Establishment of Plant Regeneration System from Internodes of <i>Betula alnoides</i>

WANG Huan; GUO Jun-jie; WANG Chun-sheng; YIN Hai-feng; ZENG Jie

doi:10.12403/j.1001-1498.20230159

Objective To explore the optimal media components at stages for callus induction, adventitious bud differentiation, rooting induction of indirect organogenesis, a high-frequency regeneration system of Betula alnoides was established for providing theoretical evidence and technical support for genetic transformation and multiplication of elite cultivars of this species. Methods The internode stem segment of Betula alnoides TC2 clone was used to conduct callus induction, adventitious bud differentiation and rooting medium screening experiments, and the pre-culture conditions were optimized, revealing the fundamentals of callus induction stage. The effects of basic media, application of hormones, and dark culture at callus induction stage, hormone combination at adventitious bud differentiation stage, and preculture conditions on adventitious bud differentiation were assessed. Results (1) The suitable conditions for preculture were: 15 days under low illumination (1 000 lx), then 7 days in dark and 8 days under normal illumination (2 000 lx), and properly yellowing plantlets could be obtained under these conditions with the mean height and internode length reaching 6.57 cm and 3.07 cm, respectively; (2) The medium suitable for callus induction of internodes was WPB5 + 1.0 mg·L⁻¹ TDZ + 0.2 mg·L⁻¹ NAA + 20 sucrose + 5.8 g·L⁻¹Agar (pH5.8) for the callus induction, and the optimal dark culture time was 15 days; (3) The medium suitable for callus differentiation was WPM + 0.8 mg·L⁻¹ 6-BA + 0.5 mg·L⁻¹ GA₃ + 30 sucrose + 5.8 g·L⁻¹Agar (pH5.8); (4) Using the above optimal scheme, the differentiation rate and net proliferation coefficient of the internode segments were 88.89% and more than 6.2, respectively, and 56.8 adventitious buds were obtained eventually per preculture plantlet on average; and (5) The reasonable rooting medium was the Wood Plant Medium supplemented with 0.2 mg·L⁻¹ NAA + 20 g·L⁻¹ sucrose, and the rooting rate could reach 100% after 30 days. Conclusion A high-frequency regeneration system of B. alnoides is completely established with high stability and good repeatability in the study. It can not only has a high callus differentiation rate and proliferation coefficient, but also improves the efficiency of internode production. The findings can provide a technical support for tissue culture and future genetic improvement through genetic engineering of B. alnoides.

HTML

西南桦（Betula alnoides Buch.-Ham. ex D. Don）是中国南方造林面积较大的乡土珍贵阔叶树种之一，其木材材质优良，是制作木地板、高档家具、乐器等的优良材料^[1]；其树皮可用于治疗感冒、产后疼痛以及消化系统和骨科疾病等^[2]，树皮提取物具有抗HIV-1整合酶，并具有抗炎、降血脂、减肥之功效^[3-5]。西南桦在生物多样性和地力维持、水源涵养以及碳素固定等方面亦发挥着重要作用，被广泛应用于生态公益林和珍贵用材林建设。随着分子生物技术的快速发展，利用基因工程进行遗传改良已成为林木育种的重要途径之一。遗传转化是开展植物遗传改良的必要技术，同时也是验证基因功能、解析性状形成机制的关键技术，而高效稳定的转化受体再生体系是遗传转化的必要前提。

中国西南桦的离体培养始于2000年^[6]，主要有直接器官发生^[7-9]、间接器官发生^[10]以及体胚发生^[6]等构建方式。目前能形成完整植株的主要是通过直接器官发生途径，特别是腋芽萌发途径，但该途径增殖率通常较低，且只适合于西南桦优良品种的规模扩繁，并不适用于遗传转化。间接器官发生是离体培养中通过外植体诱导愈伤组织再分化的形态建成过程^[11]，相比直接器官发生，其潜在繁殖系数更高，作为分子育种的平台也更具优势^[12-13]。目前，西南桦通过间接器官发生方式的再生体系尚未见成功报道。

关于桦木科的间接器官发生，目前以白桦（Betula platyphylla Suk）和欧洲白桦（Betula pendula Roth）研究较多，所用外植体一般为种子^[14-16]、叶片^[17-19]、根段^[20]、茎段^[21]等。以种子为外植体研发的再生体系，具有分化率高且再生芽多的优势，但是，由于该体系需要“切种子”，对于细小粒的桦木种子而言技术要求极高，且每粒种子的遗传背景不同，严格地说，它并不利于开展转基因植株的分子试验。利用无性系组培苗的根、茎、叶作为外植体，可使受体材料保持相对一致。有研究发现，利用白桦茎段、叶柄和叶片均能诱导愈伤组织和不定芽分化，茎段的效果整体上优于叶片和叶柄^[22]；欧洲白桦根较难诱导愈伤组织形成，且其愈伤组织易老化，需要较长时间诱导才能分化出不定芽^[20]。前期研究发现，西南桦茎段与白桦^[22]一样较易诱导愈伤组织和不定芽分化，但因节间较短容易切到芽点，增加了操作难度，且材料利用率不高。因此，增加西南桦试管苗的节间长度对茎段再生的外植体取材非常重要。

本研究以西南桦无性系TC2试管苗为材料，针对愈伤组织诱导、不定芽分化、生根等器官间接发生阶段开展试验，重点研究激素浓度、暗培养时间和茎段外植体培育条件等对不定芽诱导的影响，以期建立高效稳定、重复性良好的西南桦间接器官发生再生体系，为今后开展西南桦组织培养以及利用基因工程进行其遗传性状改良奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 试验材料及条件

以课题组前期培养的西南桦无性系TC2试管苗为材料；如无特别注释，其培养条件为光照强度2 000 lx，光照时间16 h·d⁻¹，温度25 ℃ ± 2 ℃。

1.2. 研究方法

1.2.1. 茎段再生阶段培养基的筛选

茎段再生阶段培养基的筛选试验中，选取继代培养30 d的TC2试管苗，剪取其带顶芽茎段，接种于培养基WPM + 0.15 mg·L⁻¹NAA + 20 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂（pH5.8），培养30 d后避开腋芽剪取4～7 mm节间茎段用于愈伤组织诱导试验。

（1）愈伤组织诱导阶段愈伤组织诱导研究包括基本培养基筛选、外源激素的浓度筛选以及暗培养时间筛选3个单因素试验（表1），分别含4、9和3个处理（水平）。所有试验每个处理均3次重复，每次10个茎段。

因素Factor	水平 Level
因素Factor	1	2	3	4	5	6	7	8	9
基本培养基 Basic medium	MS	1/2MS	WPM	WPB5	---	---	---	---	---
外源激素/mg·L⁻¹ Exogenous hormones	TDZ				NAA
外源激素/mg·L⁻¹ Exogenous hormones	0.1	0.5	1.0	2.0	0.0	0.05	0.10	0.20	0.50
暗培养时间/d Dark culture time	10	15	20	---	---	---	---	---	---
注：外源激素试验中，筛选TDZ浓度时NAA浓度固定为0.1 mg·L⁻¹；筛选NAA浓度时，TDZ的浓度固定为1.0 mg·L⁻¹；表中“---”代表该水平下不设处理　　Notes: In the experiments of exogenous hormones, the concentration of NAA was fixed as 0.1 mg· L⁻¹ when screening TDZ concentrations; and the concentration of TDZ was fixed as 1.0 mg·L⁻¹ when screening NAA concentrations; The "---" in the table indicates that there is no treatment below that level

Table 1. Single-factor experiments at callus induction stage

基本培养基试验中，各处理的激素添加均为1.0 mg·L⁻¹TDZ和0.1 mg·L⁻¹NAA；外源激素浓度梯度试验以WPB5为基本培养基，选用TDZ和NAA的不同浓度（表1）进行试验；暗培养时间优化试验按表1中的3个时长进行培养，所用培养基为WPB5 + 1 mg·L⁻¹ TDZ + 0.1 mg·L⁻¹NAA + 20 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂（pH5.8）。统计愈伤诱导率后将表1中所有试验处理的愈伤组织转接至培养基WPM + 1 mg·L⁻¹6-BA + 0.5 mg·L⁻¹GA₃ + 30 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂（pH5.8）中进行后续分化培养，在正常光照条件下培养60 d后统计发生分化的愈伤组织数与每个茎段分化的不定芽数（高度5 mm以上），期间30 d继代1次，并计算分化率、净增殖系数和总增殖系数。

（2）愈伤组织分化不定芽阶段以WPM为基本培养基，采用6-BA（A）、GA₃（B）和NAA（C）3种激素（3因素），每因素包括2水平，构成完全随机试验（表2），分析各激素组合的不定芽诱导效果，以筛选分化培养基。选择在上述最佳愈伤组织诱导培养基上培养出的大小相近的愈伤组织，分别接种于8种组合处理，每个处理3次重复，每次重复接种10 块愈伤组织。每隔30 d转接（继代）1次，60 d后观察统计不定芽诱导情况，包括发生分化的愈伤组织数、每个茎段分化的不定芽数、分化率、净增殖系数和总增殖系数。

水平 Level	A: 6-BA/ (mg·L⁻¹)	B: GA₃/ (mg·L⁻¹)	C: NAA/ (mg·L⁻¹)	处理号 Treatments	A: 6-BA / (mg·L⁻¹)	B: GA₃ / (mg·L⁻¹)	C: NAA / (mg·L⁻¹)
1	0.8	0.1	0.0	Ⅰ	A₁	B₁	C₁
				Ⅱ	A₁	B₁	C₂
				Ⅲ	A₁	B₂	C₁
				Ⅳ	A₁	B₂	C₂
2	1.5	0.5	0.2	Ⅴ	A₂	B₁	C₁
				Ⅵ	A₂	B₁	C₂
				Ⅶ	A₂	B₂	C₁
				Ⅷ	A₂	B₂	C₂

Table 2. Hormone combination experiment at callus differentiation stage

（3）生根培养阶段待分化的不定芽长至2～3 cm，剪取单芽接种至1/2MS或WPM培养基，附加NAA（0.1和0.2 mg·L⁻¹）或IBA （0.1 和0.2 mg·L⁻¹）、20 g·L⁻¹蔗糖和 5.8 g·L⁻¹琼脂进行生根诱导，以筛选生根培养基。试验设计详见表3。每个处理3次重复，每次重复12株。培养过程中追踪统计各组合生根起始时间，于12 d和30 d后统计生根率和生根条数，并测定30 d时根长。

水平 Level	A: 基本培养基 Basic medium	B: IBA / （mg·L⁻¹）	C: NAA / （mg·L⁻¹）	处理号 Treatments	A: 基本培养基 Basic medium	B: IBA/ （mg·L⁻¹）	C: NAA/ （mg·L⁻¹）
1	1/2MS	0.1	0.1	Ⅰ	A1	B1	/
				Ⅱ	A1	B2	/
				Ⅲ	A1	/	C1
				Ⅳ	A1	/	C2
2	WPM	0.2	0.2	Ⅴ	A2	B1	/
				Ⅵ	A2	B2	/
				Ⅶ	A2	/	C1
				Ⅷ	A2	/	C2

Table 3. Experimental design for rooting induction

1.2.2. 预培养条件的优化

因研究过程中发现外植体的状态影响各阶段的试验效果，于是针对预培养条件进行如下优化。选取继代培养30 d的TC2试管苗，剪取其带顶芽茎段，接种于培养基WPM + 0.15 mg·L⁻¹NAA + 20 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂（pH5.8），于8种条件下进行培育（表4）。每个处理３次重复，每次重复10株，30 d后统计株高和节间长度。分别取8个处理的节间茎段，同时统计每株可取平均茎段数，然后接种于最佳愈伤组织诱导培养基（WPB5 + 1.0 mg·L⁻¹TDZ + 0.2 mg·L⁻¹NAA + 20 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂）；暗培养15 d后转至最佳愈伤组织分化的培养基（WPM + 0.8 mg·L⁻¹6-BA + 0.5 mg·L⁻¹GA₃ + 30 g·L⁻¹蔗糖 + 5.8 g·L⁻¹琼脂）。每个处理３次重复，每次重复24个茎段，75 d后统计不定芽分化情况，统计指标同（2）。

处理号 Treatments	培养条件 Culture conditions
Ⅰ	2 000 lx培养30 d 30 days under illumination of 2 000 lx
Ⅱ	2 000 lx培养15 d，暗培养7 d，2 000 lx培养8 d 15 days under illumination of 2 000 lx, 7 days in dark, and 8 days under illumination of 2 000 lx
Ⅲ	2 000 lx培养15 d，暗培养15 d 15 days under illumination of 2 000 lx, 15 days in dark
Ⅳ	1 000 lx培养30 d 30 days under illumination of 1 000 lx
Ⅴ	1 000 lx培养15 d，暗培养7 d，1 000 lx培养8 d 15 days under illumination of 1 000 lx, 7 days in dark, and 8 days under illumination of 1 000 lx
Ⅵ	1 000 lx培养15 d，暗培养15 d 15 days under illumination of 1 000 lx, 15 days in dark
Ⅶ	1 000 lx培养15 d，暗培养7 d，2 000 lx培养8 d 15 days under illumination of 1 000 lx, 7 days in dark, and 8 days under illumination of 2 000 lx
Ⅷ	2 000 lx培养15 d，暗培养7 d，1 000 lx培养8 d 15 days under illumination of 2 000 lx, 7 days in dark, and 8 days under illumination of 1 000 lx

Table 4. Screening test on preculture conditions of internode

1.3. 数据分析

统计各试验数据，计算以下指标：

Y=（n/N） × 100%，F=（m/M） × 100%，R=（q/Q） × 100%，T _t= N _a/ m，T _n= N _a/ M

Y为愈伤诱导率， n为愈伤组织诱导数， N为接种茎段数； F为愈伤分化率， m为分化愈伤组织数， M为接种愈伤组织数； R为生根率， q为生根株数， Q为接种数； T_t为总增殖系数， T_n为净增殖系数， N_a为不定芽总数。使用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理，使用IBM SPSS Statistics13.0软件进行方差分析和Duncan多重比较。

3. 讨论

外植体的选择是决定再生成效的第一步。幼态组织具有更高的形态发生能力，传统培养选取靠近形态学上端的材料更易成功^[23-26]，但每个植株可有效利用的材料较少，从而增加了取材时间和培养成本。对于节间茎段的取材而言，适当的黑暗培养可使试管苗生长加快、节间伸长、幼嫩程度增加^[27]，相对于传统培养仅能利用较短的顶端节间而言，提升其操作性的同时增加其茎段利用率。本研究通过设置8种培养条件，筛选出再生效率和取材利用率均较高的组合，即弱光培养（1,000 lx）15 d后，转至暗培养7 d，接着正常光照（2,000 lx)）培养8 d。与常规培养（处理Ⅰ）相比，总增殖系数和净增殖系数分别提高8.8%和12.2%，每株平均再生芽数提高83.2%。究其原因，由于植物在黑暗中节间伸长加快，而随着光照时间的减少，光合作用变弱，光合产物也较少，相应地维管束和机械组织较不发达，更容易脱分化形成愈伤组织^[28]。亦有研究表明，一段时间黑暗培养后的黄化苗，其生长素、可溶性糖、氨基酸和蛋白质等含量均比光培养苗高，即黄化培养后的幼茎生理代谢更活跃^[29]，更有助于脱分化形成胚性愈伤组织，从而提高其再生效率。

愈伤组织的诱导与其基本培养基、外源激素浓度、培养时间长短等因素密切关系。木本植物通常使用MS或WPM培养基作为基本培养基。本研究发现西南桦茎段在MS培养基上不定芽诱导率极低，在WPM培养基上也并不高，而在WPB5培养基上表现较好。与WPM培养基相比，WPB5换用了B5培养基的有机物，其有机物含量更高；相比MS培养基，WPB5替换了有机成分的同时还降低了氮和钾含量。由此可见，无机盐浓度低且有机物浓度高的基本培养基更适合西南桦茎段愈伤组织诱导。分析其原因，西南桦属于酚类物质较多的物种，培养过程中容易氧化形成醌类物质而产生褐变，从而影响外植体的脱分化和器官分化。而低盐培养基可以适当减轻此类褐变^[30]，从而诱导出愈伤组织。此外，在愈伤组织形成的起动期与分裂期，外植体细胞的合成代谢活动加强，需要迅速且大量地进行蛋白质和核酸的合成，适当添加有机物质可有效促进愈伤组织诱导^[31]。

细胞分裂素和生长素是西南桦茎段器官发生途径愈伤组织诱导的必需因子，也是提高再生效率的重要因素。TDZ具有生长素和细胞分裂素的双重功能，可使许多难再生的植物种实现高频分化^[32-34]。如蒋淑磊等^[34]对照山白杜鹃的茎段进行愈伤组织诱导研究发现，最佳TDZ浓度为1.0 mg·L⁻¹，愈伤组织诱导率可达96.3%，增殖系数为4.9。本研究通过设置0.1～2.0 mg·L⁻¹的TDZ浓度梯度开展试验，发现随着TDZ浓度的增加，西南桦茎段的愈伤组织分化率和总增殖系数呈现先上升再降低的趋势，亦以1.0 mg·L⁻¹浓度处理表现最好，过高则会导致愈伤组织逐渐变得疏松绵软，不利于不定芽分化。NAA同样对愈伤组织的诱导至关重要^[35]，本研究发现，NAA浓度为0.2 mg·L⁻¹时，其愈伤组织分化出不定芽的概率与数量均比其它浓度高；浓度为0.5 mg·L⁻¹时，其再生效果明显下降。关于暗培养时间，本研究结果显示，西南桦茎段愈伤组织诱导的最佳时间为15 d，培养20 d效果仅次于15 d，但培养10 d效果则明显降低。这可能与暗培养期间从培养基中吸收的TDZ量有关，TDZ具有快速诱导愈伤组织的效果，同时也具有剂量效应，因此外植体不宜长时间培养在该培养基上，但时间过短亦达不到相应效果。

分化率和增殖系数是决定不定芽分化效果的重要指标。本文对比研究了6-BA、GA₃、NAA 3种激素对西南桦不定芽分化的影响，发现GA₃的影响最大，而且不同浓度对应的分化率和总增殖系数差异较大，浓度为0.1和0.5 mg·L⁻¹时，其分化率相差10%以上，总增殖系数相差0.5以上。究其原因，GA₃的使用有助于细胞伸长，加快不定芽的出芽速度，使得在统计时间段内出现较多的不定芽^[36]。与之不同的是，低浓度6-BA和NAA更有利于不定芽分化。进一步分析发现，愈伤组织诱导阶段TDZ的添加可能影响了分化阶段激素的添加。如前所述，TDZ具有生长素和细胞分裂素的双重功能，既可以作为一种潜在的细胞分裂素物质，又可以诱导形成部分生长素类物质。愈伤组织诱导阶段高浓度TDZ的添加使茎段愈伤组织积累了部分生长素和细胞分裂素类物质，从而较低浓度的添加即可满足愈伤组织分化的需求^[37]。就6-BA而言，虽然浓度越高，愈伤组织表面芽点越多，但过高的细胞分裂素/生长素比值容易导致这些芽点难以成芽，最终影响再生效率。本研究还发现，不添加NAA时不定芽分化效果更好，亦可能与愈伤组织诱导阶段TDZ和NAA的添加积累了较多的生长素类物质有关，若在分化阶段继续添加生长素可能会导致激素配比不当，从而影响不定芽的分化。因此，综合考虑愈伤组织诱导和不定芽分化两阶段的激素使用对再生体系的建立至关重要。

4. 结论

综上所述，本研究围绕西南桦节间茎段再生各阶段展开试验，建立了完整的西南桦间接器官发生途径再生体系。具体而言，增殖苗经弱光培养 (1 000 lx) 15 d后转至暗培养7 d，再正常光照 (2 000 lx) 培养8 d可获得适度黄化的植株，其平均株高和节间长度分别为6.6 cm和3.1 cm；以其节间茎段为外植体，接种于添加1.0 mg·L⁻¹ TDZ和0.2 mg·L⁻¹ NAA的WPB5培养基上，暗培养15 d后转接至含0.8 mg·L⁻¹ 6-BA 和 0.5 mg·L⁻¹ GA₃ 的WPM培养基上，正常光照培养2个月，期间继代1次，则可实现愈伤组织分化率和净增殖系数达88.9%和6.2以上，平均每个植株可产生56.8个不定芽；不定芽接种于添加0.1 mg·L⁻¹ NAA的WPM培养基上，培养30 d后生根率可达100%。本研究为西南桦的遗传改良提供了理论依据和技术支持，亦为其组培快繁开辟了一条行之有效的新途径。

Reference (37)

[1]	曾杰, 郭文福, 赵志刚, 等. 我国西南桦研究的回顾与展望[J]. 林业科学研究, 2006, 19(3):379-384.
[2]	MANANDHAR N P. A survey of medicinal plants of Jajarkot district, Nepal[J]. Journal of Ethnopharmacology, 1995, 48(1): 1-6.
[3]	SUR T K, PANDIT S, BATTACHARYYA D, et al. Studies on the antiinflammatory activity of Betula alnoides bark[J]. Phytotherapy Research, 2002, 16(7): 669-671.
[4]	DOMINIC A R A, MALARVILI T, VELAVAN S. Restorative effect of Betula alnoides bark on hepatic metabolism in high fat diet fed Wistar rats[J]. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2015, 6(3): 1281-1288.
[5]	CHANIAD P, SUDSAI T, SEPTAMA A W, et al. Evaluation of anti-HIV-1 integrase and anti-inflammatory activities of compounds from Betula alnoides Buch-Ham[J]. Advances in Pharmacological Sciences, 2019, 2019: 2573965.
[6]	樊国盛, 邓莉兰. 西南桦组织培养研究[J]. 西南林学院学报, 2000, 20(3):147-151.
[7]	刘英, 曾炳山, 裘珍飞, 等. 西南桦以芽繁芽组培快繁研究[J]. 林业科学研究, 2003, 16(6):715-719.
[8]	谌红辉, 曾杰, 贾宏炎. 西南桦叶芽离体培养再生植株技术[J]. 林业实用技术, 2007, 46(10):21-22.
[9]	陈伟, 施季森, 陈金慧, 等. 西南桦不同种源外植体组织培养技术[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2007, 31(1):27-30.
[10]	陈荣, 冯立新, 刘颖, 等. 西南桦愈伤组织培养试验[J]. 北方园艺, 2011, 33(16):158-160.
[11]	孙贝贝, 刘杰, 葛亚超, 等. 植物再生的研究进展[J]. 科学通报, 2016, 61(36):3887-3902.
[12]	季孔庶, 王潘潘, 王金铃, 等. 松科树种的离体培养研究进展[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2015, 39(1):142-148.
[13]	YUAN L, MA S Y, LIU K, et al. High frequency adventitious shoot regeneration from hypocotyl-derived callus of Glyptostrobus pensilis, a critically endangered plant[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2023, 152(1): 139-149.
[14]	张瑞萍, 刘桂丰, 姜静, 等. 白桦成熟合子胚快速不定芽诱导体系的建立[J]. 植物生理学通讯, 2009, 45(4):385-388.
[15]	HAN R, GU C R, LI R H, et al. Characterization and T-DNA insertion sites identification of a multiple-branches mutant br in Betula platyphylla × Betula pendula[J]. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 491.
[16]	LIU C Y, XU H W, HAN R, et al. Overexpression of BpCUC2 influences leaf shape and internode development in Betula pendula[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(19): 4722.
[17]	ZHANG W H, YANG G Y, MU D, et al. An ethylene-responsive factor BpERF11 negatively modulates salt and osmotic tolerance in Betula platyphylla[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 23085.
[18]	HU X Q, TIAN J, XIN Q Q, et al. Cloning and functional characterization of a novel BpSEP4 gene from Betula platyphylla Suk[J]. Tree Genetics & Genomes, 2020, 16(1): 13.
[19]	ZHANG X, GUO Q, QIN L L, et al. A Cys2His2 zinc finger transcription factor BpSZA1 positively modulates salt stress in Betula platyphylla[J]. Frontiers in Plant Science., 2022, 13: 823547.
[20]	周春娜, 郑辉, 宋立功, 等. 外植体及培养基对欧洲白桦器官再生的影响[J]. 河北林果研究, 2006, 21(1):1-4.
[21]	杨达, 张兵, 周旭, 等. 白桦体细胞胚发生及植株再生研究进展[J]. 温带林业研究, 2021, 4(1):8-13.
[22]	詹亚光, 杨传平. 白桦愈伤组织的高效诱导和不定芽分化[J]. 植物生理学通讯, 2002, 38(2):111-114.
[23]	丁莉萍, 王宏芝, 魏建华. 杨树转基因进展及展望[J]. 林业科学研究, 2016, 29(1):124-132.
[24]	PANG J H, XIONG Y P, ZENG Y J, et al. Shoot organogenesis and plant regeneration from leaf and petiole explants of Corydalis saxicola Bunting[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 2023, 59(1): 121-128.
[25]	WANG X P, LUO P, QIU Z F, et al. Adventitious bud regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Eucalyptus urophylla × E. tereticornis interspecific hybrid[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology, 2022, 58(3): 416-426.
[26]	ZHANG B, ZHAO X M, ZHANG L Y, et al. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Tripterygium wilfordii and its application to enhance the accumulation of triptolide[J]. Industrial Crops & Products, 2022, 187: 115506.
[27]	郑志新, 张小红, 李艳丽, 等. 八棱海棠茎段的组织培养[J]. 西部林业科学, 2015, 44(6):38-41.
[28]	王贵章, 徐凌飞, 马锋旺, 等. 富士苹果黄化茎段再生不定芽的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2006, 34(6):79-81.
[29]	师校欣, 杜国强, 高仪, 等. 黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影响[J]. 河北农业大学学报, 2004, 27(4):18-21.
[30]	肖小君, 罗潼, 王芳. 木本植物组织培养过程中褐变现象及控制措施的研究进展[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(16):20-24.
[31]	王春雪. “红太后”草莓组织培养几个关键技术的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2014.
[32]	张郎郎, 张洁, 吕虹霖, 等. 欧洲李叶片再生体系的建立[J]. 果树学报, 2022, 39(10):1945-1953.
[33]	LIU Q, YANG Y J, LIU J L, et al. Establishment of regeneration system of pyrus and the genetic stability analysis of regenerated population[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2023, 152(1): 215-228.
[34]	蒋淑磊, 白霄霞, 李国松, 等. 照山白杜鹃愈伤组织诱导及植株再生技术[J]. 分子植物育种, 2022, 20(5):1629-1634.
[35]	XIONG Y P, CHEN S Y, WU T, et al. Shoot organogenesis and somatic embryogenesis from leaf and petiole explants of endangered Euryodendron excelsum[J]. Scientific Reports, 2022, 12: 20506.
[36]	魏会琴, 刘忠华, 马岚, 等. 杂交构树叶片愈伤诱导及植株再生[J]. 北京林业大学学报, 2010, 32(5):116-120.
[37]	徐晓峰, 黄学林. TDZ: 一种有效的植物生长调节剂[J]. 植物学通报, 2003, 20(2):227-237.

基本培养基 Basic medium	愈伤诱导率 Callus induction rate/%	不定芽数/(×10⁻¹个·节⁻¹) Adventitious shoot number	分化率 Adventitious shoot induction rate/%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient
MS	93.3 ± 3.3	1.3 ± 0.7 ^d	6.7 ± 3.3 ^d	1.3 ± 0.7 ^c	0.1 ± 0.1 ^d
1/2MS	96.7 ± 3.3	7.3 ± 1.2 ^c	26.7 ± 3.3 ^c	2.7 ± 0.2 ^b	0.7 ± 0.1 ^c
WPM	100	15.7 ± 0.9 ^b	53.3 ± 3.3 ^b	2.9 ± 0.1 ^b	1.6 ± 0.1 ^b
WPB5	100	47.7 ± 1.3 ^a	83.3 ± 3.3 ^a	5.7 ± 0.2 ^a	4.8 ± 0.1 ^a
注：不同小写字母表示不同基本培养基处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various basic medium treatments at the level of 0.05

外源激素 Exogenous hormones	激素浓度 concentration/ mg·L⁻¹	愈伤诱导率 Callus induction rate/%	不定芽数/(×10⁻¹个·节⁻¹) Adventitious shoot number	分化率 Adventitious shoot induction rate/%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient
	0.1	96.7 ± 3.3	8.7 ± 0.9 ^d	36.7 ± 3.3 ^c	2.4 ± 0.1 ^c	0.9 ± 0.1 ^d
TDZ	0.5	100	23.3 ± 1.5 ^c	50.0 ± 0.0 ^b	4.7 ± 0.3 ^b	2.3 ± 0.2 ^c
	1	100	49.0 ± 0.6 ^a	83.3 ± 3.3 ^a	5.9 ± 0.2 ^a	4.9 ± 0.1 ^a
	2	100	37.0 ± 2.1 ^b	60.0 ± 5.8 ^b	6.3 ± 0.6 ^a	3.7 ± 0.2 ^b
	0	93.3 ± 3.3	3.0 ± 0.6 ^d	13.3 ± 3.3 ^d	2.3 ± 0.3 ^d	0.3 ± 0.1 ^d
	0.05	100	14.0 ± 1.0 ^c	33.3 ± 3.3 ^c	4.3 ± 0.4 ^c	1.4 ± 0.1 ^c
NAA	0.1	100	46.0 ± 3.5 ^a	70.0 ± 5.8 ^b	6.6 ± 0.3 ^a	4.6 ± 0.4 ^a
	0.2	100	48.3 ± 1.2 ^a	86.7 ± 3.3 ^a	5.6 ± 0.1 ^ab	4.8 ± 0.1 ^a
	0.5	100	29.0 ± 3.5 ^b	60.0 ± 0.1 ^b	4.8 ± 0.6 ^bc	2.9 ± 0.4 ^b
注：不同小写字母表示外源激素TDZ或NAA不同浓度处理处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various concentration treatments of exogenous hormone TDZ or NAA at the level of 0.05

暗培养时间 Dark culture time/d	愈伤诱导率 Callus induction rate/%	不定芽数/(×10⁻¹个·节⁻¹) Adventitious shoot number	分化率 Adventitious shoot induction rate/%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient
10	96.7 ± 3.3	10.7 ± 1.2 ^b	33.3 ± 3.3 ^b	3.2 ± 0.1 ^b	1.1 ± 0.1 ^b
15	100	49.3 ± 0.3 ^a	86.7 ± 3.3 ^a	5.7 ± 0.2 ^a	4.9 ± 0.0 ^a
20	100	46.0 ± 3.8 ^a	80.0 ± 5.8 ^a	5.7 ± 0.1 ^a	4.6 ± 0.4 ^a
注：不同小写字母表示暗培养时间处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various treatments of dark culture times at the level of 0.05

因素 Factor	响应外植体数 Response number of explants	不定芽数/(×10⁻¹个·节⁻¹) Adventitious shoot number	分化率 Adventitious shoot induction rate/%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient
6-BA	1.45^ns	3.41^ns	1.45^ns	0.0009^ns	3.41^ns
GA₃	17.82^**	27.36^**	17.82^**	1.39^ns	27.36^**
NAA	9.09^**	17.25^**	9.09^**	0.28^ns	17.25^**
6-BA × GA₃	1.45^ns	0.02^ns	1.45^ns	3.69^ns	0.02^ns
6-BA × NAA	0^ns	0.09^ns	0^ns	0.16^ns	0.09^ns
GA₃ × NAA	0.36^ns	0.85^ns	0.36^ns	4.08^ns	0.85^ns
6-BA × GA₃ × NAA	1.45^ns	2.86^ns	1.45^ns	0.01^ns	2.86^ns
注：，差异（或互作）极显著（P < 0.01）；ns，差异（或互作）不显著（P ≥ 0.05）　　Notes: , difference (or interaction) is significant at the level of 0.01; and ns, not significant at the level of 0.05

处理号 Treatments	不定芽数/(×10⁻¹个·节⁻¹) Adventitious shoot number	分化率 Adventitious shoot induction rate /%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient
Ⅰ	40.7 ± 2.6 ^de	70.0 ± 5.8 ^bcd	5.8 ± 0.1 ^ab	4.1 ± 0.3 ^e
Ⅱ	38.7 ± 1.2 ^e	63.3 ± 3.3 ^d	6.1 ± 0.1 ^a	3.9 ± 0.1 ^de
Ⅲ	49.3 ± 1.5 ^a	86.7 ± 3.3 ^a	5.7 ± 0.1 ^ab	4.9 ± 0.2 ^a
Ⅳ	41.7 ± 1.8 ^cde	76.7 ± 3.3 ^abc	5.4 ± 0.2 ^b	4.2 ± 0.2 ^cde
Ⅴ	44.3 ± 1.2A ^bcd	80.0 ± 0.1 ^ab	5.5 ± 0.2 ^ab	4.4 ± 0.1 ^bcd
Ⅵ	39.3 ± 1.5 ^e	66.7 ± 3.3 ^cd	5.9 ± 0.2 ^ab	3.9 ± 0.2 ^e
Ⅶ	49.0 ± 1.2 ^ab	83.3 ± 3.3 ^a	5.9 ± 0.1 ^ab	4.9 ± 0.1 ^a
Ⅷ	45.7 ± 0.7 ^abc	80.0 ± 5.8 ^Cab	5.8 ± 0.4 ^ab	4.6 ± 0.1 ^abc
注：不同小写字母表示激素组合处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various hormone combination treatments at the level of 0.05

Establishment of Plant Regeneration System from Internodes of Betula alnoides

Abstract

References

Proportional views

通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

Proportional views

Establishment of Plant Regeneration System from Internodes of Betula alnoides

Corresponding author: GUO Jun-jie, guojunjiech@126.com;

HTML

1.1. 试验材料及条件

1.2. 研究方法

1.2.1. 茎段再生阶段培养基的筛选

1.2.2. 预培养条件的优化

1.3. 数据分析

2.1. 愈伤组织诱导阶段各因素对后续不定芽诱导和增殖的影响

2.1.1. 基本培养基

2.1.2. 外源激素

2.1.3. 暗培养时间

2.2. 愈伤组织分化阶段不同激素组合对不定芽诱导和增殖的影响

2.3. 不定芽生根诱导

2.4. 不同预培养条件对茎段待取苗生长和茎段再生的影响

Catalog

处理号 Treatments	基部愈伤组织 Basal callus	生根起始时间 Initial rooting/d	12 d		30 d
处理号 Treatments	基部愈伤组织 Basal callus	生根起始时间 Initial rooting/d	生根率 Rooting rate/%	平均生根数 Mean root number	生根率 Rooting rate/%	平均生根数 Mean root number	平均根长 Mean root length/cm
Ⅰ	较多 Much	25	/	/	22.2 ± 2.8 ^b	3.9 ± 0.1 ^d	3.4 ± 0.2 ^d
Ⅱ	全部覆盖 Fully covered	\	/	/	/	/
Ⅲ	无 No	9	44.4 ± 5.6 ^ab	3.6 ± 0.1 ^c	97.2 ± 2.8 ^a	10.7 ± 0.1 ^a	4.3 ± 0.1 ^b
Ⅳ	无 No	9	38.9 ± 2.8 ^bc	2.4 ± 0.1 ^d	94.4 ± 2.8 ^a	10.3 ± 0.1 ^a	4.9 ± 0.1 ^a
Ⅴ	较多 Much	20	/	/	25.0 ± 4.8 ^b	4.4 ± 0.1 ^c	3.9 ± 0.1 ^c
Ⅵ	全部覆盖 Fully covered	\	/	/	/	/
Ⅶ	无 No	5	52.9 ± 2.8 ^a	6.7 ± 0.1 ^a	100.0 ± 0.0 ^a	9.8 ± 0.2 ^b	4.9 ± 0.1 ^a
Ⅷ	无 No	9	33.3 ± 4.8 ^c	4.0 ± 0.2 ^b	97.2 ± 2.8 ^a	10.3 ± 0.0 ^a	4.8 ± 0.1 ^a
注：不同小写字母表示基本培养基处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various basic medium treatments at the level of 0.05

处理号 Treatments	株高 Height/cm	平均节间长度 Mean internode length/cm	每株可取平均茎段数 Mean number of stem segments per plantlet	分化率 Adventitious shoot induction rate /%	净增殖系数 Net proliferation coefficient	总增殖系数 Total proliferation coefficient	每株平均再生芽数 Mean number of regenerated buds per plantlet
Ⅰ	4.6 ± 0.2^e	1.9 ± 0.0^g	6.3 ± 0.2^e	86.1 ± 1.4	5.7 ± 0.1^c	4.9 ± 0.1^cde	31.0 ± 0.9^f
Ⅱ	6.3 ± 0.1^bc	2.9 ± 0.0^e	9.5 ± 0.2^c	87.5 ± 2.4	6.0 ± 0.0^b	5.3 ± 0.2^abc	50.5 ± 1.3^c
Ⅲ	8.2 ± 0.1^a	3.6 ± 0.0^b	12.1 ± 0.2^a	90.3 ± 1.4	4.9 ± 0.1^e	4.4 ± 0.1^f	53.1 ± 1.1^b
Ⅳ	5.2 ± 0.1^d	2.1 ± 0.0^f	7.0 ± 0.1^d	87.5 ± 2.4	5.8 ± 0.1^c	5.0 ± 0.1^bcd	35.0 ± 0.7^e
Ⅴ	6.3 ± 0.1^bc	3.0 ± 0.0^cd	10.3 ± 0.2^b	90.3 ± 1.4	5.1 ± 0.0^d	4.6 ± 0.1^def	47.2 ± 0.8^d
Ⅵ	8.4 ± 0.1^a	3.8 ± 0.0^a	12.4 ± 0.2^a	94.4 ± 3.7	4.8 ± 0.0^e	4.5 ± 0.2^ef	55.8 ± 1.0^a
Ⅶ	6.6 ± 0.1^b	3.1 ± 0.0^c	10.3 ± 0.2^b	88.9 ± 1.4	6.2 ± 0.0^a	5.5 ± 0.1^a	56.8 ± 0.9^a
Ⅷ	6.1 ± 0.0^c	3.0 ± 0.0^de	9.9 ± 0.1^bc	87.5 ± 4.8	6.3 ± 0.0^a	5.5 ± 0.3^ab	54.6 ± 0.4^ab
注：不同小写字母表示培养条件处理间差异显著（P<0.05）　　Note: Different lowercase letters represent significant difference between various culture condition treatments at the level of 0.05

Establishment of Plant Regeneration System from Internodes of Betula alnoides

Abstract

References

Proportional views

通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

Proportional views

Establishment of Plant Regeneration System from Internodes of Betula alnoides

Corresponding author: GUO Jun-jie, guojunjiech@126.com;

HTML

1.1. 试验材料及条件

1.2. 研究方法

1.2.1. 茎段再生阶段培养基的筛选

1.2.2. 预培养条件的优化

1.3. 数据分析

2.1. 愈伤组织诱导阶段各因素对后续不定芽诱导和增殖的影响

2.1.1. 基本培养基

2.1.2. 外源激素

2.1.3. 暗培养时间

2.2. 愈伤组织分化阶段不同激素组合对不定芽诱导和增殖的影响

2.3. 不定芽生根诱导

2.4. 不同预培养条件对茎段待取苗生长和茎段再生的影响

Catalog

Export File

Citation

Format

Content