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植物诱导抗性是指植物在遭到植食者攻击、病菌入侵或外来因子破坏时，通过改变自身理化特性而表现出来的一种防御特性[1-2], 主要包括诱导抗虫性和诱导抗病性[3]。植物诱导抗虫性主要表现为提高防御酶活力以及增加次生代谢产物含量等，如单宁及酚类等次生化合物含量的变化，来影响昆虫的生长发育、取食等行为[4]。多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内主要防御性酶，胰蛋白酶抑制剂(TI)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)是植物体内2种主要的蛋白酶抑制剂(PIs)，它们都是植物体内重要的防御蛋白[5]；黄酮、单宁、木质素为植物次生代谢产物，通过莽草酸代谢途径形成的，与植物抗性密切相关[6]。
已有研究证明，能够激发植物诱导抗虫性的方法很多，包括植食者啃食与机械损伤[7]、光照强度[8]、外源激素处理[9]以及林分结构[10]等，其中，针阔混交林可以诱导针叶内次生物质含量发生改变。长白落叶松(Larix olgensis)是东北地区主栽树种，大多数人工林树种单一，结构简单，易发生森林病虫害，造成重大的经济损失[11]。在实践中人们认识到，林分多样性和稳定性与森林病虫害的发生密切相关，将营造混交林作为森林病虫害防治中的一项治本措施。黄金塔[12]对不同林分类型木麻黄蛀干害虫发生情况调查发现，木麻黄与湿地松、桉树混交可以减轻星天牛(Anoplophora chinensis)、多纹豹蠹蛾(Zeuzera multistrigata)等蛀干害虫对木麻黄的危害。刘巧红等[10]对自然状态下油松纯林和油松-山杏混交林内的油松针叶中的生化物质含量进行测定，发现不同时间混交林和纯林油松针叶内的蛋白质、可溶性糖、还原糖、粗脂肪、单宁、总酚含量有所差异；也有学者发现，落叶松混交林能够提高土壤微生物总量，使土壤中过氧化氢酶、蛋白酶、多酚氧化酶和蔗糖酶活性增强[13]；同时，落叶松枝叶的挥发性萜烯烃类能够明显抑制水曲柳的生长[14]，这些植物间的生化作用被称为植物化感作用。植物的化感作用在自然界中普遍存在，对林木生长发育具有非常重要的影响；然而，在针阔混交林中，这种化感作用对不同林型、树龄林木中抗虫性化合物的影响如何？还鲜见报道。为此，本试验以落叶松纯林、落叶松-水曲柳林混交林为试验对象，研究不同混交林分类型对长白落叶松针叶内防御蛋白活性及次生代谢物质含量的影响，探讨不同混交林型诱导长白落叶松抗虫性的差异，为林业造林合理营造混交林防治害虫提供借鉴。
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2015年7月在东北林业大学帽儿山实验林场选取2个试验地点：
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地理位置为127°36′~127°39′ E，45°23′~45°26′ N，平均海拔390 m。平均降水量为723 mm，无霜期120~140 d，≥10℃的积温为2 526℃。试验地落叶松纯林和落叶松与水曲柳混交林营造于1987年，纯林和混交林同处于东坡的中下部, 坡度为6°~15°，土壤是典型暗棕壤，林下植被主要有错草、毛边苔草等。
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127°30′~127°34′ E，45°20′~45°25′ N，平均海拔300 m。年平均降水量780 mm，无霜期120~140 d，有效积温2 636℃。该试验地落叶松纯林和落叶松与水曲柳混交林营造于1997年。纯林和混交林同处于东坡的中下部, 坡度为6°~10°，土壤为黑土壤，林下植被主要为小叶樟等居多。
2个试验地均选取2年生水曲柳苗木造林，落叶松为3年生苗木造林，株行距均为1.5 m×2 m，林分类型见表 1。
表 1 不同样地的林分类型
Table 1. Forestry typle of different sample stands
试验样地
Sample stands林龄
Forest age/a林分类型
Forestry typle标记编号
Tag number林分密度
Forestry density/(tree·hm-2)尖砬沟 30 落叶松纯林 CL30 2 886 落叶松4行-水曲柳4行混交 HJ30(4:4) 2 315 张家湾 20 落叶松纯林 CL20 2 409 落叶松4行-水曲柳4行混交 HJ20(4:4) 1 825 落叶松2行-水曲柳10行混交 HJ20(2:10) 1 950 -
分别选取长势一致的3株落叶松针叶为1次重复，每种林型3次重复，每个重复采摘50 g针叶。将针叶置于冰箱冷冻保存，用于测定针叶内相关蛋白酶活性和防御性化合物含量的变化。
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每个样品准确称取0.5 g针叶鲜样放于研钵内，加入液氮，在冰浴条件下研磨用于测定防御酶活性。参照杨世勇等[15]人的方法对PPO进行提取和酶活性测定，加入0.5 mL酶液，以0.5 min内OD420变化0.01为1个酶活单位(U·g-1)，重复5次。参照王燕芳等[16]的方法对PAL进行提取和酶活性测定，加入0.2 mL酶液，以单位时间(h)内OD290增加0.01为1个酶活性单位(U·g-1)。
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TI和CI活力的测定参照石蕾[17]的方法，并略作修改。酶活性测定时，酶液和抑制剂加入量分别为100 mL和20 mL、80 mL和40 mL, 每个重复测定5次。
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参照武予清等[18]的方法测定单宁的含量；参照杨帆[19]的方法测定黄酮含量；木质素含量的测定参照任琴等[20]和林葵等[21]的方法，均重复测定5次。
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利用SPSS17.0软件对张家湾落叶松林型中的落叶松针叶内防御酶活性及次生物质含量进行One-Way ANOVA方差分析，以LSD(最小显著法)法进行多重比较分析；以独立样本T检验对尖砬沟落叶松林型中落叶松针叶内防御酶活性及次生物质含量变化进行差异显著性分析。
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由图 1可知：与落叶松纯林(CL30)相比，尖砬沟30年生(HJ30(4:4))落叶松-水曲柳带状混交林落叶松针叶内的PPO活性升高33.0%，且差异显著(P < 0.05)；HJ30(4:4)针叶内的PAL活性也显著高于CL30(P < 0.05)。与落叶松纯林(CL20)相比，张家湾20年生(HJ20(4:4)和HJ20(2:10))落叶松-水曲柳带状混交林落叶松针叶内PPO活性分别升高41.2%和18.1%, 且差异显著(P < 0.05)；PPO、PAL活性在HJ20(4:4)针叶内活性最强，显著高于CL20和HJ20(2:10)(P < 0.05)；HJ20(2:10)针叶内PAL活性与CL20相比也有所增高，但差异不明显(P>0.05)。
图 1 落叶松-水曲柳不同混交林型内落叶松针叶内PPO和PAL活性的变化
Figure 1. Changesof the activityof PPO and PALin larch needles of different larch-ash mixed forests
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图 2表明：与CL30相比，HJ30(4:4)落叶松针叶内CI、TI活性分别增高37.0%、17.8%(P < 0.05)。与(CL20)相比，HJ20(4:4)和HJ20(2:10)落叶松针叶内CI活性分别增加26.0%和62.0%，且差异明显；在HJ20(2:10)落叶松针叶内CI活性最高，并显著高于HJ20(4：4)(P < 0.05)；在HJ20(4:4)和HJ20(2:10)落叶松针叶内TI的活性均显著高于CL20(P < 0.05)，但HJ20(4:4)中TI活性与HJ20(2:10)差异不显著(P>0.05)。
图 2 落叶松-水曲柳不同混交林型落叶松针叶内CI和TI活性的变化
Figure 2. Changesof the activityof CIandTIin larch needles of differentlarch-ash mixed forests
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由图 3可知：HJ30(4:4)落叶松针叶内单宁、黄酮和木质素含量均显著高于CL30(P < 0.05)。与对照(CL20)相比，HJ20(4:4)落叶松针叶内各次生物质的含量均显著增加(P < 0.05)；HJ20(4:4)针叶内单宁含量低于HJ20(2:10)，黄酮含量略高于HJ20(2:10)，但二者差异均不显著(P>0.05)；HJ20(4:4)落叶松针叶内木质素含量最高，并显著高于HJ20(2:10)和CL20(P < 0.05)，HJ20(2:10)高于CL20，但差异不显著(P>0.05)。
图 3 落叶松-水曲柳不同混交林型落叶松针叶内单宁、黄酮和木质素含量的变化
Figure 3. Changesof the contentof tannin, flavonoids and ligninin larch needles of differentlarch-ash mixed forests
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2种植物可以通过它们之间的相互作用以及在生长发育过程中产生的初生和次生代谢产物来调节各自的防御指标，使植物防御能力发生改变[22-23]。陈晨等[24]研究了油松纯林和油松-山杏混交林对油松毛虫生长发育的影响发现，与油松纯林相比，混交林油松针叶延长了油松毛虫的发育历期、抑制了油松毛虫的生长发育。郑丽等[25]研究不同浓度的黄顶菊茎、叶浸提液对白菜、水稻幼苗的化感作用，结果表明黄顶菊茎、叶浸提液对这2种植物的POD、CAT、SOD的活性均有显著的抑制作用，使受体对外界不良环境的抵抗力降低。王杰等[26]利用外源茉莉酸喷施长白落叶松和王琪等[27]剪叶损伤及昆虫取食落叶松针叶，可以系统的增强其防御蛋白的活性，本研究也得出了与之相一致结果，这说明混交林处理产生的化感作用也能够提高长白落叶松针叶内的防御化合物浓度，并对落叶松具有较强的诱导效应。
落叶松与水曲柳比较适宜的混交方式通常为行间和带状混交，带状混交经营管理方便，种间关系协调，容易获取成功[28]；同时，不同带状混交对混交林的生长发育也起着重要作用，并对落叶松针叶内防御化合物的含量或活性产生不同的影响[10]。以往许多学者在混交林造林技术上建议采用3~5行的混交方式[29]，本研究发现落叶松-水曲柳4:4带状混交林中长白落叶松的抗性最强，此结果与之相类似。
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在本研究所选取的落叶松3种林型中，落叶松-水曲柳混交林针叶内PAL、PPO、CI、TI活性及单宁、木质素和黄酮含量均高于落叶松纯林；落叶松-水曲柳4:4和2:10带状混交林落叶松针叶内PAL、PPO和TI的活性以及次生代谢产物木质素和黄酮含量均较高，同时CI活性和单宁含量也显著高于对照，表明植物抗性与混交林分类型有关。这种种间的效应表明，落叶松-水曲柳4:4带状混交林中长白落叶松的抗性最强。基于本研究结果，笔者建议在营造落叶松-水曲柳人工混交林时，为了充分发挥混交的优越性、便于管理的同时，又能增强植物自身的化学防御，最好采取针阔树种混交均匀的带状混交方式行营造。
随着人们对生态环境保护意识的提高，对害虫的防治工作已从化学防治为主的综合防治措施向以营林措施为基础的自然控制方向发展[30]。营造混交林是林业有害生物防治的一种重要手段，也是生态控制害虫的一种措施[31]。混交林与单纯林相比，在林分稳定性、抗御病虫害以及发挥森林多种效益等方面表现出明显的优势[32-33]。
落叶松林型对其针叶内几种防御蛋白活力和次生代谢物含量的影响
Effects of Forest Type on Activity of Several Defense Proteins and Contents of Secondary Metabolites in Larch Needles
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摘要:
目的 为明确落叶松林型对其化学防御能力的影响。 方法 本实验以长白落叶松纯林及长白落叶松-水曲柳4:4、2:10带状混交林为研究对象，分析不同林型下落叶松针叶内几种防御蛋白活力及次生代谢化合物含量的变化。 结果 表明：30年生（HJ30（4:4））和20年生（HJ20（4:4））落叶松与水曲柳4:4带状混交林中，落叶松针叶内几种防御蛋白活力和次生代谢物含量均显著高于纯林（P < 0.05）；在HJ20（4:4）中，落叶松针叶中PPO、PAL、TI活力及黄酮和木质素含量最高，且PPO、PAL活性和木质素含量显著高于20年生（HJ20（2:10））落叶松与水曲柳2:10带状混交林（P < 0.05）；在HJ20（2:10）中，落叶松针叶内CI活性显著高于HJ20（4:4）（P < 0.05），单宁含量也高于HJ20（4:4），但差异不显著（P>0.05）。 结论 试验发现，长白落叶松-水曲柳带状混交林成林显著增强落叶松针叶内防御蛋白活力、增加次生代谢物的含量，从而提高了长白落叶松自身抗虫性；且HJ20（4:4）对落叶松的诱导防御能力强于HJ20（2:10），HJ20（4:4）混交方式比HJ20（2:10）更适用于混交林营造。 Abstract:Objective To illuminate the effects of the forest type on chemical defense of pure and mixed larch stand. Method Larch (Larix olgensis) forest and larch-ash (Fraxinus mandschurica) mixed forest were used as the test materials, and the activity of several defense proteins and the content of secondary metabolic compounds were tested in larch needles of different forest type. Result The results showed that the activity of several defense proteins and the content of secondary metabolites in larch needles of 30-year-old larch-ash mixed by strips of 4:4 (HJ30(4:4)) and 20-year-old larch-ash mixed by strips of 4:4 (HJ20(4:4)) significantly increased, compared with that of 30-year-old L. olgensis pure stand (CL30) and 20-year-old L. olgensis pure stand (CL20) (P < 0.05). It was found in Zhangjiawan site that the activities of polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonia-lyase (PAL), trypsin inhibitor (TI) and the contents of flavonoids and lignin in larch needles of HJ20(4:4) were the highest, while the activities of PPO, PAL and the content of lignin were higher than that in larch needles of 20-year-old larch-ash mixed by strips of 2:10 (HJ20(2:10)) (P < 0.05). In larch needles of HJ20(2:10), the CI activity significantly increased (P < 0.05), and the tannin content added (P>0.05) in contrast to that in needles of HJ20(4:4). Conclusion These results indicate that larch-ash mixed forests significantly strengthen the activity of defense proteins and increase the content of secondary metabolites in larch needles, which improve the resistance to defoliators. Compared with HJ20(2:10), the induced defense of HJ20(4:4) is stronger, and HJ20(4:4) is more applicable to build the mixed forest. -
图 1 落叶松-水曲柳不同混交林型内落叶松针叶内PPO和PAL活性的变化
Figure 1. Changesof the activityof PPO and PALin larch needles of different larch-ash mixed forests
图 2 落叶松-水曲柳不同混交林型落叶松针叶内CI和TI活性的变化
Figure 2. Changesof the activityof CIandTIin larch needles of differentlarch-ash mixed forests
图 3 落叶松-水曲柳不同混交林型落叶松针叶内单宁、黄酮和木质素含量的变化
Figure 3. Changesof the contentof tannin, flavonoids and ligninin larch needles of differentlarch-ash mixed forests
表 1 不同样地的林分类型
Table 1. Forestry typle of different sample stands
试验样地
Sample stands林龄
Forest age/a林分类型
Forestry typle标记编号
Tag number林分密度
Forestry density/(tree·hm-2)尖砬沟 30 落叶松纯林 CL30 2 886 落叶松4行-水曲柳4行混交 HJ30(4:4) 2 315 张家湾 20 落叶松纯林 CL20 2 409 落叶松4行-水曲柳4行混交 HJ20(4:4) 1 825 落叶松2行-水曲柳10行混交 HJ20(2:10) 1 950 
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