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油菜素内酯(BRs)作为一种重要的植物激素,存在于植物的各个器官中[1]参与植物幼苗生长、细胞伸长、细胞壁形成等许多生长发育过程[2-3],并且参与了植物对干旱、低温、高盐等逆境胁迫的响应[4]。
目前,关于BRs的生物合成途径已研究的较为清楚。Fujioka等人通过悬浮培养的长春花(Catharanthus roseue (Linn.) G.Don)细胞系统,以油菜甾醇(CR)作为BRs合成的起始物阐明了BRs合成的基本途径[5-6]。通过对拟南芥突变体的研究表明,在BRs的合成过程中有几个比较重要的基因参与。DET2(DEETIOLATED2)基因表达合成一个5α-还原酶(5α-reductase),可以将油菜甾醇((24R)-24-methylcholest-4-En-3-one)转变为油菜甾烷醇((24R)-24-methyl-5alpha-cholestan-3-one)[7-8]。拟南芥DET2基因功能缺失突变体det2-1中,植物无法合成BRs,表现出植株矮小、叶色深绿、根明显缩短等表型[9]。DWF4(DWARF4)基因和BR6ox(BR-6-oxidase1)基因也被认为是BRs合成的关键基因,在拟南芥突变体中具有和det2-1相似的表型[10-11]。
杨树作为研究木本植株生长发育的模式树种,研究BRs在杨树生长发育中的作用和机制对于BRs的研究和分子育种都有重要的理论指导意义。目前,在杨树中过量表达BR6ox基因和DWF4基因已有报道,均有引起杨树增高增粗等表型[12-13]。关于杨树DET2基因功能的研究,此前已有一些报导。邓伟等人、谭玉朋、严飞通过在杨树中异源表达棉花GhDET2基因,分析了对杨树生长发育的影响[14-16]。目前,关于在杨树中过量表达其自身DET2基因的研究还未见报导,关于过量DET2基因是否可以提高植物内源油菜素内酯的研究也未见报导。本研究从银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa,‘84K’)中分离出拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,构建PagDET2过量表达载体,并通过遗传转化获得过量表达PagDET2的转基因杨树,对其生长、发育进行分析,为研究DET2在杨树生长发育中的功能奠定基础。
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本研究使用的杨树材料均为银腺杨84K,为中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室保存。实验所用杨树均由组培苗扩繁而来,并由组培苗移栽至营养土中继续培养。将带有顶端的组培苗嫩茎(约2.5 cm)扦插到生根培养基(1/2MS基础培养基,0.05 mg·L−1 IBA和0.02 mg·L−1 NAA,0.5%琼脂粉,pH 5.8~6.0),培养于人工气候室(温度为23~25 ℃,光周期为14 h/10 h光照/黑暗,光照强度为 50 μmol·m−2·s−1)。生长20天后,将其移栽到营养土中,在22 ℃长日照(14 h/10 h光照/黑暗)培养室中继续培养。
本研究所使用的Gateway入门载体pDNOR207、过表达载体pMDC32、GUS组织表达分析载体pMDC164、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α及农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌种均由本实验室保存。PCR引物合成和序列测序由Invitrogen公司完成。PCR反应用的2倍浓度的Premix高保真酶Primer STAR HS、普通扩增酶PCR-Mix、DNA marker、胶回收试剂盒(TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit)均为Takara公司产品。
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采用QIAGEN公司RNA提取试剂盒(RNeasy mini kit),并按照说明书提取RNA。RNA浓度和质量分别用Nanodrop8000(Thermo Fisher Scientific)和琼脂糖凝胶电泳检测。使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)并按照说明书操作,进行反转录合成cDNA。
在Roche 480定量仪器,使用SYBR Premix ExTaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)上进行RT-qPCR分析,ACTIN基因作为内参,每个样品进行4个技术重复。
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以拟南芥AtDET2基因为目的基因,在毛果杨(Populus trichocarpa)基因组数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中Blast获取AtDET2同源基因PtDET2(Potri.016G110600)序列。使用引物设计软件Primer设计PtDET2基因蛋白质编码区(CDS区)特异引物(PagDET2-F和PagDET2-R)(表1),以84K杨cDNA为模板,利用高保真聚合酶Prime STAR进行PCR扩增,得到目的基因PagDET2,并进行测序验证。
表 1 PCR扩增所用引物序列
Table 1. Primer sequences used for PCR
引物名称Primer name 序列(5′→3′)Sequence(5′→3′) 用途Application PagDET2-F ATGGCCCTATTAGATCAGAGCCTCT CDS区扩增 PagDET2-R TCAACACAGAAAAGGGATCACTGCT CDS sequence amplification DET2-RT-F ATGGCCCTATTAGATCAGAGCCT 半定量引物 DET2-RT-R CAGGTGCGGTGGAAGTAGTGGAAGA Primers for quantitative analysis PtPP2A-RT-F ACCGCATACAAGAGGTTCCACAT 定量引物 PtPP2A-RT-R GTAACCACATTCTTTTCCTGACACC Primers for quantitative analysis Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 内参引物 Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA Internal reference primers -
使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析84K杨DET2蛋白的基本理化性质。利用NCBI蛋白结构分析网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析PagDET2蛋白结构和功能。利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和植物基因组网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)查找获取不同物种中DET2氨基酸序列。使用DNAMAN软件比对不同物种中DET2蛋白氨基酸序列,并分析保守结构域[17]。使用软件MEGA 6利用N-J法构建不同物种的DET2蛋白序列系统发育进化树。
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利用半定量PCR方法对DET2在84K杨各组织中的表达情况进行分析。以84K杨各组织的cDNA为模板,用特异引物进行PCR扩增,并对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。根据条带亮度判断DET2基因在各组织中的表达情况。
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利用Gateway技术,将PagDET2基因连接至入门载体pDNOR207上,转化大肠杆菌并测序验证后,重组至过表达载体pMDC32中,转化大肠杆菌并测序验证。
将构建好的过表达载体pMDC32-DET2电击转化农杆菌GV3101感受态细胞,利用农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨。具体遗传转化方法见文献[18]。得到的转基因株系进行PCR检测,并提取RNA对PagDET2基因进行RT-qPCR定量分析。选择表达量较高的3个过表达转基因株系进行试验。
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每个株系各选3株在营养土中生长2月的杨树苗,取其1至3节间,迅速放入液氮冻存,冷冻研磨后按比例加入PBS(磷酸缓冲液,pH 7.4)。使用植物(Plant)油菜素内酯(BR)ELISA检测试剂盒(绿源伯德生物公司,北京)测定油菜素内酯含量,每个样本进行3次技术重复,并按照说明操作[13]。
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在不同年份不同批次分别选取野生型84K杨和PagDET2-OE转基因杨#1各9株,在营养土中培养75天,测量株高,并重复3次。
选取野生型84K杨和PagDET2-OE转基因杨#1各10株,在营养土中培养2个月用于耐盐性和抗旱性分析,其中高盐实验各使用5株,干旱实验各使用5株,并重复3次。在耐盐实验中,以300 mmol·L−1的NaCl水溶液处理植物,连续处理10天,持续观察;在抗旱实验中,首先给予充足水分,随后进行持续干旱处理6天,持续观察。以正常浇水的植株作为对照组。过氧化氢检测使用过氧化氢检测试剂盒(碧云天,上海),并按照说明书操作。
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使用SPSS Statistics 24软件进行数据统计分析,并用t检验法检验差异显著水平。
杨树油菜素内酯合成基因DET2的克隆与功能分析
Cloning and Characterization of Brassinosteriod Biosynthesis-related Gene DET2 in Poplar
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摘要:
目的 DET2基因编码一个5α-还原酶,是油菜素内酯(BRs)合成过程中的关键限速基因。研究DET2基因在杨树生长发育中的作用,对于进一步研究油菜素内酯在木本植物中的调控机制有重要意义。 方法 从银腺杨84K(Populus alba × P. glandulosa,‘84K’)克隆得到拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,利用生物信息学对其进行序列比对、生化特征分析、构建系统发育进化树。通过RT-PCR分析其在杨树中的表达模式。构建由CaMV 35S强启动子驱动的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagDET2-OE转基因植株。分析过表达DET2基因对于转基因植株内源BRs含量、植株生长和抗逆的影响。 结果 克隆了包含全长编码区PagDET2基因全长,可编码一个长度为257个氨基酸的蛋白质。其蛋白序列与毛果杨、拟南芥、水稻、棉花、大豆、番茄DET2蛋白同源性较高,说明该基因在进化过程中相对保守。PagDET2在84K杨不同组织中均检测到表达,其在茎中的表达较高。通过ELISA检测植物 BRs含量发现,过量表达DET2可以显著提高杨树内源BRs含量。过量表达DET2基因,可以导致转基因植株的高生长,但对盐胁迫更加敏感。 结论 DET2基因作为BRs合成的关键基因,在杨树中过量表达可以显著提高内源BRs含量,促进植株增高。DET2转基因植株的获得为进一步分析BR参与木本植物生长发育的调控机制奠定了基础。 Abstract:Objective Brassinosteriods(BRs)as essential plant hormones play crucial roles in plant growth and development. DET2, a 5α-reductase, is considered to catalyze a major rate-limiting in BRs biosynthesis. Study on PagDET2 gene is useful to understand the role of BRs in woody plants. Method In this study, PagDET2, a homologus gene of Arabidopsis AtDET2, was isolated from Poplar 84K (Populus alba × P. glandulosa, ‘84K’). Bioinformatic method was used to sequence alignment and analyze the basic physical, chemical characteristics and evolutionary relationship. Tissue expression patterns in poplar was analyzed by RT-PCR. The over-expression vector was constructed and transformed into poplar 84K. PagDET2-OE and wild-type plants were used to measure the content of BRs in vivo and analyze the role of DET2 in plant growth and stresses resistance. Result The CDS of PagDET2 gene was 774bp, encoding a 257 amino acid protein. The protein sequence of PagDET2 protein were conserved among Populus trichocarpa, Arabidopsis thaliana, rice, cotton, soybean and tomato. Tissue specific expression analysis showed that PagDET2 was detected in root, leaf tissue and stem tissue. Stem tissue of internode 1 to 3 showed the highest expression level among these tissues. The BRs content of poplar was measured by ELISA. DET2 could significantly increase the endogenous BRs content of poplar. Overexpression of DET2 gene can promote plant growth and be more sensitive to salt stress. Conclusion Overexpression of PagDET2 can significantly increase the endogenous BRs content and increase plant growth. PagDET2 may also be involved in the wood formation and internode elongation. -
Key words:
- DET2
- / Populus alba x P. glandulosa , ‘84K’
- / overexpression
- / brassinosteriod
- / height growth
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表 1 PCR扩增所用引物序列
Table 1. Primer sequences used for PCR
引物名称Primer name 序列(5′→3′)Sequence(5′→3′) 用途Application PagDET2-F ATGGCCCTATTAGATCAGAGCCTCT CDS区扩增 PagDET2-R TCAACACAGAAAAGGGATCACTGCT CDS sequence amplification DET2-RT-F ATGGCCCTATTAGATCAGAGCCT 半定量引物 DET2-RT-R CAGGTGCGGTGGAAGTAGTGGAAGA Primers for quantitative analysis PtPP2A-RT-F ACCGCATACAAGAGGTTCCACAT 定量引物 PtPP2A-RT-R GTAACCACATTCTTTTCCTGACACC Primers for quantitative analysis Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 内参引物 Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA Internal reference primers -
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