Identification of the Pathogen Causing Leaf Spot of Cinnamomum camphora, Mycelial Growth Rate, and Its Fungicide Selection

2021年9月从重庆市万州区百安坝街道采集具有典型发病症状的叶片样本，并带回实验室观察并记录发病情况，进一步对样本进行分离纯化。

试验试剂：DNA提取试剂盒（天根生化，DP305）、PCR Master Mix(2X)（天根生化，K1071）、ddH₂O（天根生化，R0581），扩增上下游引物序列如表1所示。根据《植病研究方法》^[17]和《植物病理学实验技术》^[18]制备试验所需培养基。供试杀菌剂名称、生产厂家及所用浓度如表2所示。

从有典型症状的香樟叶片上切下3 mm × 5 mm的叶片样品若干，依次用75%的乙醇浸渍30 s、5%次氯酸钠3 min、无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上去除水分，最后将叶片样本接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上。将分离后的菌株在25 ℃，黑暗条件下培养3～5 d，观察分离结果，纯化后保存菌株待鉴定。

采用两种方法对代表菌株ZT-1进行致病性测定，若叶片有发病特征，随即将发病病菌再次进行分离纯化，经形态学和分子生物学鉴定后若符合第一次分离鉴定结果，则完成其致病性检验。

用无菌解剖针沿叶脉两侧对称刺入，将直径约为5 mm的菌饼和无菌琼脂块分别接种到叶脉两侧，用保鲜膜对接种部位缠绕处理，重复3次，接种后的植株在自然状态下，保持相对湿度在80%～90%，观察并记录其发病情况。

取健康的香樟植株，经无菌处理后，将含有55%甘油的1.0 × 10⁷ CFU·mL⁻¹孢子悬浮液用无菌笔刷均匀涂抹于香樟叶片背面^[17,22]，每片接种100 μL病原菌孢子悬浮液，重复3次，套袋保湿后置于室温培养，以接种55%甘油的健康植株作为对照，每天观察并记录发病情况。

将纯化后的菌株在PDA培养基上以25 ℃培养，期间观察记录菌落和菌丝的着生状况及形态特征。在显微镜下随机选取100个孢子测量长度、宽度；配置75%的无菌PDA培养基，并将孢子接种于滴加PDA的凹玻片上^[17]，保湿培养，观察孢子萌发及附着胞发展状况，并拍照。

菌株经培养后收集菌丝体，利用植物基因组DNA提取试剂盒对代表菌株ZT-1和ZT-5的DNA进行提取。使用引物ITS/ITS4、T1/B-tub2、GDF/GDR、ApF2/ApF6对ZT-1和ZT-5的核糖体转录间隔区序列（rDNA-ITS）、β-微管蛋白（beta-tubulin）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、配偶蛋白交配型（Apn2-Mat1-2 intergenic spacer and partial mating-type protein）基因进行扩增。PCR扩增反应体系均为40 μL，其中2 × Taq Master Mix 20 μL、10 μmol·L⁻¹上下游引物各1.6 μL、DNA模板3.2 μL，ddH₂O补足至40 μL，PCR反应程序如表3。扩增后经1%的琼脂凝胶电泳检测，将剩下30 μL反应物送往上海生工生物工程（成都）股份有限公司进行测序，将测序所得结果通过NCBI进行Blast比对，在PhyloSuite软件中按照ITS-tub2-GAPDH-ApMat顺序串联，通过MEGA11.0软件的最大似然法（Maximum likelihood）构建系统发育树，重复值设置1 000次，建树所用序列登录号如表4。

以不同培养基、温度、光照、pH、碳源、氮源为变量，将直径为5 mm的菌饼接种于供试培养基平板（9 cm）的中央，置于培养箱中培养，研究不同培养条件对代表菌株ZT-1菌丝生长速率的影响。

分别设置10、15、20、25、28、30、37 ℃共7个温度梯度；供试培养基分别为燕麦片琼脂培养基（OMA）、玉米淀粉琼脂培养基（CMA）、查氏培养基（Czapek）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）；用1 mol·L⁻¹的NaCl和1 mol · L⁻¹的NaOH调节pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共5个梯度；光照条件设置全光照、全黑暗、光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）3个处理；将查氏培养基中的蔗糖用等量替换的方法换成可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖，制成不同碳源培养基，以不含碳源培养基作为对照；将查氏培养基中的硝酸钠用等量替换的方法换成尿素、甘氨酸、氨水、硫酸铵，制成不同氮源培养基，以不含氮源培养基作为对照。

试验中除不同温度对菌丝生长的影响外，其余培养条件均为25 ℃、光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）；除不同培养基和碳氮源对菌丝生长的影响外，其余供试培养基均为PDA培养基。试验中接种所用菌块直径均为5 mm，每个处理重复3次。从第5 d开始观察培养基中菌落的生长情况，采用“十字交叉法”测量菌落平均直径，直到对照长满9 cm培养皿结束，按照菌丝生长速率=（处理菌落直径−5/2 × 培养天数） × 100% 计算其菌丝生长速率，利用Excel 2014和spass 27.0分析、处理数据。

采用菌丝生长速率法测定不同杀菌剂对香樟炭疽病病原菌的抑制效果。先用无菌水将各药剂配制成母液，再用无菌水按表3所示浓度配制成5个浓度梯度，将直径为5 mm菌饼移入含药培养基平板（9 cm）中央，以含有无菌水的PDA培养基做对照组，每个浓度梯度和对照组均设3次重复。25 ℃恒温条件下培养3 d后，用“十字交叉法”^[18]测量每个菌落的直径，按照菌落生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径/对照菌落直径−5） × 100% 计算抑菌率。

利用Excel 2014和SPSS 27.0软件进行数据处理。以各杀菌剂浓度的对数为横坐标（x），抑菌率的几率值为纵坐标（y），求出各杀菌剂对香樟炭疽菌株的毒力回归方程、有效抑制中浓度（EC₅₀值）和相关系数（r²）。EC₅₀越小，表明该杀菌剂对香樟炭疽病菌的抑制作用越强，用药越安全，反之越弱。相关系数r²表示抑菌率与药剂浓度之间呈正相关性的密切程度。

本研究共分离出18个培养性状相同的菌落，初步鉴定为炭疽属（Colletotrichum spp.）真菌，经致病性测定，发现ZT-1致病力最强，以优势菌株ZT-1进行菌丝生长速率测定和室内毒力测定的研究，用代表菌株ZT-1和ZT-5进行多基因联合分析。

该病原菌最先危害香樟老叶，后期逐渐向新叶扩展，其发病率为20%～35%，病情指数在20～25，发病初期叶片上呈现黄褐色的斑点，斑点大小通常1～2 mm，发病严重时小斑点扩大进而融合成不规则紫褐色或灰褐色坏死斑点(图1A，1B)。

Figure 1.  Symptoms of C. camphora leaf spot disease, and pathogen culture characteristics and pathogenicity test

健康叶片接种菌饼5 d后开始发病，发病部位呈灰褐色，病斑大小5～6 mm，而接种PDA琼脂块的一侧仅表现刺伤（图1J）。

健康的植株涂抹上菌悬液3 d后，在叶片表面出现多个紫褐色的病斑（图1K），7 d后叶片形成黑褐色病斑，而对照植株未曾发病（图1L）。

根据柯赫氏法则，对发病部位组织病原物进行再分离、纯化和鉴定，分离物形态特征与原接种菌株一致，在无菌PDA培养基块的叶片中没有分离到相关致病菌，因此，确定ZT-1菌株为重庆万州地区香樟叶斑病的致病菌。

菌株ZT-1和ZT-5的培养性状基本相同，在PDA培养基上培养3 d菌落中央呈现灰褐色（图1E），边缘灰白色，7 d后菌落中央形成橘红色的孢子堆（图1F），在体式显微镜下观察孢子堆为乳突状（图1G），大小在0.2～0.8 mm，将孢子堆用无菌接种针刮下，在显微镜下观察到有分生孢子盘（图1H）和刚毛（图1I），孢子盘大小为0.24～0.56 mm，刚毛直立、无隔膜，大小为(128.3～167.6) μm × (2.8～3.6) μm，分生孢子呈长椭圆形、两端钝圆、透明无色、为独立的单胞（图1C），测量其孢子大小为(9.7～18.6) μm × (4.2～6.0) μm，附着胞水滴状（图1D），大小为(3.8～6.5) μm × (4.0～5.2) μm，初步鉴定为炭疽菌属真菌，但具体种类还需进一步确定。

用最大似然法构建的进化树如图2所示，建树所用登录号如表4，多基因分析结果表明菌株ZT-1和ZT-5与Colletotrichum gloeosporioides聚在一支，支持率为100%，将测序结果提交至NCBI/GenBank获得登录号。结合形态学鉴定结果，将引起万州区香樟叶斑病病原菌鉴定为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

Figure 2.  Phylogenetic tree combined with rDNA ITS sequence, tub2, G3PDH, and ApMat genes

C. gloeosporioides在20 ℃以下生长缓慢，25～30 ℃条件下菌丝生长较快， 28 ℃培养5 d后菌落直径达78.33 mm，37 ℃时菌丝的生长明显受到了抑制，菌落直径仅有25.67 mm，表明15 ℃以下及37 ℃以上均能抑制菌丝的生长(图3A)。

Figure 3.  Effects of different culture conditions on mycelium growth of C. gloeosporioides

C. gloeosporioides在PDA培养基上生长最快，25 ℃培养5 d后菌落直径达80.55 mm，其次为Czapek、OMA培养基、CMA培养基，最慢的是PSA培养基，菌落直径仅有51.83 mm (图3B)。

C. gloeosporioides在pH=6.0时菌落直径最大，达到68.33 mm，当pH由6.0逐渐上升到9.0时，菌落生长受到抑制，pH=9.0时菌落直径仅有56.00 mm，由此表明弱酸性条件有利于菌丝的生长，而弱碱性条件抑制菌丝的生长(图3C)。

C. gloeosporioides在不同光照处理下存在显著差异，黑暗条件下菌丝长得最快，菌落直径为61.33 mm，其次是光暗交替，而全光照菌丝生长最慢(图3D)。

C. gloeosporioides在含有葡萄糖的培养基中生长最好，菌落直径可达70.67 mm，其次是麦芽糖、查氏碳、可溶性淀粉，最差的是乳糖，菌落直径仅有49.67 mm(图3E)。

C. gloeosporioides在不同氮源中存在显著差异，以甘氨酸为氮源的培养基生长得最好，菌落直径可达81.83 mm，其次是查氏氮、硫酸铵、尿素，最差的为氨水，菌落直径仅有8.03 mm (图3F)。

5种化学杀菌剂的EC₅₀值由大到小依次为46%氢氧化铜WG＞50%甲基硫菌灵WP＞80%代森锰锌WP＞40%百菌清SC＞15%三唑酮WP。其中80%代森锰锌WP、40%百菌清SC、15%三唑酮WP的EC₅₀均小于10 μg·mL⁻¹，说明香樟炭疽病对这3种杀菌剂的敏感性极高，是化学防治香樟炭疽病的良好农药，其中15%三唑酮WP的防治效果最好，如表5。

5种生物杀菌剂的EC₅₀值由大到小依次为6%春雷霉素WP＞10%多抗霉素WP＞3%中生菌素WP＞0.3%四霉素AS＞1%蛇床子素EW。其中1%蛇床子素EW、3%中生菌素WP、0.3%四霉素AS的EC₅₀均小于10 μg·mL⁻¹，说明香樟炭疽病菌对这3种生物杀菌剂极为敏感；1%蛇床子素EW是生物防治香樟炭疽病的良好生物农药，如表5。

本研究中香樟叶斑病症状与荆州、上海和福建省三明市发现的基本相同，引起荆州香樟叶斑病病原菌为果生炭疽（C. fructicola）和暹罗刺盘孢（C. siamense）^[9]，引起上海和福建三明市香樟炭疽病的病原菌为C. gloeosporioides^[8,34]，但上海香樟炭疽病与福建三明市仅进行了形态鉴定，并未进行分子鉴定，本研究经形态学结合多基因序列分析进一步证实了胶胞炭疽菌（C. gloeosporioides）可以引起香樟炭疽病；本研究分离出的病原菌最适培养基和pH与上海和福建省三明市炭疽病病原菌基本相同，但在黑暗条件、氮源为甘氨酸、28 ℃有利于胶胞炭疽菌（C. gloeosporioides）菌丝生长，这可能与地域差异及重庆市高山环境有关。

炭疽菌是一种高等真菌，寄主范围广泛，具有种类多、变异快等特点^[35]，特别是其复合种鉴定一直是病原菌分类的难题，仅通过形态特征和单基因分析难以准确鉴定，胶孢炭疽复合群是炭疽菌中最为特殊的一类，可分为26个复合种，且复合种种内孢子形态差异较小，必须结合其刚毛、附着胞、载孢体、孢子盘等形态，并联合ApMat的多基因序列对其复合种进行鉴定，结果更为准确。本研究是首次结合这些形态特征和基于ApMat的多基因进行鉴定。生产上其防治主要以化学防治为主，但长期使用化学农药，极易产生抗药性，影响防治效果；与化学农药相比，生物农药具有低毒、低残留、选择性强、不易产生抗药性等优点^[36]，本研究用了5种化学杀菌剂和5种生物杀菌剂对C. gloeosporioides的室内毒力进行测定，发现15%三唑酮WP和1%蛇床子素EW的抑菌效果最好，其EC₅₀值均小于10 μg·mL⁻¹，三唑酮是防治炭疽病时常用的化学杀菌剂，抑制菌丝生长效果优于抑制孢子形成，具有广谱性、低毒性、低残留、多作用位点等特性；蛇床子素是一种植物源农药，通过抑制真菌细胞壁生长来抑制菌丝生长，具有环保、不污染环境、不伤害天敌、不易诱发抗药性等优点^[37]。由于植物病害发生不仅与病原、寄主相关，还与环境条件有关，田间防治环境复杂，室内药剂筛选结果可能与田间防治效果存在差异，因此后续研究可进行田间防效试验，进一步探究杀菌剂对病原菌孢子的影响。

本研究通过形态学和多基因序列分析表明胶孢炭疽（C. gloeosporioides）是引起香樟叶斑病的病原菌，并通过致病性验证了致病菌。通过菌丝生长速率法确定28 ℃、PDA培养基、碳源为葡萄糖、氮源为甘氨酸、弱酸和黑暗的条件下有利于胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）菌丝生长，15%三唑酮可湿性粉剂可作为防治香樟炭疽病的杀菌剂。