Construction of Core Collection and DNA Fingerprinting of Chinese fir Germplasms from Jiangxi based on SSR Markers

试验材料来自江西省安福县陈山林场和信丰县林木良种场国家级杉木良种基地种质资源库，包括江西地方特色杉木优良种源-安福陈山红心杉优树种质群体(安福群体，AF)、赣南地区杉木优树种质群体(赣州群体，GZ)和江西本省其他地区杉木优树种质群体(其他群体，QT)。其中安福陈山红心杉种质群体165份，其主要来自罗霄山脉陈山林区；赣南地区杉木优树种质群体224份，其主要来自江西南部赣州全南、龙南、信丰等地；江西本省其他地区杉木优树种质群体106份，其主要来自江西铜鼓、吉安、上饶、景德镇等地。参试495份材料均为优树无性系材料。

2021年4月，采集健康且无病虫害的新叶，冰袋保存带回实验室放置−80 ℃低温冰箱保存备用。

采用改良CTAB法提取杉木新叶DNA，在完成质量及浓度检测后，定量至约30.0 ng·µL⁻¹，−20 ℃保存备用。

基于文献检索及课题组前期的杉木SSR引物开发，最终筛选了20对SSR引物用于后续分析 ^[19]。SSR引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，在每对引物的正向引物5′端进行M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)修饰，然后合成3′端具有荧光的M13接头(FAM、HEX)，通过序列互补进行标记。SSR-PCR体系(20.0 μL)：DNA模板2.0 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，2 × Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH₂O 7.0 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 7 min。荧光引物扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行分析。

运用PopGene 32软件开展遗传多样性分析，主要参数包括等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon’s信息指数(I)等，利用PIC-Calc软件计算SSR标记的多态信息含量(PIC)。通过Ntsys软件采用UPGMA进行聚类分析，构建树状图。

利用Core finder软件^[21]，以等位基因数最大化(M策略)为原则对SSR数据进行分析，从供试江西杉木材料中抽取核心种质。核心种质构建完成后，对构建的核心种质的相关遗传参数进行ｔ检验来评价核心种质的代表性。同时通过主坐标分析(PCoA)对构建的核心种质进行确认。

依据SSR标记PIC值的高低，依次增加标记数量进行核心种质的UPGMA聚类分析，筛选能实现所有核心种质有效区分所需的最少SSR标记组合，以这组SSR标记作为高效标记组，用于后续核心种质SSR分子指纹图谱和分子身份证的构建。将高效SSR标记组在核心种质中检测到等位基因，按小到大的顺序排序，然后用数字1～9进行编码，若等位基因数大于9时，则用A～Z编码，缺失位点用0表示，构建每个核心种质的SSR分子指纹图谱。将种质信息和SSR分子指纹图谱相结合，分别利用条码生成器和二维码生成器构建江西杉木核心种质的分子身份证。

利用SSR标记对江西杉木种质进行分析以探究其遗传多样性，结果发现(表1)：20个SSR标记在495份江西杉木种质中共检测到等位基因数(N_a)122个，平均为6.1个位点，其中CLSSR33标记最少，仅有2个，CLSSR9标记最多，达15个。所选择的20个标记中，获得等位基因数(N_a)在5个以上的标记有16个，表明本研究选择的SSR标记位点多态性较好，可用于江西杉木种质的遗传多样性分析。此外，20个标记位点的有效等位基因数(N_e)变化范围在1.014～3.405之间，平均值为1.836；Shannon’s信息指数(I)变化范围为0.045～1.428，平均值为0.762；Nei’s遗传多样性指数(H)变化范围在0.014～0.706之间，平均值为0.400；观测杂合度(H_o)和期望杂合度(H_e)均值分别为0.394和0.400，H_o < H_e；位点多态性信息含量(PIC)的变化范围为0.014～0.657，平均值为0.357，其中低度多态性位点6个(PIC≤0.25)；中度多态性位点11个(0.25<PIC < 0.5)；高度多态性位点3个(PIC≥0.5)。以上结果表明495份江西杉木种质的遗传多样性较丰富。

利用Core Finder软件，采用M策略进行抽样构建核心种质，结果表明当抽取种质数量为52份时，等位基因保留比例接近100%。因此，基于SSR基因型数据从495份江西杉木种质中抽取52份核心种质，抽样比例为10.5%，其中安福陈山红心杉种质10份，赣南地区种质20份，江西其他地区的种质22份。

通过遗传多样性参数分析对构建的江西杉木52份核心种质的代表性进行评价，结果表明(表2)，与原种质比较，核心种质的等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(H)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和多态信息含量(PIC)的保留比例依次为100.0%、107.4%、115.1%、109.0%、104.1%、110.0%和111.2%，且t检验显示核心种质与原种质间各遗传多样性参数差异不显著，说明构建的核心种质很好的保留了原种质的遗传多样性，因此初步认为52份核心种质能够代表495份原种质。PCoA对核心种质作进一步确认，结果显示，江西杉木52份核心种质较为均匀地分布在495份原种质中(图1)，说明构建的核心种质具有较好的代表性。

Figure 1.  The principal coordinates analysis of core collection of C. lanceolata germplasms from Jiangxi

基于聚类分析52份核心种质可分为6大类。其中，核心种质QT065、QT099和GZ012均单独形成一类；核心种质GZ051和GZ209则形成一类，QT059和QT063组成一类；其余45份核心种质则形成一大类。

由于杉木为二倍体，每个SSR位点应由2个相同或不同的等位基因组成。SSR标记的等位基因数、基因型越多，PIC值越高，能区分种质的能力也越强，在绘制指纹图谱中价值也越高。基于最少标记区分最多种质的原则，依据SSR标记的PIC值的高低，依次增加标记数量对核心种质进行区分，结合UPGMA聚类，结果发现H97标记与H286、CLSSR9和CLSSR37相结合，就可将52份江西杉木核心种质完全鉴别区分(图2)。

Figure 2.  The identification of core collection of the C. lanceolata germplasms from Jiangxi by UPGMA

通过H97、H286、CLSSR9和CLSSR37这4个高效SSR标记在52份核心种质中检测到的等位基因，构建每份核心种质的SSR分子指纹图谱(图3)。将获得SSR分子指纹图谱数据与种质信息编码一同构建核心种质特异的分子身份证码。参考王华缄等^[20]，种质信息编码共有6位数字组成，分为3个部分，第1～3位表示种质原产地信息，如001为江西省安福县；第4位是种质资源类别，1表示一代优树，2表示二代优树、3表示三代优树等；第5～6位表示收集、保存时间，如79表示1979年。若上述信息未知或不清楚则用X表示。以AF047为例（图4），其分子身份证号码为00110668444B34，表示该种质原产地江西省安福县，收集、保存的为1代优树，时间为2006年，4个核心标记（H97、H286、CLSSR9和CLSSR37）的指纹图谱依次为68/44/4B/34。最后利用每份种质的14位分子身份证编号，分别制作条形码和二维码（图4）。

Figure 3.  The DNA fingerprint of the core collection of the C. lanceolata germplasms from Jiangxi

Figure 4.  The DNA molecular IDs of some core collection of the C. lanceolata germplasms from Jiangxi

进行遗传多样性评价是开展种质资源评价工作的重要组成部分。开展杉木种质资源的遗传多样性研究对收集、保存、评价和利用杉木种质材料的意义重大。江西是我国杉木的主要的分布和中心产区之一，栽培历史悠久，在长期的自然选择和人工选择作用下形成一些颇具特色的优良种质资源，如安福“陈山红心杉”、武宁“瓜源木”、遂川“龙泉木”、全南“黄田江杉木”等^[22]，使得江西拥有丰富的杉木种质资源。本研究采用20个SSR标记在495份江西杉木种质中共检测到122个等位基因(N_a)，平均Shannon’s信息指数(I)、平均Nei’s遗传多样性指数(H)、平均观测杂合度(H_o)和平均期望杂合度(H_e)分别为0.762、0.400、0.394和0.400，与其他采用相同技术进行的杉木相关研究结果比较^{[4, 13, 23-24]}，江西杉木种质资源具有较丰富的遗传多样性。

在林木育种中，核心种质在亲本选择、杂交育种、种质保存和利用等方面发挥着重要作用。核心种质是通过从整个种质资源中选择出少量且具有代表性的种质材料，可以最大程度的代表原种质的遗传多样性水平。因此，在构建核心种质中应优先考虑选择稀有位点，最大限度保留原种质的等位基因多样性^{[4, 25]}。M策略基于等位基因的最大化，同时兼顾遗传多样性，是目前最具优势的一种方法。通过Core Finder软件以M策略构建核心种质已在杜仲、杉木、木荷等林木上成功应用^{[2, 4, 16]}。因此，本研究选择基于M策略利用Core Finder软件构建江西杉木种质资源的核心种质，结果从495份江西杉木原种质中得到52份核心种质，同时通过t检验和PCoA分析，显示获得的核心种质具有更丰富的遗传多样性，且均匀分布于原种质资源中，表明构建的核心种质可靠有效，具有代表性。

核心种质构建的宗旨是以最小的资源数量和遗传重复包含原种质中最大的遗传多样性。因此，确定合理取样比例是关键^[9]。目前研究表明林木种质资源的核心种质取样比例一般在10%～30%之间。方乐成等^[26]分析了192份楸树(Catalpa bungei C.)种质的遗传多样性，获得了46份核心种质，抽样比例23.96%；刘松等^[15]利用SSR标记建立了占原种质24.85%的中国板栗核心种质；杨汉波等^[16]基于SSR标记从754份木荷种质资源中获得了115份核心种质，占原种质的15.3%；李洪果等^[2]则从887份杜仲种质中得到189份核心种质和698份保留种质，核心种质占原种质的21.3%。在本研究中，根据SSR标记分析结果，基于M策略从495份原种质中抽取了52份核心种质，经过遗传多样性评价和显著性t检验，确定江西杉木核心种质合适的取样比例为10.5%。这个比例与已报道的同样基于SSR标记获得的广西杉木核心种质占比9.3%接近^[4]；低于Duan等^[13]从南方6个省份700份杉木基础群体中构建300份核心种质的比例，也低于在SNP标记基础上获得杉木核心育种群体占比(64.7%)以及速生优质杉木核心种质占比(50%)^[27-28]。本研究的杉木种质均来源江西省，李魁鹏等^[4]杉木种质则主要来源广西境内，两者的遗传结构较Duan等^[13]700份杉木材料来源南方6省市相对简单。这符合核心种质的取样比例应根据原种质资源的遗传结构和数量规模来决定^[29]。江西杉木52份核心种质中安福陈山红心杉种质10份(6.1%)、赣南地区种质20份(8.9%)、江西其他地区的种质22份(20.8%)，安福陈山红心杉种质资源较多，但抽取的核心种质反而较少，这可能与陈山红心杉种质资源遗传多样性水平偏低有关^[19]。

本研究中，52份核心种质的等位基因数(N_a)的保留比例为100%，而有效等位基因数(N_e)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(H)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和多态信息含量(PIC) 6个参数的保留比例大于100%，这主要是由群体中的样本量和等位基因频率改变引起。这些遗传参数都是根据等位基因频率按不同的方法估算获得，用于度量不同群体在多样性上的遗传冗余情况，而核心种质的构建是一个减少频率高等位基因、增加稀有等位基因比例的过程，在去除遗传冗余的过程中，各等位基因频率的不规律增减会导致相应遗传多样性参数保留比例大于100%，这一现象在杜仲^[2]、毛白杨^[10]、木荷^[16]和新疆野杏(Armeniaca vulgaris Lam.) ^[25]等的核心种质构建中均存在。

随着DNA分子指纹图谱的快速发展，SSR等分子标记的检测结果可进一步转化为字符串、条形码或二维码，即DNA分子身份证^[30]。种质鉴定是种质资源收集、评价、保存和利用的基石，DNA分子身份证是种质鉴定的重要工具，目前已被广泛应用在作物、菌类、果树、花卉等种质鉴定^[30-32]，近年来，这一技术也逐步应用于林木种质资源的鉴定^[33]。胡春龙等^[34]构建了46份白蜡(Fraxinus sp.)种质资源的分子身份证，为白蜡新品种的审定、DUS测试等奠定了理论基础。张成才等^[35]对36个薄壳山核桃(Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch)国外引种品种建立分子身份证，为区分和鉴别薄壳山核桃品种提供参考。本研究在运用SSR标记分析江西杉木遗传多样性的基础上，构建了其核心种质的DNA指纹图谱，绘制了相应的分子身份证。不同于已报道的杉木分子身份证，本研究构建的分子身份证不仅包含了杉木种质的DNA指纹图谱信息，同时借鉴作物、果树等种质的分子身份证构建方法，设定了包含种质原产地、种质资源类别、收集保存时间的补充码，进一步增加所绘制的种质分子身份证的可靠性和特异性。

本研究利用前期筛选的20个杉木SSR标记，分析了495份江西杉木种质的遗传多样性，并利用M策略构建了含有52份材料的江西杉木核心种质，核心种质保留了原种质10.5%，等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、Shannon’s信息指数(I)、Nei’s遗传多样性指数(H)的保留比例依次为100.0%、107.4%、115.1%、109.0%，表明本研究建立的核心种质是有效的。同时根据标记的多态性信息含量(PIC)和鉴别能力，确定了H97、H286、CLSSR9和CLSSR37等4个标记能够实现52份核心种质的有效区分，并构建了52份核心种质的分子指纹图谱和分子身份证，为杉木种质资源的收集、保存和利用提供了理论基础。