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干旱是一种最普遍的环境胁迫。干旱导致水分分配出现异常，对植物造成原生质脱水，光合作用和遗传物质的合成能力减弱等伤害，而且缺水引起的渗透胁迫会造成植株不可逆的损伤，最终导致植株死亡[1]。当植物处于渗透胁迫环境中，它们会通过积累渗透调节物质来降低胁迫所带来的损伤[2]。大量研究表明，脯氨酸的积累和代谢与植物的耐旱性密切相关[3-4]。作为一种小分子有机渗透调节物质，脯氨酸可以提高植物细胞的保水能力，维持细胞膨压，并保护相关酶活性等[3]。在干旱胁迫停止而开始复水的条件下，积累的脯氨酸又可以作为碳、氮源为植物的恢复提供能量物质[5-6]。赵宏伟等[7]在研究水稻(Oryza sativa L.)耐旱机制时发现，耐旱品种东农425的脯氨酸含量显著高于干旱敏感型品种松粳6号，且复水后恢复能力更强。
脯氨酸的合成途径有2条，分别是谷氨酸途径和鸟氨酸途径。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸氨基转移酶(δ-OAT)分别是这两个途径中的关键酶。研究发现，过表达P5CS的转基因植株在胁迫环境下的脯氨酸含量明显高于对照植株，且抗逆性较对照植株也有所增强[8]。王伟东等[9]将拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的δ-OAT基因转化到烟草(Nicotiana tabacum L.)和水稻中，转基因烟草和水稻的脯氨酸含量增加，抗逆性也显著加强。此外，这2条途径在不同条件下对脯氨酸积累的贡献大小也有所不同，如在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中，P5CS和OAT基因在干旱胁迫下共同控制脯氨酸的合成，但P5CS基因占主导地位[10]。
中山杉(Taxodium hybrid ‘Zhongshanshan’)是江苏省中国科学院植物研究所通过落羽杉属(Taxodium)种间杂交选育出来的优良无性系的总称。中山杉保持了亲本的优良性状，并表现出良好的适应性与抗逆性，目前已经广泛应用于城市绿化和沿海防护林建设等方面，获得了较好的生态和社会效益[11-12]。作为中山杉的亲本之一，墨杉(T. mucronatum)原产于墨西哥高原地带，对干旱胁迫具有一定的耐受能力[13]。中山杉遗传了亲本墨杉的耐旱性，在重庆三峡库区造林的过程中，当水库处于低水位时，中山杉长期生长在裸露缺水的黄棕壤中，仍然可以生存，并保持较高的存活率[14]。室内试验表明，中山杉杂种优势明显，耐旱性较强[15-16]，其主动积累脯氨酸以抵御胁迫伤害；在复水后，脯氨酸含量迅速下降到正常水平[15]。
本研究利用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)从中山杉中克隆2个编码P5CS和δ-OAT的基因，并利用生物信息学预测其结构和功能，最终分别命名为ThP5CS和Thδ-OAT。采用半定量技术(sRT-PCR)和实时荧光定量技术(qRT-PCR)分析了中山杉及其亲本在干旱及复水的条件下，其ThP5CS和Thδ-OAT基因相对表达量的变化，以探索ThP5CS和Thδ-OAT与脯氨酸积累以及植物耐旱性的关系，为落羽杉属植物抗逆基因工程提供候选基因资源，同时为中山杉在干旱和半干旱地区的推广应用提供科学依据。
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试验在江苏省中国科学院植物研究所(118°49′ E，32°30′ N)的苗圃进行。供试品种为中山杉407(Taxodium mucronatum ♀ × T. distichum ♂)(T. hybrid ‘Zhongshanshan 407’)、落羽杉(T. distichum)和墨杉(T. mucronatum)。选取2年生植株移入塑料盆(口径为23 cm，底径为15 cm，高为22 cm)中，每盆种植1株植株。栽培基质为黄土、泥炭土和珍珠岩，体积比为3:1:1，最大田间持水量为28.7%。将移植后的植株放置在自然环境中适应3个月，每周充分灌溉2次。
选取18株长势一致的植株移入温室中，用于干旱试验。试验设计如下：设置对照(CK)和干旱-复水(S)2个处理，每个处理9株植株，随机区组排列。在整个试验期间保持每天18:00为CK组的植株补充足够的水分，使其土壤相对含水量(含水量/最大田间持水量)保持在75%~80%的水平。对于S组的植株，干旱过程为连续模拟自然干旱8 d；复水过程为干旱处理结束后的9 d，每天18:00补充水分，使土壤的相对含水量达到75%~80%的水平。分别在干旱胁迫处理0 d(胁迫前，S0)，连续干旱8 d(S组所有植株表现出明显的萎蔫现象，干旱阶段，S1)，以及复水9 d(复水阶段，S2)对CK和S组的叶片进行取样。每组3个重复，每个重复包含3株植株的叶片样品，取样后立即投入液氮中速冻，然后保存于-80℃冰箱中备用。
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采用天根DP441多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取叶片RNA。利用DNA酶(天根生化科技有限公司)处理提取的RNA，使其纯化。利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计在260 nm和280 nm下检测RNA的浓度与纯度。以1 μg RNA为模板，利用Clontech公司的SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit和AdvantageR 2 PCR Kit试剂盒进行反转录，合成第1链cDNA，存于-20℃冰箱备用。
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通过对中山杉转录组数据的分析，获得所需基因片段的序列信息。根据获得的序列信息，利用Oligo 6.0软件设计引物扩增基因的3′RACE和5′RACE，其中，3′RACE的PCR反应体系参照3′-Full RACE Core Set Kit试剂盒(TaKaRa)的说明书；5′RACE的反应体系参考Clontech公司的SMARTer RACE 5′/3′Kit试剂盒的说明书。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒(QIAGEN)进行回收。将回收产物连接到pMD19-T Vector载体(TaKaRa)上，并转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞，再将筛选到的阳性克隆菌液送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。根据3′RACE和5′RACE的测序结果，利用软件BioXM 2.6进行比对拼接，获得基因全长序列。利用ORFfinder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测ORF开放阅读框序列，并设计引物，以cDNA为模板进行ORF序列扩增加以验证。引物序列见表 1。
表 1 引物序列
Table 1. Sequences of primers
引物名称
Prime-ID正向引物
Forward PCR Primer(5′-3′)反向引物
Reverse PCR Primer(5′-3′)Thδ-OAT_3OUTER TGATTGCTGATGAAATACAAACTGG TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT Thδ-OAT_3INNER GGGCTGTTGAGATGGGACAAGTCTTTAG CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG Thδ-OAT_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AATGGGTTCAAAGAGAAATCCAGCA Thδ-OAT_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC AGTATTCATTGGAAGCACCATGTCATAG Thδ-OAT_ORF ATGAACAACATGACAATGGCGAT TGCCTGCAGGTCGACGATTGTA Thδ-OAT_sRT-PCR ATGAACAAGAGTACAGTGCTCA AACAATAATTCCCTCATTTTTT Thδ-OAT_qRT-PCR ACTGGAGCAGAGGGTGTTGAA AGTTGACCAGGGAGGAACGG ThP5CS_3OUTER TGCTCAAGCTGGATGATGTTATAGA TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT ThP5CS_3INNER TGTCAGATTGTATGGTGGCACAAAGGCA CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG ThP5CS_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT CCTTCAACGTCACTCAGGAGAATCAG ThP5CS_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC CATTATCAGTTACAAGAAGTTGGGATGA ThP5CS_ORF ATGACAGCTAAAGTTAAAGCTGCT GGTTTTCAAATCACAACCATT ThP5CS _sRT-PCR GCTGGTATTCCTGTTGTTATTA ATCTTTCCAGGTTTTAACATTA ThP5CS_qRT-PCR GACCTCCAGAAGCCACAGGT GAACCACGCGCAACTCTAGC 18S _sRT-PCR TAAAAGAAGAAGAAGAAGCAAA TGAAAATGAGAGGTGAAGAGAT GAPDH_qRT-PCR CCATCGGAGCCCATTATCAG ACTATGTTCAACGCCGCTGC -
利用BLASTsoftware(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和拟南芥信息资源网站(TAIR)(http://www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp)在线分析基因序列和氨基酸序列；利用ExpasyProtparam工具(http://web.expasy.org/protparam/)在线预测蛋白质的分子量大小、等电点等；利用GOR4软件预测蛋白的二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)；利用InterPro网站预测基因的结构域，并利用NCBI数据库中的Protein BLAST和MEGA 5.1软件的Clustal W程序进行同源序列比对；使用MEGA 5.1软件并选择最大似然法(Maximum Likelihood method)进行系统发育树的构建[17]。
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利用软件Oligo 6.0设计参照基因18S rRNA和2个目的基因(ThP5CS和Thδ-OAT)sRT-PCR的特异引物(表 1)。sRT-PCR扩增体系为20 μL：1 μL Taq酶，2 μL 10 ×PCR Buffer(Mg2+ Free)，1.5 μL Mg2+(25 mmol·-L-1)，1.3 μL dNTP mixture(2.5 mmol·-L-1 each)，各1 μL 5′端和3′端引物(10 pmol·μL-1)，1 μL cDNA(cDNA浓度大约是1 000 ng·μL-1)，11.2 μL ddH2O。PCR条件为：94℃、4 min；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，25个循环；72℃、10 min；4℃终止反应。使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物[18]。利用软件Oligo 6.0设计内参基因GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate)和2个目的基因的qRT-PCR引物(表 1)。利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)系统进行qRT-PCR。按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作，扩增程序为：55℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，进行40个循环。随后设置60℃至95℃，生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复，20 μL的反应体系中包含：2 μL稀释后的cDNA(稀释比例为1:3，稀释后的cDNA浓度大约是350 ng·μL-1)，10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，6 pmol上游引物，6 pmol下游引物以及6.8 μL ddH2O。基因的相对表达量按照2-ΔΔCt方法进行计算[19]；试验数据经SPSS 19.0软件统计分析并绘图；数据采用Duncan法(P＜0.05)进行单因素方差分析。
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利用3′RACE扩增技术获得2个编码中山杉δ-OAT和P5CS基因长度分别为229 bp和242 bp的3′端序列，利用5′RACE扩增技术获得编码中山杉δ-OAT和P5CS基因长度分别为95 bp和763 bp的5′端序列(表 2)。经过序列比对分析，得到编码中山杉δ-OAT和P5CS基因的全长，长度分别是1 818 bp和2 550 bp(表 2)。编码中山杉δ-OAT的基因包含1个长度为1 494 bp的ORF开放阅读框，共编码497个氨基酸；编码中山杉P5CS的基因包含1个长度为1 545 bp的ORF开放阅读框，共编码514个氨基酸(表 2)。
表 2 Thδ-OAT和ThP5CS的序列分析
Table 2. Features of the Thδ-OAT and ThP5CS
Gene_ID Full-length cDNA/bp 5′UTR /bp 3′UTR/bp ORF/bp 预测多肽Predicted peptide 二级结构预测Secondary structure prediction MW/kDa PI GRAVY Hh/% Ee/% Tt/% Cc/% Thδ-OAT 1 818 95 229 1 494 55.11 6.26 -0.174 44.06 11.47 0.00 44.47 ThP5CS 2 550 763 242 1 545 55.32 6.35 0.036 36.19 18.09 0.00 45.72 -
利用TAIR网站，将编码中山杉δ-OAT和P5CS基因序列分别与拟南芥AT5G46180.1；AT3G55610.1基因序列进行比对，其序列相似性分别为82%和86%；将2个基因的蛋白质氨基酸序列在GenBank中进行Blast搜索，发现编码OAT的基因与樟子松(Pinus sylvestris L. CAJ76070.1)的蛋白序列相似性为92%；编码P5CS的基因与花烛属植物(Anthurium amnicola JAT40271.1)的蛋白序列相似性为87%，将2个基因命名为Thδ-OAT和ThP5CS。
利用ExpasyProtparam工具对Thδ-OAT和ThP5CS序列进行在线分析，推测Thδ-OAT蛋白质的分子量为55.11 KD，理论等电点为6.26，平均亲水系数为-0.174，为亲水性蛋白；ThP5CS蛋白质的预测分子量为55.32 KD，理论等电点为6.35，平均亲水系数为0.036，为疏水性蛋白。利用GOR4软件预测蛋白二级结构，结果显示：Thδ-OAT蛋白由3种结构模块组成，分别是44.06%的α-螺旋，11.47%的延伸链和44.47%的随机卷曲；而ThP5CS蛋白是由36.19%的α-螺旋，18.09%的延伸链和45.72%的随机卷曲组成的。
使用MEGA 5.1软件并选择最大似然法(Maximum Likelihood method)进行系统发育树的构建，bootstrap自检值设为1 000。选择其他物种：樟子松(Pinus sylvestris L. CAJ76070.1)、梅(Prunus mume Sieb. et Zucc XP_008225506.1)、菠萝(Ananas comosus L. XP_020092479.1)、油棕(Elaeis guineensis Jacq. XP_010940988.1)、桐油树(Jatropha curcas L. AKH80292.1)、烟草植物(Nicotiana attenuata XP_019259981.1)、蓖麻(Ricinus communis L. XP_002519647.2)、白梨(Pyrus × bretschneideri Rehd. XP_009360915.1)、甜瓜(Cucumis melo L. XP_008444491.1)、平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd. AEO51063.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon L. XP_003561949.1)、斑茅(Saccharum arundinaceum L. ABV03818.1)参与Thδ-OAT多重序列比对和系统进化树的构建。选择其他物种：油棕(Elaeis guineensis L. XP_010931200.1)、菠萝(Ananas comosus L. XP_020114091.1)、甜瓜(Cucumis melo L. XP_008441400.1)、海枣(Phoenix dactylifera L. XP_008777668.1)、可可树(Theobroma cacao L. XP_017976980.1)、荷花(Nelumbo nucifera Gertn. XP_010263774.1)、巨桉(Eucalyptus grandis L. XP_010067456.1)、花烛属植物(Anthurium amnicola JAT40271.1)、胡桃(Juglans regia L. XP_018809084.1)、毛果杨(Populus trichocarpa EEF01373.1)、棉花(Gossypium arboreum L. ACI62865.1)、枣(Ziziphus jujuba Mill. XP_015897148.1)参与ThP5CS多重序列比对和系统进化树的构建。多重序列比对结果显示：Thδ-OAT、ThP5CS分别与其他物种基因的同源性都较高(图 1、图 2)。系统进化树构建结果显示：中山杉Thδ-OAT与樟子松亲缘关系较近，中山杉ThP5CS与花烛属植物亲缘关系较近，聚为一个分支(图 3、4)。
图 1 Thδ-OAT氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的多重序列比对
Figure 1. Multialignment of amino acid sequences of Thδ-OAT and other δ-OATs
图 2 ThP5SC氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的多重序列比对
Figure 2. Multialignment of amino acid sequences of ThP5SC and other P5SCs
图 3 中山杉Thδ-OAT蛋白的进化树
Figure 3. Phylogenetic tree of the Thδ-OAT
图 4 中山杉ThP5CS蛋白的进化树
Figure 4. Phylogenetic tree of the ThP5CS
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分别以干旱胁迫处理0 d(S0)，连续干旱8 d(S1)，以及复水9 d(S2)的cDNA为模板，通过半定量与定量PCR技术对Thδ-OAT和ThP5CS基因的表达特性进行分析。与前期获得的脯氨酸含量变化趋势相一致[15]，干旱处理后，ThP5CS的表达量在中山杉407及其父母本中均显著上调(P＜0.05)(图 5)，其中，中山杉407 ThP5CS的表达量是对照的4.38倍；落羽杉和墨杉ThP5CS表达量分别为对照的2.08倍和2.13倍。复水后，ThP5CS的表达量均呈下降的趋势。Thδ-OAT基因在中山杉407及落羽杉中表达量均显著低于对照(P＜0.05)，复水后表达量变化不明显；而在母本墨杉中，干旱环境使得Thδ-OAT表达量显著上调(P＜0.05)，达到对照的2.67倍，复水后，基因表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 干旱及复水情况下Thδ-OAT和ThP5CS基因的表达情况
Figure 5. The expression of Thδ-OAT and ThP5CS under drought stress and rewatering
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植物在干旱环境下会主动积累渗透调节物质，维持细胞的膨压以抵御胁迫损害[20]。脯氨酸是植物细胞最重要的渗透调节物质之一，它以游离状态存在于细胞中，在逆境环境下大量积累，以维持细胞的结构与功能，在胁迫结束的恢复阶段，脯氨酸又作为营养物质为细胞的新陈代谢活动提供能量[5, 21]。前期的研究结果表明，在自然干旱胁迫下，中山杉及其亲本会大量积累脯氨酸，复水后，脯氨酸含量下降接近正常水平[15]。
本研究从中山杉407中克隆编码合成脯氨酸关键酶的基因，根据多重序列比对、保守结构域分析以及系统进化分析，确定获得2个全长基因，编码中山杉407 P5CS和δ-OAT的合成，分别命名为ThP5CS和Thδ-OAT。
中山杉407及其亲本在模拟自然干旱的环境下，其ThP5CS基因的表达量显著上调，这种变化趋势与刘静静等[22]关于大蒜芥(Sisymbrium altissimum L.)在干旱胁迫下的SaP5CS1基因的表达研究结果相似。而在干旱结束后的复水环境下，ThP5CS表达水平呈降低的趋势，这可能是一种补偿机制，植物通过降解脯氨酸为细胞恢复提供能量保障[23]。在整个干旱-复水过程中，ThP5CS在所有供试植物中的表达趋势与前期获得的脯氨酸含量变化趋势表现一致[15]，这说明对于中山杉407及其亲本，ThP5CS基因的诱导表达，在植物处于正常和胁迫条件下脯氨酸的水平的调控中起着重要作用。杨成民等[24]通过转基因技术在黑麦草(Lolium perenne L.)体内过表达P5CS基因，使转基因植株较对照植株积累更多的脯氨酸，增强了黑麦草对干旱胁迫的耐受能力。同时，Wei等[25]对百合属(Lilium)植物的研究中也发现P5CS基因在脯氨酸积累和耐非生物胁迫特性方面扮演了重要角色。综合表明，P5CS基因与植物耐旱性有重要的联系。
δ-OAT作为鸟氨酸途径的限速酶，在植物应激反应中也起到很重要的作用[26]。干旱环境下，斑茅δ-OAT基因受到诱导表达上调[9]。本研究中，墨杉Thδ-OAT在干旱胁迫下表达量显著上调，但在中山杉及落羽杉中的表达显著下调，且复水后表达量变化不明显。这种差异的原因可能是植株体内的氮元素含量有所不同。研究发现，在渗透胁迫条件下，δ-OAT和P5CS的表达与植物体内的氮素水平有关[10]。在氮元素含量较低的情况下，谷氨酸途径在脯氨酸合成中占主要地位[27]。由于鸟氨酸途径的限速酶是δ-OAT，所以在氮元素含量较低时该酶的活性较低，进而调控该酶表达的δ-OAT基因也相应下调[27]。可见，干旱胁迫下中山杉及亲本脯氨酸累积主要是通过谷氨酸途径，P5CS基因的过量表达可以在一定程度上增加落羽杉属植物的耐旱性[28]。
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干旱胁迫下Thδ-OAT和ThP5CS基因的正反方向调节是中山杉407及其亲本在干旱胁迫与恢复状态下控制脯氨酸水平的关键机制，Thδ-OAT和ThP5CS基因的过量表达在一定程度上可以增加落羽杉属植物的耐旱性。此外，ThP5CS的表达量明显高于Thδ-OAT，说明干旱胁迫下，中山杉407及其亲本脯氨酸的积累主要依靠ThP5CS的调控。
中山杉407ThP5CS和Thδ-OAT的克隆及干旱胁迫下的表达分析
Cloning and Expression Analysis of ThP5CS and Thδ-OAT Gene in Taxodium Hybrid 'Zhongshanshan 407' under Drought Stress
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摘要:
目的 探究中山杉407（Taxodium mucronatum ♀×T.distichum ♂）（T.hybrid 'Zhongshanshan 407'）的ThP5CS和Thδ-OAT基因与植物耐旱性的关系，为落羽杉属植物抗性育种提供新的基因资源。 方法 利用RACE技术从中山杉407中分别克隆ThP5CS和Thδ-OAT基因cDNA全长，通过生物信息学手段分析预测其编码蛋白的结构和功能。基于干旱-复水试验，采用半定量和实时荧光定量技术研究中山杉407 ThP5CS和Thδ-OAT的表达特性。 结果 从中山杉407中克隆了编码P5CS和δ-OAT蛋白的基因，分别命名为ThP5CS和Thδ-OAT，其中，Thδ-OAT包含1个长度为1 494 bp的ORF，编码497个氨基酸，与樟子松（Pinus sylvestris L.）δ-OAT蛋白的序列相似性高达92%；ThP5CS包含1个长度为1 545 bp的ORF，编码514个氨基酸，与花烛属植物（Anthurium amnicola）P5CS蛋白的序列相似性为87%。半定量与定量PCR结果一致，在自然干旱和复水环境下，ThP5CS在中山杉407及其父本落羽杉（T.distichum）、母本墨杉（T.mucronatum）中均表现为先上调再下调的趋势，而Thδ-OAT在中山杉407及其父母本中相对表达量则存在差异。 结论 干旱胁迫下，Thδ-OAT和ThP5CS基因的正反方向调节是中山杉407及其亲本在干旱胁迫与恢复状态下控制脯氨酸水平的关键机制，其中，ThP5CS在中山杉407及其亲本脯氨酸的合成过程中起重要作用。 Abstract:Objective To study the function of ThP5CS and Thδ-OAT in T. hybrid 'Zhongshanshan 407' (Taxodium mucronatum ♀×T. distichum ♂), and to explore the relationships between the genes and drought resistance of T. hybrid 'Zhongshanshan 407'. This research would provide candidate gene resources for resistance breeding in Taxodium. Method Rapid-amplification of cDNA ends (RACE) was applied to clone the full-length complementary DNA (cDNA) sequences of P5CS and δ-OAT in T. hybrid 'Zhongshanshan 407'. And then, the structures and functions were predicted with bioinformatics analysis. Finally, a natural drought and rewatering experiment was conducted to investigate the expression patterns of ThP5CS and Thδ-OAT by semi-quantitative RT-PCR (sRT-PCR) and quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Result The cDNA sequences of P5CS and δ-OAT in T. hybrid 'Zhongshanshan 407' were isolated and then were named as ThP5CS and Thδ-OAT. The full-length sequence of Thδ-OAT and ThP5CS contained open reading frames (ORF) of 1 494 bp and 1 545 bp respectively, and encoded polypeptides of 497 and 514 amino acids residues. The protein sequences of Thδ-OAT exhibited 92% sequence identities with Pinus sylvestris L., and the protein sequences of ThP5CS exhibited 87% sequence identities with Anthurium amnicola. sRT-PCR and qRT-PCR analysis showed that in T. hybrid 'Zhongshanshan 407' and its parents, ThP5CS showed an increasing expression pattern and then decreasing in the period of drought and recovery. While the relative expression of Thδ-OAT showed differentiations in T. hybrid 'Zhongshanshan 407', T. distichum, and T. mucronatum. Conclusion ThP5CS might be important in response of Taxodium to drought and could play a leading role in proline synthesis. -
图 1 Thδ-OAT氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的多重序列比对
Figure 1. Multialignment of amino acid sequences of Thδ-OAT and other δ-OATs
图 2 ThP5SC氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的多重序列比对
Figure 2. Multialignment of amino acid sequences of ThP5SC and other P5SCs
图 5 干旱及复水情况下Thδ-OAT和ThP5CS基因的表达情况
Figure 5. The expression of Thδ-OAT and ThP5CS under drought stress and rewatering
表 1 引物序列
Table 1. Sequences of primers
引物名称
Prime-ID正向引物
Forward PCR Primer(5′-3′)反向引物
Reverse PCR Primer(5′-3′)Thδ-OAT_3OUTER TGATTGCTGATGAAATACAAACTGG TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT Thδ-OAT_3INNER GGGCTGTTGAGATGGGACAAGTCTTTAG CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG Thδ-OAT_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT AATGGGTTCAAAGAGAAATCCAGCA Thδ-OAT_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC AGTATTCATTGGAAGCACCATGTCATAG Thδ-OAT_ORF ATGAACAACATGACAATGGCGAT TGCCTGCAGGTCGACGATTGTA Thδ-OAT_sRT-PCR ATGAACAAGAGTACAGTGCTCA AACAATAATTCCCTCATTTTTT Thδ-OAT_qRT-PCR ACTGGAGCAGAGGGTGTTGAA AGTTGACCAGGGAGGAACGG ThP5CS_3OUTER TGCTCAAGCTGGATGATGTTATAGA TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT ThP5CS_3INNER TGTCAGATTGTATGGTGGCACAAAGGCA CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG ThP5CS_5OUTER CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT CCTTCAACGTCACTCAGGAGAATCAG ThP5CS_5INNER CTAATACGACTCACTATAGGGC CATTATCAGTTACAAGAAGTTGGGATGA ThP5CS_ORF ATGACAGCTAAAGTTAAAGCTGCT GGTTTTCAAATCACAACCATT ThP5CS _sRT-PCR GCTGGTATTCCTGTTGTTATTA ATCTTTCCAGGTTTTAACATTA ThP5CS_qRT-PCR GACCTCCAGAAGCCACAGGT GAACCACGCGCAACTCTAGC 18S _sRT-PCR TAAAAGAAGAAGAAGAAGCAAA TGAAAATGAGAGGTGAAGAGAT GAPDH_qRT-PCR CCATCGGAGCCCATTATCAG ACTATGTTCAACGCCGCTGC 
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表 2 Thδ-OAT和ThP5CS的序列分析
Table 2. Features of the Thδ-OAT and ThP5CS
Gene_ID Full-length cDNA/bp 5′UTR /bp 3′UTR/bp ORF/bp 预测多肽Predicted peptide 二级结构预测Secondary structure prediction MW/kDa PI GRAVY Hh/% Ee/% Tt/% Cc/% Thδ-OAT 1 818 95 229 1 494 55.11 6.26 -0.174 44.06 11.47 0.00 44.47 ThP5CS 2 550 763 242 1 545 55.32 6.35 0.036 36.19 18.09 0.00 45.72
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