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杨小舟蛾(Micromelalopha sieversi(Staudinger)),属鳞翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae)小舟蛾属(Micromelalopha),分布于中国、日本和朝鲜半岛。在我国,杨小舟蛾分布范围广,在吉林、黑龙江、河南、山东、安徽、浙江、上海、江苏、江西和四川等地发生[1-3]。杨小舟蛾是杨、柳树的重要害虫,由幼虫取食杨、柳树叶片,严重时,叶片常被取食殆尽,形似火烧,严重影响林木的正常生长发育。国家林业和草原局(2019年第20号文公告)将杨小舟蛾列入三级危害性林业有害生物,同时也列入我国发生面积超过100万亩的林业有害生物名单中。2012年统计,杨小舟蛾在山东鲁西平原危害7市48县,并在齐河、滕州、商河等24个县局部爆发成灾,发生面积达16.71万hm2,占该地区杨树种植总面积的28.58% [4-5]。2018年,杨小舟蛾在河南省南阳市危害杨树纯林面积达3.33多万hm2 [6]。2021年,杨小舟蛾仅在河南省扶沟县一个村的危害面积达6.80万hm2(扶沟县韮园镇里村)。杨小舟蛾繁殖量大,其发生世代主要取决于光照、温度和湿度。在河南漯河地区一年发生6代,以2、3、4代为成灾世代;在江苏徐州一年发生5代,主要以3、4代成灾[7]。杨小舟蛾在每年的4—9月份都对杨树造成危害,该时期繁殖力强,取食量大,且危害时间长。研究表明,杨树的失叶率在60%、80%和100%时,材积损失率分别为11.9%、41.1%和56.5% [8]。因此,杨小舟蛾的防治至关重要。
化学农药因其易于加工、高效杀死大量个体等特点在杨小舟蛾防治中发挥了重要作用。但化学防治的大量使用会带来负面影响,如环境污染、生态失衡、产品安全、人类健康等一系列的问题,这使林业害虫的生物防治显得尤为重要。昆虫杆状病毒是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)一致推荐用于农林害虫的生物防治安全药剂[9]。其优点在于对寄主有很强的专化性,对人、植物和天敌均无危害,是有效和持续控制林业害虫的最佳生物药剂之一[10]。
据文献资料记载,在杨小舟蛾体内只发现一种病毒,即为杨小舟蛾质型多角体病毒(Micromelalopha sieversi cypovirus, MisiCPV),该病毒于1984年10月在湖北省嘉鱼县林区的自然病死的杨小舟蛾虫尸中分离获得[11]。但有关MitrCPV的形态特征、生物活性等未见详细报道。本研究从河北省秦皇岛市采集的杨小舟蛾病死虫中分离纯化出一株新病毒,经超微结构鉴定,其为颗粒体病毒,命名为杨小舟蛾颗粒体病毒(Micromelalopha sieversi granulovirus, MisiGV),生物活性测定了MisiGV对3龄幼虫的半致死浓度LC50和半致死时间LT50、对不同龄期幼虫毒力,以及对存活幼虫化蛹率和羽化率的影响。
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MisiGV超微结构如图1所示。扫描电镜观察,该病毒形态大多呈椭圆形,也有的呈卵圆形或不规则形,形似颗粒体,其平均大小为0.43 × 0.21 μm,但变化范围较大,为(0.18~0.76) × (0.20~0.23) μm,(图1A)。从透射电镜可观察到该病毒内部的详细结构,颗粒体的周围颜色较深的一层为颗粒体膜,膜内一层为颗粒体的蛋白质,颗粒体中包埋着单个单粒的病毒粒子,横切为颗粒状,纵切为杆状,病毒粒子位于颗粒体的中央,其平均大小为0.03 × 0.20 μm。(图1B)
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当MisiGV浓度为1.2 × 107、 4.0 ×106、4.0 × 105、1.2 × 105和4.0 × 104 OBs·mL−1时对3龄幼虫都有致死作用。MisiGV对3龄幼虫的回归方程为:y=−3.945 + 0.734x,LC50为2.37 × 105 OBs·mL−1(95%置信区间为1.13 × 105~4.34 × 105)(表1)。表1中皮尔逊拟合优度显著性值(P)大于0.05,则模型能较好的拟合数据。
表 1 不同浓度的MisiGV对杨小舟蛾3龄幼虫的毒力(17 d)
Table 1. Different concentrations of MisiGV to the 3rd instar larvae of M. sieversi (17 d)
虫龄
InstarProbit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of
fit significance values(P)LC50 /
(OBs·mL−1)95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit3龄 y=−3.945 + 0.734x 0.240 2.37 × 105 1.13 × 105 4.34 × 105 不同浓度的MisiGV对幼虫致死速度有一定差异(表2)。LT50数据表明,当病毒浓度为1.2 × 107和4.0 × 106 OBs·mL−1时,半致死时间LT50分别为7.55 d和11.61 d,LT50相比缩短了4.06 d。当病毒浓度为4.0 × 105、1.2 × 105和4.0 × 104 OBs·mL−1,LT50分别为14.69、16.06和17.62 d,该病毒浓度间相比分别相差10倍和3倍时,LT50分别缩短了2.93 d和1.56 d。即随着MisiGV浓度的提高,LT50值缩短。表2中皮尔逊拟合优度显著性值(P)均大于0.05,则模型能较好的拟合数据。
表 2 不同浓度的MisiGV对杨小舟蛾3龄幼虫时间-死亡率的影响(17 d)
Table 2. Different concentrations of MisiGV on time-mortality of the 3rd instar larvae of M. sieversi (17 d)
浓度
Treatment /(OBs·mL−1)Probit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of fit
significance values(P)LT50 /d 95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit1.2 × 107 y=−5.036 + 5.735x 0.115 7.55 7.067 8.030 4.0 × 106 y=−3.221 + 3.025x 0.374 11.61 10.803 12.531 4.0 × 105 y=−4.772 + 4.089x 0.138 14.69 13.558 16.366 1.2 × 105 y=−4.235 + 4.224x 0.089 16.06 15.475 16.790 4.0 × 104 y=−3.832 + 3.075x 0.441 17.62 16.040 19.930 -
图2显示,在MisiGV浓度为4.0 × 106和4.0 × 104 OBs·mL−1时,其对2~4龄幼虫都表现出一定的毒力。在这2个浓度下,2龄幼虫的最高累计死亡率分别为90.00%和83.33%(图2A),3龄幼虫的最高累计死亡率分别为85.56%和50.58%(图2B),4龄幼虫的最高累计死亡率分别为57.78%和36.67%(图2C)。也就是说,在同一龄期不同病毒浓度下,病毒液浓度越高,幼虫的死亡率随之增加。
图 2 不同浓度的MisiGV对不同虫龄幼虫的累计死亡率
Figure 2. Different concentrations of MisiGV to cumulative mortality of larvae at different instars
当浓度为4.0 × 106 OBs·mL−1时,2龄幼虫的累计死亡率在2~10 d呈显著上升趋势,且在第11 d达最高累积死亡率,11 d之后呈稳定趋势;3龄幼虫在5~8 d内累计死亡率缓慢增大,而在8~13 d内累计死亡率呈显著上升趋势,且在13 d时累计死亡率达最高值,之后几天趋于稳定;而4龄幼虫的累计死亡率在9 d之内没有显著性的变化,第15 d累计死亡率达到最大,而往后天数里死亡率几乎维持不变。当浓度为4.0 × 104 OBs·mL−1时,2龄幼虫在3~15 d内累计死亡率呈显著上升,第15 d时达最高累计死亡率并往后几天内趋于稳定;3龄幼虫在6~10 d的累计死亡率缓慢增大,11~14 d内呈缓慢增长,无明显变化,16~19 d时累积死亡率达最高值并趋于稳定;4龄幼虫在第10~13 d时增长缓慢,累计死亡率在15~18 d内随之上升,且18 d时达最高累计死亡率。
同一剂量病毒,杀死相同比例的杨小舟蛾幼虫,高龄比低龄幼虫的所需的时间长。在浓度为4.0 × 106 OBs·mL−1时,2和3龄幼虫LT50值分别为≈6.81 d和≈11.61 d,而杀死50%的4龄幼虫所需时间为≈12.89 d(表3)。当病毒浓度为4.0 × 104 OBs·mL−1时,杀死50%的2龄幼虫的所需时间≈11.91 d、3龄≈17.62 d,4龄≈25.65 d(表3)。采用时间-剂量-死亡率模型进行模拟分析发现,在这两个病毒浓度下,皮尔逊拟合优度显著性值(P)均大于0.05,拟合线性回归方程,则模型能较好的拟合数据。
表 3 不同浓度MisiGV对不同虫龄杨小舟蛾的致死时间
Table 3. Different concentrations of MisiGV on time-mortality of larvae at different instars
浓度
Treatment /(OBs·mL−1)虫龄
InstarProbit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of fit
significance valuess(P)LT50 /d 95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit4.0 × 106 2 y=−3.273 + 3.927x 0.230 6.81 6.476 7.145 3 y=−3.221 + 3.025x 0.374 11.61 10.803 12.531 4 y=−3.848 + 3.466x 0.460 12.89 11.923 14.059 4.0 × 104 2 y=−3.741 + 3.477x 0.395 11.91 11.474 12.500 3 y=−3.832 + 3.075x 0.441 17.62 16.040 19.930 4 y=−3.451 + 2.890x 0.487 25.65 24.672 26.864 在测试3个龄期的幼虫中,两个剂量的病毒的LT50显著不同。对于2和3龄幼虫而言,在浓度4.0 × 104 OBs·mL−1和4.0 × 106 OBs·mL−1时,两者的LT50分别相差≈5.10 d和≈6.01 d。而对于4龄幼虫而言,低浓度比高浓度病毒的LT50增加≈12.76 d。可见,对于虫龄小的幼虫而言,浓度之间的差异,导致其LT50变化不大,而对于虫龄大幼虫而言,病毒浓度的变化,导致LT50差异显著。尽管4.0 × 104 OBs·mL−1较4.0 × 106 OBs·mL−1稀释了100倍,但对于2龄幼虫而言,其浓度还是很高,以至于他们的死亡率都在80%以上。
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不同浓度的MisiGV喂食4龄幼虫后,存活幼虫化蛹率和羽化率如表4所示。当病毒液浓度为4.0 × 106、4.0 × 105和4.0 × 104 OBs·mL−1时,幼虫的化蛹率分别为30.00% ± 2.65%、51.11% ± 0.33%和62.22% ± 1.20%,较对照组相比,化蛹率分别减少52.27%、31.16%和20.05%。因此,不同浓度的MisiGV对化蛹率有影响,化蛹率随着病毒液浓度的提高而减弱。
表 4 不同浓度的MisiGV对幼虫化蛹率和羽化率的影响
Table 4. Effects of different concentrations of MisiGV on the pupation rate and emergence rate of larvae
浓度
Treatment /(OBs•mL-1)死亡率 ± 标准误差
Mortality rate ± SE /%化蛹率 ± 标准误差
Pupation rate ± SE /%羽化率 ± 标准误差
Emergence rate ± SE /%4.0 × 106 57.58 ± 2.85 b 30.00 ± 2.65 a 73.97 ± 2.06 a 4.0 × 105 50.00 ± 0.58 b 51.11 ± 0.33 b 82.64 ± 2.05 b 4.0 × 104 47.78 ± 0.33 b 62.22 ± 1.20 b 92.20 ± 0.47 c 0 12.22 ± 0.88 a 82.27 ± 1.33 c 93.54 ± 1.41 c 注:表中的数据为平均数±标准误,不同小字母表示在不同浓度的病毒条件下p<0.05水平差异显著。
Note: The data is average ± standard error in the table, different small letters indicate that the p<0.05 level is significantly different under different concentrations of virus conditions.当病毒液浓度为4.0 × 106和4.0 × 105 OBs·mL−1时,幼虫的羽化率分别为73.97% ± 2.06%和82.64% ± 2.05%,较对照组相比,羽化率分别减少了19.57%和10.90%。不同浓度的MisiGV对其羽化率有影响,病毒液浓度越高,羽化率越低。而当4.0 × 104 OBs·mL−1时,幼虫的羽化率为92.20% ± 0.47%,较对照组相比,羽化率减少了1.34%。因此,在较低浓度下,对幼虫羽化率的影响不明显。
杨小舟蛾新病毒的鉴定及其生物活性研究
Identification and Biological Activity of a New Virus of Micromelalopha sieversi (Staudinger) (Lepidoptera: Notodontidae)
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摘要:
目的 杆状病毒在农林害虫的生物防治中起着重要的作用,本研究鉴定1株具有高毒力的杨小舟蛾新病毒,为害虫的生物防治提供新病毒资源。 方法 通过研究该病毒的超微结构和生物活性确定其生防潜力。 结果 超微结构表明,该病毒包涵体多呈椭圆形,平均大小为0.43 × 0.21 μm;包涵体中包埋一个杆状病毒粒子,具有颗粒体病毒结构特征,命名为杨小舟蛾颗粒体病毒(MisiGV)。生物活性显示,MisiGV对杨小舟蛾幼虫有致死作用,对3龄幼虫的半致死浓度LC50为2.37 × 105 OBs·mL−1;当浓度为1.2 × 107、4.0 × 106、4.0 × 105、1.2 × 105和4.0 × 104 OBs·mL−1,对3龄幼虫的半致死时间LT50随着病毒浓度的降低而增大,分别为7.55、11.61、14.69、16.06和17.62 d。不同龄期幼虫对MisiGV的敏感性表明,虫龄较小越容易受到病毒的侵染,而且幼虫的死亡速度依赖于虫龄和病毒浓度。当浓度为4.0 × 106 OBs·mL−1时,2和4龄幼虫的最高累计死亡率分别为90.00%和57.78%,而在该浓度下,杀死50%的2龄幼虫的所需时间≈ 6.81 d,4龄≈ 12.89 d;当病毒浓度为4.0 × 104 OBs·mL−1时,2和4龄幼虫的最高累计死亡率分别为83.33%和36.67%,LT50值分别为11.91 d和25.65 d。此外,MisiGV对存活幼虫化蛹率和羽化率也有一定影响,病毒液浓度越高,化蛹率和羽化率越低。当MisiGV浓度为4.0 × 104 OBs·mL−1,MisiGV对羽化率的影响不明显。 结论 本文报道的MisiGV新病毒是具有开发潜力和应用前景的生防因子。 Abstract:Objective To identify a new viral strain of baculovirus which have high virulence against Micromelalopha sieversi (Staudinger). Method The ultrastructure and biological activity of this virus were study to determine its biological control potential. Result The ultrastructure showed that the occlusion bodies of the virus mainly consisted of ellipse, with an average size of 0.43 × 0.21 μm and the inclusion bodies embedded a single rod-shaped virion. It had the structural features of a granulovirus named as Micromelalopha sieversi granulovirus (MisiGV). Biologic activity assays showed that MisiGV is highly virulent in the 3rd instar larvae of M. troglodyta, with an LC50 of 2.37 × 105 OBs·mL−1. The LT50 of the virus increased with the decreasing of virus concentration. When the virus concentration were 1.2 × 107, 4.0 × 106, 4.0 × 105, 1.2 × 105 and 4.0 × 104 OBs·mL−1, the LT50 values were 7.55, 11.61, 14.69, 16.06 and 17.62 days, respectively. The susceptibility of larvae at different instar to different MisiGV concentrations indicated that the younger larvae of M. troglodyta were more susceptible to virus than the older larvae, and the speed of larval death depended on the age and virus concentration. Generally, at 4.0 × 106 OBs·mL−1, the highest cumulative mortality of 2nd and 4th instar larvae were 90.00% and 50.58%, respectively, whereas the times required to kill 50% of the 2nd and 4th instars were approximately 6.81 days and 12.89 days. At 4.0 × 104 OBs·mL−1, the highest cumulative mortality of 2nd and 4th instar larvae were 83.33% and 36.67%, the LT50 values were approximately 11.91 days and 25.65 days. In addition, after different concentration of MisiGV inoculation, the pupation and emergence rate of surviving larvae were significantly lower than that of the control. However, no significant difference on the emergence rate was observed at 4.0 × 104 OBs·mL−1 MisiGV concentration. Conclusion A new virus-MisiGV is reported. This virus-MisiGV is a biological control factor with development potential and application prospects. -
表 1 不同浓度的MisiGV对杨小舟蛾3龄幼虫的毒力(17 d)
Table 1. Different concentrations of MisiGV to the 3rd instar larvae of M. sieversi (17 d)
虫龄
InstarProbit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of
fit significance values(P)LC50 /
(OBs·mL−1)95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit3龄 y=−3.945 + 0.734x 0.240 2.37 × 105 1.13 × 105 4.34 × 105 表 2 不同浓度的MisiGV对杨小舟蛾3龄幼虫时间-死亡率的影响(17 d)
Table 2. Different concentrations of MisiGV on time-mortality of the 3rd instar larvae of M. sieversi (17 d)
浓度
Treatment /(OBs·mL−1)Probit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of fit
significance values(P)LT50 /d 95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit1.2 × 107 y=−5.036 + 5.735x 0.115 7.55 7.067 8.030 4.0 × 106 y=−3.221 + 3.025x 0.374 11.61 10.803 12.531 4.0 × 105 y=−4.772 + 4.089x 0.138 14.69 13.558 16.366 1.2 × 105 y=−4.235 + 4.224x 0.089 16.06 15.475 16.790 4.0 × 104 y=−3.832 + 3.075x 0.441 17.62 16.040 19.930 表 3 不同浓度MisiGV对不同虫龄杨小舟蛾的致死时间
Table 3. Different concentrations of MisiGV on time-mortality of larvae at different instars
浓度
Treatment /(OBs·mL−1)虫龄
InstarProbit 回归方程
Probit structural equation regression
y=a+bx皮尔逊拟合优度显著性值
Pearson goodness of fit
significance valuess(P)LT50 /d 95%置信区间
95% CL上限
Upper limit下限
Lower limit4.0 × 106 2 y=−3.273 + 3.927x 0.230 6.81 6.476 7.145 3 y=−3.221 + 3.025x 0.374 11.61 10.803 12.531 4 y=−3.848 + 3.466x 0.460 12.89 11.923 14.059 4.0 × 104 2 y=−3.741 + 3.477x 0.395 11.91 11.474 12.500 3 y=−3.832 + 3.075x 0.441 17.62 16.040 19.930 4 y=−3.451 + 2.890x 0.487 25.65 24.672 26.864 表 4 不同浓度的MisiGV对幼虫化蛹率和羽化率的影响
Table 4. Effects of different concentrations of MisiGV on the pupation rate and emergence rate of larvae
浓度
Treatment /(OBs•mL-1)死亡率 ± 标准误差
Mortality rate ± SE /%化蛹率 ± 标准误差
Pupation rate ± SE /%羽化率 ± 标准误差
Emergence rate ± SE /%4.0 × 106 57.58 ± 2.85 b 30.00 ± 2.65 a 73.97 ± 2.06 a 4.0 × 105 50.00 ± 0.58 b 51.11 ± 0.33 b 82.64 ± 2.05 b 4.0 × 104 47.78 ± 0.33 b 62.22 ± 1.20 b 92.20 ± 0.47 c 0 12.22 ± 0.88 a 82.27 ± 1.33 c 93.54 ± 1.41 c 注:表中的数据为平均数±标准误,不同小字母表示在不同浓度的病毒条件下p<0.05水平差异显著。
Note: The data is average ± standard error in the table, different small letters indicate that the p<0.05 level is significantly different under different concentrations of virus conditions. -
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