Sensitivity of Coryneum populinum Bres. to Five Fungicides

供试菌株：杨棒盘孢菌（Coryneum populinum），由太原师范学院生物科学与技术学院提供。

供试药剂：98%多菌灵（上海麦克林生化科技有限公司），97%戊唑醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），甲基托布津分析标准品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），98%咪鲜胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），98%恶醚唑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。将上述5种原药配制成浓度为1 × 10⁴ μg·mL⁻¹的母液。多菌灵、戊唑醇、恶醚唑用二甲基亚砜溶解，甲基托布津和咪鲜胺用丙酮溶解，再用无菌水将上述母液稀释成试验所需的系列浓度。

PDA培养基^[11]：用于菌株的分离、纯化、一般培养与保存。将1 mL杀菌剂与9 mL溶化后温度降至50 ℃左右的PDA培养基混匀，制备不同浓度的含药剂PDA培养基。

产孢培养基^[12]：用于菌株产生分生孢子。去皮马铃薯200 g，蛋白胨0.5 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃高温灭菌20 min。

孢子悬浮液：接种C. populinum菌株到产孢培养基上，置于恒温培养箱中培养5 d（20 ℃；12 h光照/12 h黑暗），用解剖刀轻轻刮取菌落表面分生孢子至20 mL离心管中，用无菌水冲洗，振荡，混匀后调制孢子悬浮液浓度1 × 10⁵个·mL⁻¹。

将C. populinum接种于PDA培养基和产孢培养基上，20 ℃（12 h光照/12 h黑暗）培养，每隔1 d观察记录病原菌菌落的形状、颜色，于第10 d在光学显微镜下（Olympus BX53）观察菌丝、分生孢子的形态及大小并拍照。

在超净工作台中，用直径0.6 cm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种1个C. populinum菌饼于PDA平板中央，然后置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒温培养箱中培养25 d（12 h光照/12 h黑暗），各处理重复3次，采用十字交叉法测量菌落生长直径，计算平均值。

用移液器吸取200 μL孢子悬浮液于凹玻片的凹槽中，分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃培养箱中黑暗培养，12 h后观察分生孢子萌发情况，芽管长度大于等于孢子长度一半时视为萌发，在显微镜下计数，共计100个孢子，每个处理重复3次，计算孢子萌发率^[13]。孢子萌发率=孢子萌发数/检查孢子总数 × 100%。

采用菌丝生长速率法^[14]测定杀菌剂对病菌的抑菌活性。在含药剂培养基平板中央接种1个菌饼，置于20 ℃培养箱中培养10 d（12 h光照/12 h黑暗），采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝体生长抑制率。每处理重复3次，以无菌水中加入相同体积的二甲基亚砜或丙酮处理作为空白对照^[15]。菌丝生长抑制率=（对照菌落直径−处理菌落直径）/（对照菌落直径−0.6 cm） × 100%。

采用孢子萌发法^[16]测定杀菌剂对分生孢子的抑菌活性。用移液器吸取200 μL孢子悬浮液均匀涂布于含药剂PDA平板上，置于20 ℃恒温培养箱黑暗培养，12 h后观察孢子萌发情况。每处理重复3次，以在平板上加等量无菌水作空白对照。孢子萌发计数同1.2.3。孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率 × 100%。以杀菌剂浓度对数值为横坐标（x），菌丝生长或孢子萌发抑制率所对应的机率值为纵坐标（y），得到毒力回归方程（y=ax + b），计算有效抑制中浓度（EC50值）。

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理，利用IBM SPSS Statistics 25.0软件进行单因素方差分析，并采用Tukey’s法进行差异显著性分析。

在5～35 ℃条件下病菌均可生长。在不同温度条件下，病菌菌落直径差异明显，其中最适宜菌丝生长温度为20 ℃，第25 d时菌落直径可达4.25 cm，与其它温度下菌落直径差异显著（P＜0.05）。低于或高于20 ℃，菌落直径逐渐减小。在不同温度条件下，分生孢子萌发率差异显著（P＜0.05）。12 h时，20 ℃下的分生孢子萌发率最大，为79.00%；在5 ℃、10 ℃及15 ℃时，病菌分生孢子的萌发率分别为30.33%、60.67%及66.00%；当温度高于30 ℃时，分生孢子萌发率明显降低，30 ℃时为23.67%，35 ℃时仅为18.33%（图1）。

Figure 1.  Colony diameter and conidial germination rate of Coryneum populinum under different temperature conditions

在20 ℃时，病菌在PDA培养基上菌丝生长缓慢，56 d时菌落直径5.90 cm；菌丝体发达，表面呈绒毛状，灰黑色，未见产生分生孢子盘（图2A）。在产孢培养基上，5 d左右可观察到分生孢子；分生孢子梭形，浅褐色，多数2～3个隔，少数4～6个隔，顶端尖，末端钝，中间细胞较大，孢子稍弯曲；分生孢子萌发时，多从顶端或末端（基部）生出芽管（图2B）。30 ℃时，病菌分生孢子萌发率下降，部分分生孢子的细胞异常膨大，芽管从中间细胞萌发，芽管基部或顶端膨大（图2C）。

Figure 2.  Colony, conidia and conidial germination of Coryneum populinum

试验结果表明，5种供试药剂对C. populinum均有一定的抑制作用。根据不同药剂与病菌生长的毒力回归方程（相关系数r＞0.95），表明试验结果可信度较高。不同药剂对病菌菌丝体生长的抑制效果存在显著差异（P＜0.05），同一种药剂在不同浓度时对菌丝体生长的抑制效果也存在差异。比较发现，恶醚唑对病菌的毒力最强，EC50值为0.004 8 μg·mL⁻¹；戊唑醇次之，EC50值为0.024 μg·mL⁻¹；多菌灵和咪鲜胺的EC50值分别为0.047、0.25 μg·mL⁻¹；甲基托布津的毒力相对较弱，EC50值为0.49 μg·mL⁻¹（表1）。

试验结果表明，5种供试药剂对病菌分生孢子萌发具有不同程度的抑制作用，同一种药剂对分生孢子萌发的抑制率随药剂浓度的增加而增大。根据不同药剂对分生孢子萌发抑制率的毒力回归方程（相关系数r＞0.96），表明试验结果可信度较高。恶醚唑对病菌分生孢子萌发的抑制作用最强，EC50值最小，为85.07 μg·mL⁻¹；咪鲜胺、甲基托布津及多菌灵的EC50值分别为101.23、123.28和254.80 μg·mL⁻¹；戊唑醇对分生孢子萌发的抑制作用最差，EC50值为327.78 μg·mL⁻¹（表2）。

与对照相比，添加恶醚唑使C. populinum菌落生长缓慢，菌丝体生长明显受到抑制。随着恶醚唑浓度升高，C. populinum菌落生长直径逐渐减小，药剂对菌丝体生长的抑制率逐渐增大。如恶醚唑0.000 5 μg·mL⁻¹，菌落直径为1.42 cm，抑制率27.9%；0.01 μg·mL⁻¹时，菌落直径为1.08 cm，抑制率57.3%；0.1 μg·mL⁻¹时，菌落直径为0.88 cm，抑制率73.9%（图3）。

Figure 3.  Effects of different concentrations of Difenoconazole on colony growth of Coryneum populinum (10 d)

对照中C. populinum菌丝生长粗细均匀，表面光滑，分支正常，产孢正常，芽管从分生孢子顶端或者末端（基部）正常萌发。经恶醚唑作用后，C. populinum菌丝表面变得粗糙、分支处膨大，大多数分生孢子萌发异常，产生的芽管较短，尖端膨大（图4）。

Figure 4.  Microscopic observation of mycelial growth and conidial germination of Coryneum populinum after treatment with 0.000 5 μg·mL⁻¹ Difenoconazole

相比大多数植物病原菌的最适生长温度为25 ℃左右^[17-19]，杨树灰斑病菌的最适生长温度偏低。高温条件下，C. populinum菌丝体生长极其缓慢，多数分生孢子不萌发或者萌发异常，与其他植物病原真菌生长特性相似^[20-21]。不同杀菌剂对C. populinum菌丝体生长的抑制效果存在明显差异，恶醚唑、戊唑醇及多菌灵这3种药剂的抑制作用较强，尤其恶醚唑的抑菌活性最高，EC50值为0.004 8 μg·mL⁻¹，而甲基托布津EC50为0.49 μg·mL⁻¹，二者抑菌活性相差近100倍。由此可见，不同杀菌剂对杨树灰斑病菌菌丝体生长的抑制作用具有一定的选择性。恶醚唑、咪鲜胺及甲基托布津对C. populinum分生孢子萌发的毒力较强，尤其恶醚唑的抑制作用最强，EC50值为85.07 μg·mL⁻¹。综上，恶醚唑对C. populinum菌丝体生长和分生孢子萌发均具有很强的抑制效果，在病菌侵染前期或发病初期使用可以有效控制病害的发生和蔓延。但应注意的是，在病害管理过程中，杀菌剂的使用需兼顾防治效益和抗性治理^[10]，如低浓度的恶醚唑（0.000 5 μg·mL⁻¹）和多菌灵（0.04 μg·mL⁻¹）对C. populinum的抑制效果不理想，可以进一步考虑药剂复配，延缓抗药性的产生^[22-23]。

室内毒力测定试验可以快速和有效分析杀菌剂对病原菌的抑菌效果，是筛选高效杀菌剂的重要依据^[24]。本研究所选用的5种药剂均为广谱性杀菌剂，其中多菌灵和甲基托布津属苯并咪唑类杀菌剂，是果蔬等多种作物病害防治中应用最广泛的杀菌剂，这两种杀菌剂的作用机制是通过干扰菌体内DNA的合成，从而影响细胞分裂，阻碍致病菌增殖^[25-26]。戊唑醇、咪鲜胺及恶醚唑属于甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂，具有高效性和广谱性等特点，对大部分子囊菌和担子菌具有抑制作用，广泛应用于多种作物病害防治^[27-28]。甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂对C. populinum的抑制效果较好，虽然戊唑醇对病菌分生孢子萌发的抑制作用偏低，但对菌丝生长的抑制作用较强，其原因还未明确^[29]。赵华等^[30]研究发现戊唑醇对Marssonina mali孢子萌发的抑制作用强于恶醚唑，这与本研究结果不同，说明杀菌剂对病菌的抑制效果具有选择性。本试验测定了5种杀菌剂原药对C. populinum的室内毒力，与成品制剂相比，更能明确病菌对杀菌剂本身的敏感性，排除了制剂加工中的填料和助剂对测定结果产生的影响^[31]。

恶醚唑作用C. populinum后导致其菌丝表面粗糙、分支处膨大，引起分生孢子两端细胞肿胀，但不萌发芽管，或者芽管从分生孢子中间细胞异常萌发，推断该药剂能够有效阻止C. populinum侵入寄主组织中和在组织中扩展。该研究结果与恶醚唑对Ascochyta caulina分生孢子萌发的抑制作用相似^[32]。有关恶醚唑对C. populinum的抑制作用机制还有待进一步研究。本研究仅在室内测定了5种杀菌剂对C. populinum菌丝体生长和分生孢子萌发的毒性，但对在田间的试验效果还有待于进一步分析。

杨树灰斑病菌C. populinum在5～35 ℃范围内均可生长，最适生长温度为20 ℃，低于或高于最适温度，菌落生长缓慢。30 ℃条件下，多数分生孢子不萌发或者萌发异常。恶醚唑对病菌菌丝生长及分生孢子萌发的抑制作用最强。0.000 5 μg·mL⁻¹恶醚唑作用后，C. populinum菌丝表面粗糙、分支处膨大，分生孢子形态异常，出现芽管分支、膨大或不伸长等畸形特征。