-
土壤盐渍化现象几乎遍布所有的气候区域以及地理环境,是影响农业和林业生产的主要问题。土壤盐渍化使植物受到渗透胁迫、离子毒害、膜透性改变及生理代谢紊乱等危害[1],严重制约了植物的生长,是在植物生产与栽培上一个非常严峻的问题。因此,通过对植物抗盐的分子调控机制进行探析,挖掘耐盐相关基因,并应用于新种质创制和新品种选育,对于缓解土壤盐渍化问题具有重要的现实意义。
长期生长在滨海区域潮间带的红树林,由于其特殊的、有别于陆地和淡水植物的生长环境,演化出了一套特殊的盐逆境适应机制。植物的耐盐机制涉及渗透物质积累、蛋白积累、抗氧化酶的诱导、植物激素的诱导和光合作用路径的变化5个方面[2]。对于红树植物,不同的红树物种具体的耐盐机制有所不同。无瓣海桑(Sonneratia apetala Buch.-Ham.)是海桑科海桑属红树乔木,具有生长快、耐淹浸、耐贫瘠、耐寒强等特点,是滨海滩涂的先锋造林树种,在维持海岸带生态平衡方面起着重要作用[3]。先前有关其耐盐特性的研究主要集中在形态、生理生态层面,如廖岩等[4]研究了不同盐度处理3个月下无瓣海桑根、茎、叶中的蛋白质、可溶性糖、丙二醛含量、抗氧化酶活性的变化情况,并探讨了它们的相互关系,为耐盐树种的选育提供了参考。然而,目前鲜见关于无瓣海桑耐盐分子机制方面的研究报道。
转录组测序是转录组学研究的核心技术,被广泛应用于新基因的挖掘等[5]。目前,最新的测序技术已经发展到了第三代。三代测序技术具有单分子、超长读长、无需PCR扩增等优点,已在基因组学、转录组学、表观遗传学等领域上得到了应用[6]。在转录组学上,三代全长转录组测序(Iso-Seq)的应用,可弥补二代测序技术读段较短、无法覆盖整个转录本的缺点,从而做到从全长转录本水平上研究转录组[7]。但三代测序技术存在碱基错误率高、成本高等缺点,目前应用并不广泛[8]。二代测序有通量高、成本低的特点,且发展至今已取得了较好的工作基础,因此,二代和三代测序结合使用成为很多研究者的策略[9]。如梅瑜等[10]利用基于SMRT技术原理的PacBio平台三代测序技术,对甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth)进行全长转录组测序及分析,从转录数据中鉴定了黄酮类生物合成基因、转录因子、R基因和SSR标记,为甘葛藤的选育和利用提供了基础。然而,对于红树植物,当前研究仅限于对白骨壤(Avicennia marina (Forsk.) Vierh.)[11]、秋茄(Kandelia candel (Linn.) Druce / Kandelia obovata)[12]、角果木(Ceriops tagal (perr.) C. B. Rob)[13]、竹节树(Carallia brachiate (Lour.) Merr.)[14]和老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)[15]等个别物种开展了转录组学相关研究。特别是,至今对无瓣海桑仅开展了以三代全长转录组数据集为基础的盐胁迫应答转录因子挖掘工作[16]。因此,本研究利用二代与三代结合的高通量测序技术,对盐胁迫处理前后的无瓣海桑根系进行转录组测序分析,从中鉴定并初步筛选出无瓣海桑根系响应盐胁迫的候选基因,可为深入研究无瓣海桑的耐盐基因组学、分子生物学和进一步揭示红树植物的耐盐机制提供理论基础。
-
通过SOAPnuke软件对原始数据进行过滤后,如表1所示,有效读序百分率均在98%以上,Q20(碱基量 ≥ 20%)均大于96%且Q30(碱基量 ≥ 30%)均 > 91%,比对率均在87%以上。6个样品转录本reads覆盖度的峰值在90 ~ 100;空白对照RCK组和盐处理RT组的三次生物学重复间的相关系数极高(> 0.98,图1)。以上数据均说明6个样品的测序质量较高,测序数据可靠,可用于后续的差异表达分析。
样本编号
Sample ID总原始读数
Total Raw Reads /M总有效读数
Total Clean Reads /M比对率
Mapping ratio/%Q20/% Q30/% 有效读序百分率
Clean Reads Ratio/%RCK_a 43.82 43.07 87.49 96.89 91.97 98.28 RCK_b 43.82 43.26 87.89 96.92 92.03 98.71 RCK_c 43.82 43.23 87.94 96.89 91.97 98.66 RT_a 43.82 43.35 88.08 97.53 93.21 98.93 RT_b 43.82 43.23 87.62 97.78 93.88 98.65 RT_c 43.82 43.25 87.62 97.77 93.85 98.71 注:RCK,空白对照组,RT,盐胁迫处理10 d的处理组,a、b、 c表示3个生物学重复;Q20、Q30分别表示质量值≥20、30的碱基数占总碱基数的比例。 Notes: RCK represents blank control group, RT represents samples treated with salt for 10 days, and a, b, c represent the three biological repetitions; Q20, Q30, the proportion of bases with value ≥ 20, 30. Table 1. Statistical of high-throughput transcriptome sequencing data
-
无瓣海桑根系在500 mmol·L−1的NaCl胁迫10 d后,共检测到20 289个基因表达量发生了改变(图2)。2组样本间共有14 401个基因差异表达,其中,7 153个差异基因上调表达,log2FC最大值为11.32(isoform_13 051);7 248个差异基因下调表达,log2FC最低值为−12.69(isoform_11 580)。结果表明,下调表达的差异基因数量多于上调的数量。
-
将差异基因比对到Gene Ontology (GO)数据库,共有11 068个差异基因注释到47条GO条目,注释率为76.9%,涉及3大主要功能分类:生物过程、细胞组分和分子功能,占比分别为25.02%,43.76%,31.21%,由此可知,大多数差异基因的功能与细胞组分具有较大的相关性。根据GO功能注释分类结果(图3),这些差异基因在参与生物过程中,主要集中在细胞过程和代谢过程;在细胞组分中,主要集中在细胞、膜、膜部分;在分子功能中,主要集中在连接、催化活性。表明在高盐胁迫下,上述的亚类中涉及到的基因可能在无瓣海桑根系中响应强烈。
-
在KEGG分析结果中,共有6 189个差异基因富集到134条通路,以Q-value<0.05作为显著富集标准,共有14条显著富集的通路(图4),其中,富集差异基因数量最多的是植物激素信号转导(ko04075),涉及512个基因,最显著富集的植物-病原体相互作用(ko04626)涉及367个基因。富集分析结果表明,无瓣海桑根系基因主要通过14条显著通路参与盐胁迫的响应,并且其中涉及的基因可能对无瓣海桑根系耐盐性的调控发挥作用,关注这些显著通路,有助于对无瓣海桑根系耐盐候选基因的筛选。
-
通过进一步对差异基因进行功能注释分析,本研究共筛选出89个无瓣海桑根系抗盐候选功能基因,涉及12条KEGG通路(表2,图5)。
基因ID log2FC KEGG功能注释 参与通路 活性氧清除 isoform_61079 6.46 超氧化物歧化酶,铜锌家族
superoxide dismutase, Cu-Zn family过氧物酶体
Peroxisomeisoform_173361 1.47 超氧化物歧化酶,铁锰家族
superoxide dismutase, Fe-Mn familyisoform_287367 6.10 过氧化物酶
peroxidase苯丙素生物合成
Phenylpropanoid biosynthesisisoform_57012 −4.69 isoform_25838 3.16 过氧化氢酶
catalaseMAPK信号通路-植物
MAPK signaling pathway-plantisoform_58072 −1.83 谷胱甘肽过氧化物酶
Glutathione peroxidase谷胱甘肽代谢
Glutathione metabolismisoform_67198 5.39 黄酮醇合成酶
flavonol synthase类黄酮生物合成
Flavonoid biosynthesis渗透调节 isoform_17235 7.54 海藻糖-6-磷酸磷酸酶
trehalose 6-phosphate phosphatase淀粉和蔗糖代谢
Starch and sucrose metabolismisoform_134633 −4.24 海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶
trehalose 6-phosphate synthase/phosphataseisoform_9570 3.75 水苏糖合成酶
stachyose synthetase谷胱甘肽代谢
Galactose metabolismisoform_49176 7.98 棉子糖合成酶
raffinose synthaseisoform_16906 5.82 δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶
delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase氨基酸的生物合成
Biosynthesis of amino acidsisoform_31419 −1.20 isoform_272673 5.53 甜菜碱醛脱氢酶
betaine-aldehyde dehydrogenase甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢
Glycine, serine and threonine metabolismisoform_228012 2.21 脯氨酸脱氢酶
proline dehydrogenase精氨酸和脯氨酸代谢
Arginine and proline metabolismisoform_8893 −2.72 植物激素 isoform_6363 8.35 生长素应答因子
auxin response factor植物激素信号转导
Plant hormone signal transductionisoform_119200 6.23 生长素应答GH3基因家族
auxin responsive GH3 gene familyisoform_126871 3.48 生长素响应蛋白
auxin-responsive protein IAAisoform_278367 4.36 SAUR家族蛋白
SAUR family proteinisoform_50365 −7.94 isoform_48396 6.73 脱落酸受体PYR/PYL家族
abscisic acid receptor PYR/PYL familyisoform_49285 −6.23 isoform_221018 −2.92 蛋白磷酸酶2C
protein phosphatase 2Cisoform_267229 4.96 脱落酸应答元件结合因子
ABA responsive element binding factorisoform_43536 −2.46 蛋白激酶 isoform_216952 4.44 促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1
mitogen-activated protein kinase kinase kinase1MAPK信号通路-植物
MAPK signaling pathway-plantisoform_182097 4.28 促分裂原活化蛋白激酶4
mitogen-activated protein kinase4isoform_140969 1.38 促分裂原活化蛋白激酶6
mitogen-activated protein kinase 6isoform_161961 −7.52 钙依赖性蛋白激酶
calcium-dependent protein kinase植物-病原体相互作用
Plant-pathogen interactionTable 2. List of partial salt-resistance candidate genes in root of S. apetala
-
正常情况下,植物体内存在着活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生和清除的动态平衡,但外界的不良环境会打破这个平衡,导致ROS的积累,产生毒害[22]。植物体内存在2种ROS清除机制——酶促清除和非酶促清除,前者主要涉及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等,后者主要涉及抗坏血酸、类黄酮物质等[23]。本研究发现6类共24个活性氧清除基因(图6),其中,上调表达基因数量最多的是过氧化物酶基因,总数为7,表达量差异变化最大的为铜锌家族超氧化物歧化酶基因,差异倍数达到6.46。这些上调表达的基因有利于无瓣海桑在盐胁迫前期,合成多种抗氧化酶类物质,提高体内抗氧化和ROS清除的能力,增强耐受性。
-
植物在对盐胁迫的适应过程中,细胞会积累一定量的可溶性有机物质,作为渗透调节物质参与渗透调节,以适应外界的低水势[2]。在本研究中,发现10种共22个编码生成有机渗透调节物质的基因(图6),涉及水苏糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖、脯氨酸、甜菜碱、热激蛋白等渗透调节物质。在这些基因中,部分基因存在上调表达,表明在盐胁迫下,无瓣海桑可通过合成一些渗透调节物质,以调节盐渍环境下植物细胞内的渗透势。
-
植物体内的多种激素在其生长发育、代谢等生理过程中发挥着重要的调控作用[24]。本研究发现7种共19个涉及2种植物激素(IAA与ABA)的基因(图6),其中,IAA途径相关的有生长素应答因子(auxin response factor, ARF)、生长素应答GH3家族基因(auxin responsive GH3 gene family, GH3)、SAUR家族蛋白(SAUR family protein, SAUR)和生长素响应蛋白(auxin-responsive protein IAA, IAA)共11个基因;涉及ABA途径的有脱落酸应答元件结合因子(ABA responsive element binding factor, ABF)、脱落酸受体PYR/PYL家族(abscisic acid receptor PYR/PYL family, PYL)和蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C, PP2C)共8个基因。IAA相关基因除GH3 基因均上调表达外, 其他同时存在上下调表达,而ABA相关基因大部分下调表达。上述结果表明,植物激素能够在无瓣海桑的信号转导途径中发挥作用,不同激素共同调控盐胁迫响应过程。
-
蛋白激酶可调控植物的生长,在逆境中起到调控感受胁迫信号、启动各种非生物逆境响应的作用[25]。 本研究发现6种共10个蛋白激酶相关基因(图6),其中,2种促分裂原活化蛋白激酶基因(mitogen-activated protein kinases, MAPK)MPK4、MPK6和2种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因PBS1、CTR1均上调表达,1种促分裂原活化蛋白激酶基因(mitogen activated protein kinase, MEKK)MEKK1和1种钙依赖性蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase, CDPK)中均有2个上调表达,1个下调表达。可见这些蛋白激酶在无瓣海桑根系响应高盐胁迫时,发挥着尤为重要的调控作用。
-
转录因子是一类功能蛋白质,具有调控基因表达的作用。当植物受到逆境胁迫时,转录因子通过与相应的顺式作用元件相互作用,调控并减轻逆境胁迫带来的伤害,以适应各种逆境[26]。本研究发现8种共14个差异表达的转录因子(图6),涉及5个家族,分别为WRKY家族、MYB家族、GRAS家族、bHLH家族和EREBP家族,其中,WRKY家族发现的成员数量最多,暗示WRKY家族在无瓣海桑响应盐胁迫中起着重要的调控作用。
Transcriptome Analysis of Sonneratia apetala Root in Response to Salt Stress
- Received Date: 2022-03-29
- Accepted Date: 2022-05-31
- Available Online: 2023-02-20
Abstract: