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TALE(Three Amino Acid Loop Extension)蛋白因其在第一和第二螺旋结构中含有3个额外的氨基酸而得命,存在于所有的真核生物中,植物中TALE家族包含2个亚家族:KNOX(KNOTTED-like homeobox)和BELL(BELL-like homeobox)[1]。植物KNOX家族中首次被克隆得到的成员是玉米(Zea mays L.)中的Knotted1(KN1)基因,因其突变体叶片上产生结状物凸起而得名[2]。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L.)等植物中KN1同源基因被克隆,这类基因被归为KNOX家族。根据基因结构与表达模式方面的差异,KNOX基因家族被分为2个亚类:Ⅰ类KNOX和Ⅱ类KNOX[1]。
拟南芥中Ⅰ类KNOX包含4个成员,分别是:SHOOTMERISTEMLESS(STM)、BREVIPEDICELLUS(BP)、KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana 2(KNAT2)以及KNAT6[3]。Ⅰ类KNOX主要参与顶端分生组织(SAM)建成与功能维持过程,同时也参与调控侧生器官的形态发生[4]。STM主要在SAM中表达,其主要通过调控赤霉素与细胞分裂素的合成和降解途径,维持SAM中高细胞分裂素浓度和较低赤霉素含量,从而维持SAM中持续分裂分化的能力,stm突变体表现为SAM缺失[5]。KNAT2主要参与心皮的形成,而与KNAT2结构极为相似的KNAT6则参与调控侧根的形态建成过程。另外,KNAT2与STM在胚胎分生组织功能维持及边界建立中存在功能上的冗余[6]。BP与STM共同参与SAM建成过程的调控,但BP除了影响SAM建成外还调控花序轴的形态建成,bp突变体中花梗与花序轴之间的夹角显著大于野生型,而knat2knat6双突变能够使bp突变体花梗形态向野生型恢复,因此,在花序生长过程中,BP通过抑制KNAT2和KNAT6表达,从而保证花序轴上花梗正常的形态发生[7]。
拟南芥中Ⅱ类KNOX基因包括4个成员,分别是:KNOTTED-like from Arabidopsis thaliana 3(KNAT3)、KNAT4、KNAT5以及KNAT7,Ⅱ类KNOX基因表达模式相对广泛,且功能多样[8]。KNAT3和KNAT4负调控侧根形成,KNAT7则与BELL家族的BLH6形成二聚体进而调控次生细胞壁形成[9]。拟南芥中已证明在过表达Ⅱ类KNOX基因后,Ⅱ类KNOX与BELL家族成员选择性结合形成二聚体,抑制SAM活性,同时影响叶片形态建成[10]。
综上所述,Ⅰ类KNOX在植物分生组织建成及功能维持中起关键作用,是植物分生组织启动和器官发生的重要调控因子。但目前杨树中仅完成了对拟南芥STM、BP同源基因ARBORKNOX1(ARK1)、ARBORKNOX2(ARK2)功能的初步研究,认为它们参与调控木本植物形成层的分化,而杨树中Ⅰ类KNOX其他成员的功能尚不清楚[11-12]。本文对拟南芥与杨树中Ⅰ类KNOX成员的蛋白结构、进化关系等进行比较分析,同时利用RT-PCR方法分析杨树Ⅰ类KNOX基因在不定芽、不定根形成过程中的表达,探讨杨树Ⅰ类KNOX在分生组织建成及器官分化过程中的作用,为杨树Ⅰ类KNOX基因的功能解析提供参考。
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本实验所用实验材料均取自84K。
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选取处于相同生长状态的84K组培苗的第3片展开叶,将叶片主叶脉切断,置于分化培养基,诱导不定芽的发生。分别在0、2、4、6、8、10、14、16、18、20 d截取叶片伤口部位及后期诱导产生的不定芽。取材时间固定在11:00 am,所取材料均置于液氮中保存。
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转接相同生长状态的84K组培苗于生根培养基中,分别在0、2、3、4、5、6、7、8、15、17 d截取茎段伤口部位及后期诱导产生的不定根。取材时间固定在11:00 am,取材后将样品置于液氮中保存。
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将3年生84K剥皮,剥皮后在树皮上轻轻划取薄薄的一层松软组织,主要包含了形成层组织及未成熟木质部,并迅速将其置于液氮中保存。
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以拟南芥Ⅰ类KNOX基因STM的蛋白序列在毛果杨基因组(POPGENIE, http://popgenie.org)中进行BLAST分析,获取杨树Ⅰ类KNOX基因的核酸及氨基酸序列;通过Clustalw2.0软件对拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因的氨基酸序列进行比对分析。利用Mega6.0软件采用基于遗传距离的邻近法构建拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因的系统进化树。根据拟南芥和杨树的Ⅰ类KNOX基因序列信息,通过GSDS2.0(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/)在线分析杨树Ⅰ类KNOX基因的内含子与外显子结构,并绘制基因结构图。
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不定芽与不定根形成过程中不同时期的RNA提取与第一链cDNA合成分别采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)与PrimeScriptTM RT Reagent Kit(TaKaRa)完成,具体方法参见试剂盒使用说明。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit(TaKaRa)在Roche LightCycle 480 Ⅱ仪器上完成。杨树Ⅰ类KNOX基因定量引物(表 1)使用在线引物设计软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)设计得到。
表 1 杨树中Ⅰ类KNOX基因qRT-PCR引物序列
Table 1. Primers used for qRT-PCR analysis.
引物名称
Primer Name引物序列
Primer SequenceARK1-rtF ATTGGTGGAGCAGGCATTAC ARK1-rtR CATCCATCACCACAAACTGC ARK2-rtF TGGACTGCCAAAAGGTAGGA ARK2-rtR GTCTTGTAAGCTCCTCACGGTA PtSTMb-rtF TTCTGCTCATCAGCATCACC PtSTMb-rtR CCAGTCGCAGTGACAGTGTT PtKNAT2/6a-rtF CGCAGATTGCACGTTTCTTA PtKNAT2/6a-rtR AGGCCTTTCAAGATCGGATT PtKNAT2/6b-rtF CCTACTTGGATGGTGGGATG PtKNAT2/6b-rtR CAGCAAATTGCAGGTTCTCA PtKNAT2/6c-rtF AACGAGGATCGAGAGCTGAA PtKNAT2/6c-rtR ATCAGCTTCCGTTGGGTATG PtKNAT2/6d-rtF GCTTCAATGGTGGTGGAGTT PtKNAT2/6d-rtR ATCGTTCTCTTCCCGGATTT PtKNLPa-rtF GTGCACCTCCAGAAATGGTT PtKNLPa-rtR CGTCAAACGGCTTGGATAAT PtKNLPb-rtF CTTGAAGCCATAGGCAGAGG PtKNLPb-rtR TCAAGAACGTAGCAGCCTCA PtKNLPc-rtF GGGAGGTTGAAGCATCTGAA PtKNLPc-rtR TCGCTTTCTCCTCTTCCGTA PtACTIN-rtF AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG PtACTIN-rtR GCATCATCACAATCACTCTCCGA -
以拟南芥STM蛋白序列在毛果杨基因组中进行同源序列比对,得到杨树10个Ⅰ类KNOX基因。利用Mega6.0软件构建了杨树和拟南芥Ⅰ类KNOX基因的系统进化树(图 1A),并根据系统进化树中两物种间相对应的基因关系,对杨树中Ⅰ类KNOX成员进行命名,其中,2个与AtSTM同源的基因,分别命名为PtSTMa与PtSTMb,PtSTMa即为之前报道的杨树ARK1基因[11];与AtBP同源的基因仅1个,命名为PtBP,PtBP与之前报道的杨树ARK2基因为同一基因[12];与AtKNAT2和AtKNAT6同源的基因有4个,分别命名为PtKNAT2/6a、PtKNAT2/6b、PtKNAT2/6c和PtKNAT2/6d;另外,还有3个基因没有与拟南芥相对应的同源基因,将其顺次命名为KNOTTED-like from Populus a(PtKNLPa)、PtKNLPb与PtKNLPc。同时参考基因结构图(图 1B),将杨树中Ⅰ类KNOX分为3组:组1、组2、组3。组1为KNAT2和KNAT6类基因,组2为STM和BP类基因,组3为杨树所特有的Ⅰ类KNOX基因。
图 1 拟南芥与杨树中Ⅰ类KNOX系统进化树(A)及基因结构分析(B)
Figure 1. Phylogenetic tree and gene structure of Class Ⅰ KNOX from Arabidopsis and Populus
杨树中多数Ⅰ类KNOX基因长度在3 kb以上,均长于拟南芥中Ⅰ类KNOX基因。组1成员中,PtKNAT2/6a包含6个外显子,比同组中的其它基因多1个外显子。组2基因中,ARK1和PtSTMb含3个内含子,而同组中的其他基因均含有4个内含子(图 1B,表 2)。这些基因内含子、外显子结构的变化表明了在杨树Ⅰ类KNOX进化过程中发生了外显子获得与内含子丢失事件。
表 2 杨树中Ⅰ类KNOX成员信息
Table 2. Detailed information about Class Ⅰ KNOX genes from Populus
基因名称
Gene name基因号
Locus染色体上位置
Genomic position亚细胞定位预测
POSRT prediction氨基酸数
Protein length内含子数
intronsARK1 Potri.011G011100.1 Chr11:844486-848858- N: 14 373 3 ARK2 Potri.002G113300.1 Chr02:8461980-8468320 + N: 14 368 4 PtSTMb Potri.004G004700.1 Chr04:304576-308944 + N: 14 369 3 PtKNAT2/6a Potri.008G188700.1 Chr08:13039428-13047773 - N: 12, C: 1 341 5 PtKNAT2/6b Potri.010G043500.1 Chr10:7430322-7440628 + N: 10, C: 2 309 4 PtKNAT2/6c Potri.012G087100.1 Chr12:11401140-11409183 - N: 14 340 4 PtKNAT2/6d Potri.015G079100.1 Chr15:10400171-10408171 + N: 14 347 4 PtKNLPa Potri.013G008600.1 Chr13:557144-561807 + N: 12, M: 1 320 4 PtKNLPb Potri.005G014200.1 Chr05:1100485-1105673 + N: 14 317 4 PtKNLPc Potri.005G017200.1 Chr05:1390283-1394969 + N: 13 316 4 注:N:细胞核;C:细胞质;Ch:叶绿体;M:线粒体。
N: nucleus: C: cytoplasm; Ch: chloroplast; M: mitochondria.KNOX家族成员由MEINOX、ELK与homebox KN保守结构域组成,MEINOX结构域位于KNOX蛋白N端,由KNOX1和KNOX2两个亚结构域组成。通过多重序列比对及Ⅰ类KNOX蛋白质结构域分析(图 1B)发现,杨树与拟南芥中Ⅰ类KNOX蛋白结构相似,均含有以上4个结构域:KNOX1、KNOX2、ELK和homebox KN结构域,说明Ⅰ类KNOX进化历程中蛋白质结构相对保守。
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不定芽与不定根的再生过程能够模拟SAM与RAM的发育过程,根据杨树不定芽与不定根再生过程中形态学观察(图 2),将此过程分三个阶段:分生组织形成阶段、芽(根)原基形成阶段、不定芽(根)形成阶段,其中,不定芽再生过程中06 d为分生组织形成阶段(图 2A),7~11 d为芽原基形成阶段(图 2B),12~20 d为不定芽形成阶段(图 2C);在不定根再生过程中04 d为分生组织形成阶段(图 2D),5~6 d为根原基形成阶段(图 2E),7~17 d为不定根形成阶段(图 2F)。
不定芽发生过程中,杨树Ⅰ类KNOX成员的表达量在不定芽形成的3个阶段中均表现出短暂的上调趋势,但上调时间与上调幅度存在差异,因此,将总的变化趋势分为以下3种(图 3):(1)芽原基形成时期表达量出现上调趋势,此类基因包括组1的PtKNAT2/6d、组2的ARK1和PtSTMb及组3的PtKNLPa和PtKNLPb(图 3A);(2)组1的PtKNAT2/6a表达量在芽原基分化产生不定芽的关键时期特异上调,而在不定芽发生过程的其他阶段表达量较低且无显著变化(图 3B);(3)不定芽发育前期表达量较低且变化不大,而在不定芽形成后表达量多次呈现上调的变化趋势,此类基因主要有组1的PtKNAT2/6b和PtKNAT2/6c、组2的ARK2与组3的PtKNLPc(图 3C)。
图 3 杨树Ⅰ类KNOX成员在不定芽形成过程中的表达分析
Figure 3. Expression alteration of Class Ⅰ KNOX members during the regeneration of adventitious shoot
在不定根的形成过程中,根据Ⅰ类KNOX基因表达分析,可总结为2种变化趋势(图 4):(1)表达量在根原基分化产生不定根的关键期出现短暂的上调,包括组1的PtKNAT2/6a、PtKNAT2/6b、PtKNAT2/6d和组3的PtKNLPb(图 4A);(2)表达量在分生组织与根原基形成阶段不断下调,而在不定根形成后期呈现上调的趋势,包括组1的PtKNAT2/6c、组2的ARK1、ARK2、PtSTMb和组3的PtKNLPa、PtKNLPc(图 4B)。
图 4 杨树Ⅰ类KNOX成员在不定根形成过程中的表达分析
Figure 4. Expression alteration of Class Ⅰ KNOX members during the regeneration of adventitious root
为考察杨树Ⅰ类KNOX基因与形成层这一木本植物特有的分生组织之间的关系,对杨树Ⅰ类KNOX基因在形成层区域(形成层+未成熟木质部)中的表达量进行了检测,结果(图 5)显示:Ⅰ类KNOX的成员在形成层区域中均有一定的表达,其中,PtKNAT2/6b、ARK2及ARK1表达量明显高于其他成员,表明PtKNAT2/6b、ARK2及ARK1可能参与调控形成层活动或木质部分化过程。上述结果与ARK1、ARK2调控形成层细胞分化活性的结论相一致[11-12]。
杨树中Ⅰ类KNOX基因结构、表达与功能分析
Structure, Expression and Function Analysis of Class Ⅰ KNOX Genes in Populus
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摘要:
目的 分生组织对器官发生和形态建成起到至关重要的作用,其活性受多种转录因子的调控。KNOTTED-like homeobox(KNOX)基因家族由2个亚类即Ⅰ类和Ⅱ类KNOX组成,在模式植物拟南芥中Ⅰ类KNOX成员主要在茎的顶端分生组织区域表达,对维持顶端分生组织分化及侧生器官的形态建成过程起关键作用。木本植物生长发育过程主要包含以顶端分生组织(Shoot apical meristem,SAM)为中心的初生生长与以形成层为中心的次生生长过程,本研究通过分析杨树Ⅰ类KNOX基因在SAM、根顶端分生组织(Root apical meristem,RAM)的形成过程及形成层相关区域的表达,探讨Ⅰ类KNOX基因在杨树分生组织形成与分化过程中的功能。 方法 以拟南芥Ⅰ类KNOX基因STM的蛋白序列在毛果杨基因组中进行同源比对分析,获取杨树Ⅰ类KNOX成员的核酸和氨基酸序列。根据核酸及氨基酸序列信息构建系统发育树,并绘制基因结构与蛋白质结构图谱。利用84K杨(Populus alba×P.glandulosa)不定芽与不定根诱导实验体系模拟顶端分生组织发育过程,通过实时定量PCR(RT-PCR)技术,对杨树Ⅰ类KNOX成员在不定芽与不定根形成过程及形成层相关区域中的表达进行分析。 结果 本研究通过同源比对分析鉴定出10个杨树Ⅰ类KNOX成员,根据进化关系与基因结构差异将其分为三组:组1、组2、组3,其中,组1为拟南芥KNAT2和KNAT6同源基因,组2为STM和BP同源基因,组3为杨树所特有的Ⅰ类KNOX基因。杨树Ⅰ类KNOX基因在不定芽与不定根发生过程中表达量均发生较大的变化,在不定芽发生过程中,组1基因在芽原基分化产生不定芽的关键期上调表达,而组2与组3基因多在分生组织分化产生芽原基阶段高表达;在不定根发生过程中,组1成员多在根原基分化产生不定根的过渡期上调表达,组2与组3基因则多在发育后期不定根形态建成阶段高表达。杨树Ⅰ类KNOX成员在形成层相关区域均表达,组1中KNAT2/6与组2中STM、BP同源基因的表达量明显高于其他成员。 结论 以上结果说明,杨树Ⅰ类KNOX除了与拟南芥同源的2个组外,还进化产生新的组别,分别参与分生组织形成和分化过程中不同阶段的调控,且PtKNAT2/6b、ARK1与ARK2在形成层区域高表达,提示以上3个基因可在形成层功能维持以及木质部分化中发挥主要作用。 Abstract:Objective The expression of Populus class Ⅰ KNOX genes during the regeneration of adventitious shoot and adventitious root as well as in the vascular cambium were analyzed to reveal the function of class Ⅰ KNOX genes in woody plants meristem formation and differentiation. Method The nucleic acid and amino acid sequence of Populus class Ⅰ KNOX genes were obtained through blast analysis using Arabidopsis STM protein sequence as query in the genome of Populus trichocarpa. The phylogenetic tree was constructed according to the full length protein sequences of class Ⅰ KNOX genes from Arabidopsis and Populus. The intron/exon structure and domain composition were presented along the phylogenetic tree. The regeneration of adventitious bud and adventitious root using leaf and stem explants from 84 K (Populus alba×P. glandulosa) was used to simulate the shoot and root apical meristem initiation and differentiation, respectively. Quantitative real-time PCR was carried out to analyze the expression of Populus class Ⅰ KNOX genes during the regeneration of adventitious bud/root and in the vascular cambium related region. Result Ten class Ⅰ KNOX genes were found in the genome of P. trichocarpa through sequence alignment analysis. According to the phylogenetic relationship and gene structure similarity, class Ⅰ KNOX genes from Arabidopsis and Populus could be divided into three groups. Arabidopsis KNAT2 and KNAT6 along with their Populus homolog genes belong to group 1, Arabidopsis STM and BP along with their Populus homolog genes belong to group 2. Group 3, to be noticed, was unique to Populus. Through investigating the expression alteration of Populus class Ⅰ KNOX genes during the regeneration of adventitious buds, it was found that group 1 genes showed increased expression during the transition from bud primordium to adventitious bud, while group 2 and group 3 genes demonstrated higher expression during the transition from meristem to bud primordium. As for the regeneration of adventitious root, group 1 genes showed increased expression in the stage when root primordium differentiate to adventitious root, while group 2 and group 3 genes demonstrated higher expression in the adventitious root formation stage. In addition, all Populus class Ⅰ KNOX genes had an expression in the vascular cambium, and the expression of group 1 gene PtKNAT2/6b and group 2 genes ARK1 and ARK2 were especially high. Conclusion Group 3 is a new group occurred during the evolution of class Ⅰ KNOX genes from A. thaliana to P. trichocarpa, which was along with group 1 and group 2 to participate in the regulation of different stages of meristem formation and differentiation. Most importantly, PtKNAT2/6b, ARK1 and ARK2 show high expression in the vascular cambium, which may play important roles in vascular cambium activity maintenance and xylem differentiation. -
Key words:
- class Ⅰ KNOX
- / meristem
- / cambium
- / expression analysis
- / Populus
-
表 1 杨树中Ⅰ类KNOX基因qRT-PCR引物序列
Table 1. Primers used for qRT-PCR analysis.
引物名称
Primer Name引物序列
Primer SequenceARK1-rtF ATTGGTGGAGCAGGCATTAC ARK1-rtR CATCCATCACCACAAACTGC ARK2-rtF TGGACTGCCAAAAGGTAGGA ARK2-rtR GTCTTGTAAGCTCCTCACGGTA PtSTMb-rtF TTCTGCTCATCAGCATCACC PtSTMb-rtR CCAGTCGCAGTGACAGTGTT PtKNAT2/6a-rtF CGCAGATTGCACGTTTCTTA PtKNAT2/6a-rtR AGGCCTTTCAAGATCGGATT PtKNAT2/6b-rtF CCTACTTGGATGGTGGGATG PtKNAT2/6b-rtR CAGCAAATTGCAGGTTCTCA PtKNAT2/6c-rtF AACGAGGATCGAGAGCTGAA PtKNAT2/6c-rtR ATCAGCTTCCGTTGGGTATG PtKNAT2/6d-rtF GCTTCAATGGTGGTGGAGTT PtKNAT2/6d-rtR ATCGTTCTCTTCCCGGATTT PtKNLPa-rtF GTGCACCTCCAGAAATGGTT PtKNLPa-rtR CGTCAAACGGCTTGGATAAT PtKNLPb-rtF CTTGAAGCCATAGGCAGAGG PtKNLPb-rtR TCAAGAACGTAGCAGCCTCA PtKNLPc-rtF GGGAGGTTGAAGCATCTGAA PtKNLPc-rtR TCGCTTTCTCCTCTTCCGTA PtACTIN-rtF AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG PtACTIN-rtR GCATCATCACAATCACTCTCCGA 表 2 杨树中Ⅰ类KNOX成员信息
Table 2. Detailed information about Class Ⅰ KNOX genes from Populus
基因名称
Gene name基因号
Locus染色体上位置
Genomic position亚细胞定位预测
POSRT prediction氨基酸数
Protein length内含子数
intronsARK1 Potri.011G011100.1 Chr11:844486-848858- N: 14 373 3 ARK2 Potri.002G113300.1 Chr02:8461980-8468320 + N: 14 368 4 PtSTMb Potri.004G004700.1 Chr04:304576-308944 + N: 14 369 3 PtKNAT2/6a Potri.008G188700.1 Chr08:13039428-13047773 - N: 12, C: 1 341 5 PtKNAT2/6b Potri.010G043500.1 Chr10:7430322-7440628 + N: 10, C: 2 309 4 PtKNAT2/6c Potri.012G087100.1 Chr12:11401140-11409183 - N: 14 340 4 PtKNAT2/6d Potri.015G079100.1 Chr15:10400171-10408171 + N: 14 347 4 PtKNLPa Potri.013G008600.1 Chr13:557144-561807 + N: 12, M: 1 320 4 PtKNLPb Potri.005G014200.1 Chr05:1100485-1105673 + N: 14 317 4 PtKNLPc Potri.005G017200.1 Chr05:1390283-1394969 + N: 13 316 4 注:N:细胞核;C:细胞质;Ch:叶绿体;M:线粒体。
N: nucleus: C: cytoplasm; Ch: chloroplast; M: mitochondria. -
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