤。所有样品对应编号放入自封袋和200 mL带盖玻璃容器中，放入-20℃冰箱中保存待测。

氨基酸自动分析仪(日立L-8900)、岛津UV-2550紫外分光光度计、Waters e2695高效液相色谱仪、固相微萃取(SPME)装置、Agilent 7890N-5975气质联用仪、氮吹仪、搅拌机、离心机、美的电饭锅、恒温水浴锅等。

感官评定人员的培训参照国家标准GB/T12312-2012^[14]。对感官分析人员进行各种标准液及不同配比混合液品尝鉴定的培训，同时对不同辣味程度的水煮干辣椒溶液进行品尝，训练常见感官术语的记忆和滋味程度确认。所用干辣椒为小米椒烘干所制，小米椒属于高辣辣椒，辣度级别约为9(10级制)，SHU范围1.0~10.0万^[17]。经过培训和筛选，从自愿报名的20名科研人员中最终选定8人(3男5女，年龄23~45岁)组成感官评定小组。

毛竹鲜笋的口感滋味由感官评定小组采用线性标度法^[18]和量值估计法^[19]进行评定。评定前1 h禁食，且每次品尝不同样品前漱口，感官评定时将样品放入口中咀嚼并停留20~30 s。评定小组人员根据标准液(表 1)呈味特征及程度任选一种方法记录评定结果。

水煮时间梯度设置为0、0.5、2.5、6、10、20 min。将称量好的各份100 g AS竹笋取出，在电饭锅中加入200 mL水(饮用纯净水)，沸腾后将单份竹笋放入锅中，不断搅拌使竹笋充分散开，若水煮时间过长，水量蒸发过多，可遵循少量多次原则适量添加。水煮时间到后，立即切断电源，将混合汤渣倒入带滤网的玻璃容器中分离，冷却后重新测量笋汤体积，并参照鲜笋感官评定方法将笋渣和笋汤立即送感官小组进行感官评定。剩余笋渣和笋汤分别放入对应编号的自封袋和200 mL带盖玻璃容器中。

GC-MS测定送浙江大学动物科学院进行测定，设置方法参考文献[20]。

样品：准确称取备用的各处理单株混合样品5 g进行测定(重复3次)。

GC设置：载气为氦气(流速1.0 mL·min^-1)；石英毛细管色谱柱DB-5柱(60 mm × 0.25 mm × 0.25 μm)；进样口温度250℃；进样方式：不分流进样；升温程序：初始温度40℃，随后升到130℃(速度2.5℃·min^-1)，保持1 min，最终升温到250℃(速度8℃·min^-1)；汽化室温度250℃。MS设置：EI(电子轰击离子源)，设置温度230℃，高能电子70 eV轰击，电流200 μA，接口温度230℃，质量扫描范围m/z 50~500。

检索谱库：NISTlibrary和WILEY library 2个化合物检索质谱数据库进行匹配。

苦味游离氨基酸含量测定采用氨基酸自动分析仪法^[21]。氰化物含量测定采用异烟酸-吡唑啉酮比色法^[22]。氰苷和麻黄碱含量测定采用高效液相色谱法^[23-24]。单宁含量测定采用分光光度法^[25]。草酸含量测定采用反相高效液相色谱法^[26]。

以上所有测定指标均重复3次。

试验数据通过Excel 2003软件进行分析整理，采用SPSS19.0软件进行Pearson双变量显著相关性差异分析。

感官评定小组对3种类型毛竹笋进行辛辣味强度及变化趋势的感官评定结果(表 2)表明：AS和US竹笋均表现为辛辣味强度由笋基部到笋尖递增，AS竹笋基部1~3节约占整个竹笋1/3，辛辣味强度较低，第4节及以后辛辣味强度明显增加；US毛竹笋基部1~5节约占整个竹笋1/2，辛辣味强度较低，第5节及以后辛辣味强度缓慢增加。US竹笋各节辛辣味强度明显低于AS，其中，1~3节辛辣味强度值仅约为对应AS笋节的50%。RS竹笋感官评定1~5段口感滋味均为微甜，各节/段几乎无差异，因此结果无需列表分析。

毛竹笋(包含AS、US、RS)中发现43种成分，其中，酯类9种、醇类6种、酸类5种、酚类3种、酮类2种、醛类3种、烃类4种和其它11种。3种不同类型毛竹笋成分相对含量采用峰面积归一法进行计算，结果见表 3。

相对含量较高、不同类型竹笋间差异较大且与AS和US毛竹笋辛辣味强度变化趋势一致的成分有9种，分别为邻苯二甲酸二乙酯、4-羰基-己酸甲酯、5，9-二十碳二烯酸甲酯、草酸、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、单宁、2-硝基-2-丁烯、2，6-二甲基吲嗪和麻黄碱。其中，酯类物质3种，通常酯类物质的香气阈值较低^[27]，易产生芳香味，排除其对毛竹笋辛辣味的作用；2-甲氧基-4-乙烯苯酚常在糖果和烘焙食品中用作食品添加剂^[28]，而糖果和烘焙食品通常无辛辣味，推测其与辛辣味无关。GC-MS检测经验表明: 2-硝基-2-丁烯和2，6-二甲基吲嗪为分析汽化过程的中间产物，即并非竹笋自身所含物质，更非竹笋呈味物质；草酸、单宁2种成分与竹笋呈味密切相关^[6-7]；麻黄碱属于有机胺类生物碱，大多生物碱具有苦味，有些味极苦而辛辣，因此，推测麻黄碱与毛竹笋辛辣味有关。

前人研究毛竹、苦竹、麻竹、绿竹(Dendrocalamopsis oldhami (Munro) Keng f.)、雷竹(Ph. praecox C. D. Chu et C. S. Chao)等竹笋呈味物质^[6-12]过程中发现，苦味氨基酸、氰化物、氰苷、单宁和草酸等物质是竹笋主要的呈味物质。本次GC-MS分析中未检测到苦味氨基酸、氰化物和氰苷，其原因是GC-MS方法主要适用于易挥发物质的检测^[29]，而蛋白质、氨基酸等不易汽化，因此检测不到，实际分析中采用液相色谱来测定。GC-MS检测经验表明，氰化物和氰苷在检测过程中极易发生分解、转化，导致检测不到。结合本次GC-MS分析结果，选定苦味氨基酸、氰化物、氰苷、单宁、草酸和麻黄碱为毛竹笋辛辣味呈味物质的研究对象，进行含量测定(表 4)。

3种类型毛竹笋呈味物质含量和滋味强度比较结果为：苦味氨基酸含量RS竹笋> AS竹笋> US竹笋，麻黄碱含量RS竹笋> US竹笋> AS竹笋，不同类型竹笋辛辣味强度为AS竹笋> US竹笋> RS竹笋，即呈味物质含量和滋味强度不符，初步推断苦味氨基酸和麻黄碱与毛竹笋辛辣味无关。氰化物、氰苷、单宁、草酸和滋味强度变化均为AS竹笋> US竹笋> RS竹笋，推测其与毛竹笋辛辣味有关。鉴于不同呈味物质对滋味的作用存在明显的相互影响^[30]，即多种物质混合对滋味起作用，同时上述4种物质口感阈值尚未研究确定，因此，开展AS和US 2种类型毛竹笋呈味物质含量与滋味强度的相关性分析，显著性结果(表 5、6)表明：与AS毛竹笋辛辣味显著相关的物质有氰化物、氰苷、单宁和麻黄碱4种，相关系数分别为0.812、0.850、0.939和0.818(P＜0.01)；与US毛竹笋辛辣味显著相关的物质有氰化物、氰苷、单宁、草酸和麻黄碱5种，相关系数分别为0.905、0.857、0.939、0.889和0.937(P＜0.01)。

苦味氨基酸与2种类型毛竹笋辛辣味不相关，与表 4得出的结果一致，表明苦味氨基酸对毛竹笋辛辣味无影响。AS竹笋中草酸与辛辣味相关系数为-0.102，表明草酸与辛辣味不相关；而US竹笋中其相关系数为0.889(P＜0.01)，表现为极显著相关，但结合实际生产经验和品尝结果，US毛竹笋仅微有辛辣味，因此，推断草酸对毛竹笋辛辣味无影响。麻黄碱含量与2种类型毛竹笋辛辣味均呈极显著相关，辛辣味强度AS竹笋> US竹笋，但麻黄碱的绝对含量AS竹笋＜US竹笋，二者不一致，推测麻黄碱对毛竹笋辛辣味强度的影响与其呈味阈值有关，尚待进一步研究。

表 4、5结果一致的影响毛竹笋辛辣味的呈味物质为氰化物、氰苷和单宁，其中，单宁与氰化物、氰苷在AS竹笋中相关系数为0.658、0.859(P＜0.05)，US竹笋中为0.840(P＜0.01)、0.763(P＜0.05)，表明三者之间存在显著的相互作用关系，共同影响毛竹笋的辛辣味。此外，AS竹笋和US竹笋辛辣味有很大差异，不同点在于AS竹笋中与竹笋辛辣味相关的为百脉根苷，US竹笋中为亚麻苦苷。已知亚麻苦苷和百脉根苷同属氰苷中的单糖苷，最早在亚麻中分离出来，不同植物或同一植物不同部位合成量不同^[31]，因此，生长条件对其合成量有较大的影响，对毛竹笋辛辣味的具体影响方式还有待深入研究。

水煮试验笋渣、笋汤感官小组评定结果(表 7)表明：0~20 min不同时间AS竹笋水煮后，笋渣辛辣味强度逐渐降低，滋味特征与鲜笋同为辛辣味；笋汤则为苦涩味，且0~20 min苦涩味强度逐渐增加，不同于毛竹鲜笋。

笋渣、笋汤中呈味物质含量与滋味强度的相关性分析结果(表 8、9)显示：地上鲜笋水煮后与笋渣滋味强度显著相关的呈味物质有氰化物、氰苷和单宁，相关系数分别为0.859、0.861、0.933(P＜0.01)，与笋汤滋味强度显著相关的呈味物质有氰化物、单宁和草酸，相关系数分别为0.982(P＜0.01)、0.954(P＜0.05)、0.976(P＜0.01)。结果表明：AS、US毛竹笋和地上鲜笋水煮后笋渣中影响辛辣味的物质同为氰化物、氰苷和单宁，验证了此3种呈味物质对辛辣味的作用；而笋汤呈苦涩味，显示由氰化物、单宁和草酸引起，草酸与氰化物、单宁的相关系数分别为0.994(P＜0.01)、0.958(P＜0.05)，表明三者对呈味的贡献有很强的相互促进作用。

麻竹笋是主要的食用笋之一，其特点是竹笋出土见光后，苦涩味骤然增加，严重影响其食用品质。前人通过含量分析和感官评定相结合的方法，确定影响麻竹笋苦涩味的主要物质是草酸和单宁；在感官评定中，单宁标准液在2.6、3.0 mg·mL^-1分别达到极涩和极苦，草酸标准液在1.3、2.0 mg·mL^-1分别表现出涩味和酸味的极限，进一步说明草酸对单宁的苦涩味有增强作用，二者共同影响麻竹笋的苦涩味，最终建立研究竹笋苦涩味的方法和标准^[7]。对于毛竹笋，前人通过单宁、草酸、苦味氨基酸和类黄酮等含量测定和分析，认为影响毛竹笋苦涩味的主要物质为类黄酮、草酸和苦味氨基酸^[6]，但该研究基于假定单宁、草酸、苦味氨基酸和类黄酮为毛竹笋的呈味物质，且从光照强度与呈味物质含量变化角度研究得出的结论，并未同步进行感官评定，因此，该结论值得商榷。由于感官评定标准液种类和电子舌技术的限制，本研究参考GB/T12312-2012标准^[14]，设定不同浓度水煮干辣椒水溶液作为感官评定毛竹笋辛辣味的标准，对3种类型毛竹鲜笋及地上毛竹鲜笋水煮后笋渣、笋汤进行感官评定，并进行苦味氨基酸、氰化物、氰苷、草酸、单宁、麻黄碱等呈味物质的含量测定及与相应滋味强度的相关性分析，表明以水煮干辣椒水溶液作为感官评定毛竹笋辛辣味标准的方法有效可行。

我国主要几种食用竹笋的口感滋味不同，毛竹春笋为辛辣味，麻竹笋为苦涩味，绿竹笋几乎无辛辣、苦涩等刺激性滋味，其呈味原因各不相同。麻竹笋的苦涩味主要是高含量单宁和草酸相互作用的结果^[5]，绿竹笋口感滋味佳，主要是单宁等呈味物质含量较低、糖分含量较高^[32]的原因。不同植物的辛辣味主要由含硫化合物、生物碱、醇、酚等物质引起^[33-34]，本次GC-MS鉴定出的成分并无含硫化合物，由此可知, 毛竹笋的辛辣味与含硫化合物无关。研究发现，竹笋中的呈味物质主要有苦味氨基酸、草酸、单宁、氰化物和氰苷^[6-12]等，但对氰化物和氰苷并未开展感官评定。本研究通过各种分析，确定影响毛竹笋辛辣味的呈味物质为氰化物、氰苷和单宁，表明毛竹笋辛辣味与竹笋不同滋味的呈味物质存在差异。麻竹笋是出土见光后苦涩味极重的竹笋之一，其单宁含量约为2.0 mg·g^-1[7]，而毛竹笋中单宁含量高达7.64 mg·g^-1，远比麻竹笋的高。经高浓度单宁标准液品尝发现，5.0、7.0、10.0、15.0 mg·mL^-1浓度下，均呈极强苦涩味，且程度无明显差异，但均无辛辣味，因此表明，毛竹笋的辛辣味并非高含量的单因素所致，是氰化物、氰苷和单宁相互作用的结果。鉴于毛竹笋中氰化物和氰苷含量分别为0.001 33、0.001 338 mg·g^-1，仅约为单宁含量的1/6 000，而氰化物、氰苷类物质虽广泛存在于各类植物中^[35]，其含量远高于毛竹笋水平，但辛辣味在植物中不具有广泛性，表明氰化物和氰苷对毛竹笋辛辣味有独特的作用。由于氰化物和氰苷是有毒物质，无法通过与单宁配制标准液进行感官评定来验证它们的呈味特性，因此，需进一步探索有效方法进行研究。

通过GC-MS检测、HPLC等定性定量分析与感官评定相结合的方法，确定影响毛竹笋辛辣味的呈味物质为氰化物、氰苷和单宁，其影响是三者相互作用的结果，而与苦味氨基酸、草酸和麻黄碱无关。实际生产中，通过参考生产经验，可营造覆土不见光的生长环境，改善毛竹笋的食用品质，提高其经济价值，促进毛竹笋产业发展。