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当前,全球土地盐碱化是人类面临的主要生态危机之一,给农业生产带来了巨大损失,严重威胁人类生存。据不完全统计,全球盐碱地面积约为9.54 × 109 hm2,约占可耕地面积的10%,而我国盐碱地面积约有9.87 × 108 hm2,位居世界第三,大部分为土壤盐化和碱化同时存在的复合盐碱地[1]。目前,科学合理地开发和利用盐碱地已经成为我国农业和林业发展过程中面临的严峻挑战。
楸树(Catalpa bungei C. A. Mey.)是我国特有的珍贵优质用材和园林观赏树种,属于紫葳科(Bignoniaceae)梓属(Catalpa)落叶乔木,其材质好、用途广、经济价值高,自古就有“木王”的美誉。金丝楸自然分布于河南、山东和安徽等省,是楸树的一个地理变种,具有特殊金色纹理、生长快和干型通直的优点,近年来得到大面积推广[2]。目前,楸树的研究主要集中在嫁接繁育[3]、组培快繁[4]、扦插繁殖[5]、遗传转化[6]、遗传多样性分析[7]等方面,关于楸树耐盐碱的研究鲜有报道。认识和了解楸树耐盐碱机制,对指导楸树抗盐碱遗传改良和利用盐碱地具有重要的理论价值和现实意义。
近年来,转录组测序技术(RNA-Seq)发展迅速,该技术无须了解物种基因组信息,弥补了非模式植物转录组研究中缺乏基因组信息的不足[8]。利用转录组解析植物的抗逆机制已经成为逆境研究的热点之一。目前,利用RNA-Seq已进行了大麦[9]、水稻[10]、高粱[11]等盐胁迫的转录组分析,对这些植物响应盐胁迫机理的探讨,加深了人们对植物耐盐机制的认识。但是,通过转录组分析楸树耐盐碱分子机制的研究尚未见报道,仅有通过转录组分析楸树雄性不育和不定根发育分子机制的极少数报道[12-13]。
本研究以金丝楸幼苗为试验材料,分析不同盐碱胁迫对金丝楸生长情况、光合及生理特性的影响,探究其耐盐碱生理机制。进一步利用RNA-Seq,对处理组和对照组进行DEGs分析,在转录水平上对楸树耐盐碱机制进行探索,以期为楸树应答盐碱胁迫的分子机制研究提供理论参考,同时也为重要基因的克隆及其功能研究等奠定基础。
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不同盐碱胁迫后,金丝楸均出现盐碱胁迫危害症状。Na2CO3胁迫对叶片伤害较大,随胁迫浓度和时间的增加,伤害等级增大,胁迫处理14 d,150 mmol·L−1时伤害等级达到3级,而200 mmol·L−1时达到4级;而NaCl胁迫对叶片伤害较小,胁迫处理21 d,150 mmol·L−1时伤害等级达到2级,200 mmol·L−1时达到4级;混合盐碱胁迫下叶片伤害介于Na2CO3和NaCl之间。
不同盐碱胁迫下,金丝楸的生长情况受到不同程度的影响(表1)。NaCl胁迫下,50 mmol·L−1 时新增株高被极显著的抑制,且浓度越高抑制作用越显著;Na2CO3胁迫对新增株高的影响较小,在50 mmol·L−1时新增株高显著降低,且随浓度增加株高极显著降低;混合盐碱胁迫对新增株高抑制作用最轻,但也都达到极显著水平。此外,低浓度NaCl和Na2CO3胁迫对地径有增粗作用,在50 mmol·L−1NaCl胁迫下,新增地径显著增加,而在150、200 mmol·L−1不同盐碱胁迫下,新增地径均极显著减小。
处理
Treatment新增株高
Net growth of plant height/
cm新增地径
Net growth of stem diameter/
mm地上部overground part 鲜质量
Fresh weight/g干质量
Dry weight/gCK 0 18.68 ± 0.62 1.23 ± 0.09 24.60 ± 1.14 5.70 ± 0.19 NaCl胁迫
NaCl stress50 12.58 ± 0.62** 1.50 ± 0.13* 27.06 + 1.08 6.75 ± 0.25* 100 10.00 ± 0.53** 0.98 ± 0.09* 15.94 ± 0.07** 3.31 ± 0.05** 150 8.14 ± 0.36** 0.66 ± 0.10** 10.13 ± 0.14** 2.14 ± 0.09** 200 5.92 ± 0.79** 0.40 ± 0.07** 6.92 ± 0.18** 1.54 ± 0.08** Na2CO3胁迫
Na2CO3 stress50 17.64 ± 0.98* 1.26 ± 0.10 18.87 ± 0.62** 4.68 ± 0.18** 100 12.68 ± 0.58** 1.03 ± 0.09 11.20 ± 0.84** 3.14 ± 0.22** 150 10.48 ± 1.36** 0.57 ± 0.09** 6.87 ± 0.24** 1.73 ± 0.09** 200 6.58 ± 0.74** 0.37 ± 0.05** 4.80 ± 0.10** 1.12 ± 0.05** 混合盐碱胁迫
Mixed saline-alkali
stress50 16.74 ± 0.77** 1.18 ± 0.08 35.18 ± 0.42** 9.13 ± 0.20** 100 13.58 ± 1.06** 0.84 ± 0.13 15.56 ± 0.42** 3.35 ± 0.29** 150 10.10 ± 0.62** 0.59 ± 0.08** 13.09 ± 0.47** 2.67 ± 0.30** 200 9.50 ± 1.22** 0.37 ± 0.08** 6.76 ± 0.33** 1.40 ± 0.05** 处理
Treatment根 root 生物量
Biomass/g根冠比
Root-shoot ratio生长胁迫指数
Growth stress index鲜质量
Fresh weight/g干质量
Dry weight/gCK 0 8.99 ± 0.15 1.28 ± 0.05 6.97 ± 0.24 0.22 ± 0.01 NaCl胁迫
NaCl stress50 8.00 ± 0.16* 0.90 ± 0.03* 7.65 ± 0.27 0.13 ± 0.01** 1.10 ± 0.04 100 4.08 ± 0.09** 0.48 ± 0.03** 3.97 ± 0.07** 0.15 ± 0.01** 0.54 ± 0.01 150 3.29 ± 0.08** 0.33 ± 0.03** 2.47 ± 0.12** 0.15 ± 0.01** 0.35 ± 0.02 200 2.57 ± 0.07** 0.26 ± 0.04** 1.79 ± 0.11** 0.17 ± 0.02* 0.26 ± 0.02 Na2CO3胁迫
Na2CO3 stress50 4.90 ± 0.27** 0.74 ± 0.09* 5.42 ± 0.20** 0.16 ± 0.02* 0.78 ± 0.03 100 2.55 ± 0.43** 0.31 ± 0.07** 3.44 ± 0.29** 0.10 ± 0.01** 0.49 ± 0.04 150 2.51 ± 0.45** 0.27 ± 0.04** 2.00 ± 0.12** 0.16 ± 0.01* 0.29 ± 0.02 200 1.31 ± 0.19** 0.13 ± 0.02** 1.25 ± 0.07** 0.12 ± 0.01** 0.18 ± 0.01 混合盐碱胁迫
Mixed saline-alkali
stress50 12.44 ± 0.90* 2.02 ± 0.18* 11.15 ± 0.37** 0.22 ± 0.02 1.60 ± 0.05 100 6.09 ± 0.92* 0.65 ± 0.06** 4.00 ± 0.34** 0.19 ± 0.02** 0.57 ± 0.05 150 2.62 ± 0.56** 0.28 ± 0.04** 2.95 ± 0.33** 0.10 ± 0.01** 0.42 ± 0.05 200 1.86 ± 0.27** 0.22 ± 0.04** 1.62 ± 0.08** 0.15 ± 0.02* 0.23 ± 0.01 注:“*”表示处理间差异显著(P<0.05),“**”表示处理间差异极显著(P<0.01),(x±SD,n=3),下同
Note: “*” indicated significant difference among different treatments (P<0.05), “**” indicated extremely significant difference among different treatments (P<0.01), (x±SD,n=3).The same as belowTable 1. Effects of different saline-alkali stress on the growth of C. bungei seedlings
植物在盐碱胁迫下生物量的变化可直观反映生长状况(表1)。与对照组相比,NaCl和混合盐碱处理组,50 mmol·L−1时地上部干质量和鲜质量都有增加,但随浓度增加而下降;Na2CO3处理组地上部干质量和鲜质量随着浓度增加而下降。根干质量和鲜质量只在50 mmol·L−1混合盐碱处理组有增加,其它处理组都随浓度增加而下降。生物量的变化趋势与地上部干质量的变化基本一致。各处理组的根冠比均显著降低。不同盐碱胁迫下生长胁迫指数均随胁迫浓度的增加而降低,200 mmol·L−1时各处理组生长胁迫指数分别为0.26、0.18、0.23,可以看出Na2CO3胁迫降幅较大,NaCl和混合盐碱胁迫对生长胁迫指数影响较小。这些结果表明,Na2CO3和混合盐碱胁迫对金丝楸的生长发育抑制更严重,与对叶片危害的影响一致。
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不同盐碱胁迫对金丝楸生理和光合指标的影响见表2。各处理组中,MDA含量和相对电导率都随处理浓度的增加而显著上升。NaCl和混合盐碱处理组中,可溶性糖含量在50~150 mmol·L−1时逐渐积累,而在200 mmol·L−1时小幅下降;而Na2CO3处理组中,在100 mmol·L−1时达到最大值,随浓度增加而下降。各处理组中,Pro含量都明显增加,均在100 mmol·L−1时达到最大值,之后随处理浓度的增加而逐渐下降,但仍明显高于对照组。各处理组中,SOD活性在中低浓度都有所增加,其中,100~150 mmol·L−1时显著增加,200 mmol·L−1时下降。各处理组中,低浓度时叶绿素总量和光合速率增加,都在100 mmol·L−1时达到最大值,之后随处理浓度的增加而逐渐下降。
处理
Treatment相对电导率
Relative conductivity/%可溶性糖含量
soluble sugar/
(μg·g−1)脯氨酸含量
Contents of Pro/
(μg·g−1)SOD活性
SOD enzymatic activity/
(mg·g−1)丙二醛含量
Contents of MDA/
(μg·g−1)叶绿素总量
Contents of total chlorophyll光合速率
Photosynthetic rate/(μmol·m−2·s−1)CK 0 6.35 ± 0.23 14.68 ± 0.64 0.028 ± 0.002 4.88 ± 0.13 7.23 ± 0.34 37.40 ± 2.03 9.63 ± 0.94 NaCl胁迫
NaCl stress50 18.04 ± 1.42** 16.36 ± 0.92 0.034 ± 0.003 5.27 ± 0.78 8.61 ± 0.54 38.04 ± 2.22 11.80 ± 1.08* 100 22.27 ± 1.78** 18.92 ± 1.05* 0.049 ± 0.002* 7.42 ± 0.63* 9.11 ± 0.75* 40.20 ± 3.27 13.07 ± 0.42* 150 34.59 ± 2.67** 19.24 ± 0.75* 0.041 ± 0.001* 6.51 ± 0.52* 9.43 ± 0.66* 36.30 ± 2.89 10.40 ± 1.14 200 48.82 ± 3.94** 19.03 ± 0.84* 0.037 ± 0.002* 4.33 ± 0.35 9.06 ± 0.49* 35.40 ± 0.97 7.40 ± 0.46* Na2CO3胁迫
Na2CO3 stress50 25.33 ± 3.65** 15.93 ± 0.56 0.039 ± 0.001* 5.92 ± 0.57 7.82 ± 0.48 38.50 ± 1.27 13.40 ± 0.44* 100 36.25 ± 2.61** 19.87 ± 0.90* 0.052 ± 0.003* 8.64 ± 0.79* 8.49 ± 0.51 41.08 ± 3.07* 13.67 ± 1.10 150 43.73 ± 4.82** 17.54 ± 0.75 0.044 ± 0.002* 7.58 ± 0.63* 9.82 ± 0.75* 37.88 ± 1.58 11.70 ± 0.95 200 52.57 ± 4.21** 17.06 ± 0.79 0.035 ± 0.003 5.58 ± 0.75 9.55 ± 0.81* 33.70 ± 0.44* 9.43 ± 0.49 混合盐碱胁迫
Mixed saline-
alkali stress50 17.68 ± 1.23** 16.03 ± 0.67 0.036 ± 0.001 5.23 ± 0.37 8.05 ± 0.61 34.28 ± 1.29 14.67 ± 0.78** 100 24.54 ± 2.01** 17.85 ± 0.83 0.047 ± 0.003* 7.94 ± 0.51* 8.74 ± 0.56 41.02 ± 2.73 14.37 ± 1.99* 150 33.78 ± 3.24** 19.08 ± 0.91* 0.043 ± 0.002* 7.16 ± 0.69* 9.27 ± 0.94* 36.72 ± 1.60 10.03 ± 0.57 200 50.36 ± 4.27** 18.91 ± 0.76* 0.032 ± 0.001 5.19 ± 0.57 9.46 ± 0.83* 35.84 ± 1.46 8.57 ± 0.76 Table 2. Effects of different saline-alkali stress on physiological and photosynthetic indicators of C. bungei seedlings
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对试验中的8个样品测序后分别获得了约50 000 000条原始序列,共测得约60.4 Gb原始数据。过滤后Clean datas约占原始序列数据的93%;碱基数约占原始碱基数的93%;Q20和Q30值分别在97%和93%以上。混合2个样品的Clean datas,用Trinity软件进行De novo组装,共得到171 339个Transcripts,55 793个Unigenes。Transcript和Unigene序列平均长度分别为1 768.34 bp和1 275.65 bp,N50分别为2 597 bp和2 263 bp,GC含量分别为39.59%和38.72%。
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对55 793个Unigenes进行基因功能注释,在NR、GO、KEGG、Pfam、eggNOG和Swiss-Prot数据库中分别注释28 722个(51.48%)、13 185个(23.63%)、11967个(21.45%)、15 837个(28.39%)、27 242个(48.83%)和21 694个(38.88%),其中,29 534(52.93%)个Unigenes最少被1个数据库注释,5 124(9.18%)个Unigenes被6个数据库注释。28 722个Unigenes在NR数据库中获得注释,其中,5.8% Unigenes与之完全匹配,15.94% Unigenes不完全匹配。相似度在95%~100%、80%~95%、60%~80%、40%~60%和≤40%的Unigenes比例分别为5.98%、32.12%、35.43%、20.45%和6.02%。被注释到芝麻(Sesamum indicum L.)、地黄猴面花(Erythranthe guttata DC.)、施蒴苣苔(Dorcoceras hygrometricum B.)、葡萄(Vitis vinifera L.)、咖啡(Coffea canephora PF.)、大麦(Hordeum vulgare L.)、可可(Theobroma cacao L.)和其他物种Unigenes比例分别为55.95%、14.67%、3.35%、2.09%、0.97%、0.91%、0.76%和21.31%。
基因GO注释后,将成功注释的基因依照GO的三个大类进行分类。Unigenes富集最多的是代谢过程和细胞过程、细胞膜和细胞、结合和催化活性。KEGG 代谢通路上,基因注释最多的分别为碳水化合物代谢、翻译、信号分解代谢、运输分解代谢和内分泌系统。eggNOG比对注释,基因注释最多目录分别为功能未知、仅通用功能预测、信号传导机制和翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣。
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为进一步了解楸树对不同盐碱胁迫反应的转录组特征,分析比较了对照组和3种处理组的DEGs。对照组与NaCl处理组(A vs C)产生1 779个DEGs(上调844个,下调935个),对照组与Na2CO3处理组(A vs D)产生2 835个DEGs(上调1 326个,下调1 509个),对照组与混合盐碱处理组(A vs E)产生4 059个DEGs(上调2 295个,下调1 764个),说明这些DEGs与不同盐碱胁迫应答密切相关。根据差异分析的结果,维恩图进一步展示了各比较组间特异DEGs的个数以及比较组间的重叠关系。A vs C与A vs D之间有1 036个共有DEGs,A vs D与A vs E之间有1 530个共有DEGs,A vs C与A vs E之间有963个共有DEGs,3个比较组之间有717个共有DEGs。A vs C有497个特异DEGs,A vs D有986个特异DEGs,A vs E有2 283个特异DEGs(图2)。说明共有DEGs可能由不同的盐碱胁迫共同引起的,特异DEGs可能响应不同的盐碱胁迫反应。
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对DEGs进一步GO富集分析发现,在细胞组分、分子功能和生物过程方面存在差异。在细胞组分方面,膜的整体成分、膜的内在成分、膜等在不同盐碱胁迫下被显著富集。在分子功能方面,催化活性、氧化还原酶活性、信号传感器活性、单加氧酶活性、水解酶活性、水解o-糖基化合物等在不同盐碱胁迫下被显著富集。在生物过程方面,类异戊二烯代谢和生物合成过程、防卫反应、碳水化合物代谢过程等在不同盐碱胁迫下被显著富集(图3~5)。
通过对DEGs进一步KEGG分析发现,DEGs主要集中在代谢途径。NaCl胁迫下显著富集的通路为:萜类主干生物合成、苯丙素的生物合成、植物激素信号转导、光合生物中的碳固定(图6);Na2CO3胁迫下显著富集的通路为:淀粉和蔗糖代谢、苯丙素的生物合成、氰氨基酸代谢、精氨酸生物合成(图7);混合盐碱胁迫下显著富集的通路为:淀粉和蔗糖代谢、萜类主干生物合成、苯丙素的生物合成、植物激素信号转导(图8)。
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植物转录因子广泛参与多种生物过程,并在转录水平上调控基因的表达,是许多逆境胁迫响应基因的重要调控因子,在植物对逆境胁迫的应答过程中发挥重要作用。为了进一步研究楸树中可能参与盐碱胁迫的转录因子,笔者共鉴定出6 725个差异表达转录因子,分属于57个不同的转录因子家族,其中,bHLH、ERF、MYB-related、NAC、C2H2、WRKY、MYB和bZIP转录因子家族成员最多。
Physiological and Transcriptomic Analysis of Catalpa bungei Seedlings in Response to Saline-alkali Stresses
- Received Date: 2022-04-14
- Accepted Date: 2022-05-25
- Available Online: 2023-02-20
Abstract: