Evaluation of the Physiological Response and Heat Tolerance of Seedlings of Different Camellia oleifera Cultivars to High Temperature Stress

试验区域位于广东省广州市天河区华南农业大学教学试验基地（113°21′26″ E, 23°9′26″ N），属亚热带季风气候，温暖多雨、阳光充足、全年水热同期，年平均气温23.1 ℃，最高温39.1 ℃，最低温-0.9 ℃，最冷月为1月，平均气温13.3 ℃，最热月为8月，平均气温28.8 ℃。年降水量1 800 mm，4—9月的降水量占全年降水量的80%，尤以5—8月最高，占全年降水量的62%，该区域年平均湿度为79%。

选择我国各省（区）现行主推15个油茶品种（表1），以各品种3 a生嫁接苗为试验材料。

于2022年7月17日至7月31日开展为期15 d的控制温度处理。试验采用双因素完全随机区组设计，试验设计分别设置两种温度处理，即高温胁迫组（HT）和对照组（CK），每个油茶品种设置5次生物学重复，每个品种各5株，分开摆放，共150株。试验期间高温胁迫处理的实测温度范围是41.0～45.0 ℃，均值为43.4 ℃，对照组温度范围33.3～36.2 ℃，均值为34.7 ℃。具体技术措施是高温胁迫组将参试油茶幼苗分别放置于温室大棚进行覆膜增温处理，通过温湿度记录仪（RC-4HC）实时监测温度，连续处理15 d；对照组不进行覆膜增温处理。除温度控制外，其他按常规苗圃管理。

试验的第16 d上午8:00～9:00对叶片样品进行采集，每个品种选取5株，每个植株采集中上部完整健康的叶片10枚，各指标进行5次重复测定。

（1）叶片相对含水量及干物质含量：将选定的叶片放入密封容器中，然后测定叶面积叶鲜质量(FW)/g；将新鲜叶子放入4 ℃纯净水中浸泡48 h后测量水分饱和状态时的叶片质量(TW)/g；将叶片放入烘箱70 ℃干燥至恒质量测定叶干质量(DW)/g，计算叶片相对含水量（RWC）/%以及叶片干物质含量(DMC)/(g·g⁻¹)：

（2）光合色素含量测定：采用乙醇浸提法^[19]，取洁净新鲜油茶叶片，去除中脉，剪碎成条状，称取0.1 g。将称取的叶片放置于15 mL离心管中，加入10 mL95%的乙醇，混匀，避光处理，浸泡至叶片发白，色素完全被萃取到溶液中。利用紫外分光光度计（UV-2600, 上海恒平）测定提取的溶液在649 nm、665 nm、470 nm下的OD值，并计算叶绿素a含量（Chla）/(mg·g⁻¹)、叶绿素b含量（Chlb）/(mg·g⁻¹)、叶绿素总含量（Chl）/(mg·g⁻¹)、类胡萝卜素含量（Car）/(mg·g⁻¹)：

（3）植物渗透调节物质及抗氧化酶活性测定：采集油茶枝稍3～5片1年生正常功能叶，洗净表明浮土和灰尘，擦干后迅速放入液氮罐带回实验室至−80 ℃超低温冰箱保存。测定渗透调节物质及抗氧化酶活性所用试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司（中国，苏州），采用微量法测定，每组处理设3个重复。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量采用蒽酮硫酸法；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光还原法；过氧化物歧化酶（POD）活性采用愈创木酚法；过氧化氢酶（CAT）活性采用碘量滴定法^[20]。

试验数据采用Microsoft Excel 2021进行统计与分析，使用SPSS 26.0软件进行Pearson相关性分析、差异显著性分析（同一品种不同温度处理间采用T检验（p＜0.05），同一温度不同品种间采用Duncan法（p＜0.05））、主成分分析、隶属函数分析；使用Origin 2018绘制柱状图。

（1）耐热系数。首先将原始数据以相对指标为单位进行无量纲标准化处理，求得各项生理指标的耐热系数，使用耐热系数进行主成分分析，耐热系数（heat tolerance coefficient, HTC）=高温胁迫性状值/对照性状值。

（2）隶属函数分析。隶属函数值的计算方法参照于朱亚迪等^[17]的方法。隶属函数值采用以下公式计算：

式中U（X_j）为各油茶品种第j个主成分的隶属函数值，X_j为某综合指标，j=1,2,3,…,n；X_min和X_max分别表示所有品种中第j个综合指标的最小值和最大值。

（3）指标权重。权重的计算方法参照于凌瑞等^[21]，采用以下公式计算：

式中W_j表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度（权重），Pj为某综合指标的贡献率。

（4）综合评价。采用主成分分析和隶属函数分析相结合的方法计算高温胁迫下耐热综合评价值（D值）评价油茶耐热性，D值越大，表明品种指标评价的综合得分越高，D值采用以下公式进行计算：

高温胁迫引起油茶叶片中相对含水量和干物质含量降低，不同油茶品种降低的程度不同（图1）。相对含水量多重比较结果表明：对照组（CK）内各品种间叶片相对含水量均无显著差异（p＞0.05），高温胁迫处理（HT）后品种间，赣州油1号的相对含水量除与赣州油7号无显著差异以外，而与其他各品种之间均存在显著差异（p＜0.05），较CK下降了23.13%；赣州油7号分别与15个品种中的7个品种(注：岑软2号、长4号、长林53号、华金、华鑫、赣无2和粤韶77-1)在相对含水量上有显著差异（p＜0.05）（图1）；粤韶75-2分别与长林53号、华金、赣州油1号和粤韶77-1间也有显著差异（p＜0.05）。同一品种下，高温处理与其相应对照处理间存在显著差异的品种有6个，包括长林40号、湘林210、赣州油1号、赣州油7号、赣石83-4和粤韶75-2（p＜0.05）。同一品种下叶片干物质含量，华金、华硕、湘林210、赣州油7号和粤韶77-1的高温胁迫后与其相应CK相比均显著降低（p＜0.05），其中湘林210降低幅度最大，为15.79%，说明高温对该品种干物质积累和转运的影响较大，而其余9个品种在温度处理间无显著差异（p＞0.05），说明这9个品种相对耐高温胁迫；同时，高温胁迫组内或对照组内，叶片干物质含量在品种间均无显著差异（p＞0.05）。

Figure 1.  Effect of high temperature stress on the relative water content and dry matter content of different Camellia oleifera leaves

图2为15个油茶品种在CK和高温处理条件下叶片中光合色素含量的变化情况，不同品种在高温胁迫下叶片中光合色素含量均有不同程度的降低。同一品种下，除长林53号、华鑫、华硕和赣无2以外，其他11个品种叶片中叶绿素a含量较CK显著降低（p＜0.05），高温胁迫处理（HT）后品种间，赣石83-4的叶绿素a含量除与华金无显著差异外（p＞0.05），和其他品种均有显著差异（p＜0.05），较CK降低了33.58%，相较于其他品种为降幅最大，说明其叶绿素a含量受到高温影响较大；华金与除长林40号、赣石83-4和粤韶75-2外的11个品种之间存在显著差异（p＜0.05）。叶绿素b含量除华金、华鑫、华硕、湘林210和粤韶75-2外其他品种在高温胁迫处理和CK处理之间差异显著（p＜0.05），高温胁迫处理（HT）下，华硕的叶绿素b含量与长林4号无显著差异（p＞0.05），但与其余的13个品种差异显著（p＜0.05）。叶绿素总含量除长林53号和华硕外其他品种在高温胁迫处理和CK处理之间均存在显著差异（p＜0.05），高温胁迫下赣石83-4与华金无显著差异（ p ＞0.05），而与其他品种均有显著差异（p＜0.05）。高温胁迫降低了类胡萝卜素含量，在高温条件下，赣石83-4的类胡萝卜素含量与其他品种之间存在显著差异（p＜0.05），较CK相比降低了41.48%，而除赣石83-4外，长林40号与除华金外其他品种间也有显著差异(p＜0.05)。

Figure 2.  Effect of high temperature stress on photosynthetic pigment content of different Camellia oleifera leaves

在高温胁迫下不同油茶品种的MDA含量均增加（图3），高温胁迫处理与CK处理相比，除岑软2号、岑软3号、华鑫和粤韶77-1外，其他品种均显著增加（p＜0.05）。高温胁迫下，长林4号的MDA含量与其他各品种间存在显著差异（p＜0.05），与CK相比增加了89.33%，为增幅最大，说明在高温胁迫下其膜脂过氧化程度较高；赣无2与岑软2号、湘林210之间无显著差异（p＞0.05），但与其余品种存在显著差异（p＜0.05），增幅为38.13%。除岑软2号、岑软3号、华金、赣州油7号外，其余品种可溶性糖含量在高温胁迫组和CK组之间均有显著差异（p＜0.05），其中赣石83-4在高温处理后可溶性糖含量显著低于CK处理，降低幅度为20.16%；高温胁迫后华鑫的可溶性糖含量与除长林40号、湘林210号和赣州油1号外的11个品种之间有显著差异（p＜0.05），增幅为31.54%。高温胁迫下各油茶品种的可溶性蛋白含量与CK相比均显著升高（p＜0.05），不同品种间，赣无2与其他品种差异显著（p＜0.05），增幅为321.26%，表明赣无2可以通过调节可溶性蛋白含量来应对高温胁迫，此外，赣州油7号与除岑软3号、粤韶75-2和粤韶77-1外的11个品种也有显著差异（p＜0.05）。

Figure 3.  Effect of high temperature stress on the content of MDA and osmoregulatory substances in different Camellia oleifera leaves

由图4可知，高温胁迫下，不同油茶品种的SOD活性升高，多重比较的结果表明，除岑软2号和华鑫外，高温处理与CK处理均有显著差异（p＜0.05），在高温条件下，岑软3号、赣州油1号和赣州油7号的SOD活性与其他品种之间差异显著（p＜0.05）；此外，赣无2与除岑软2号、赣石83-4、粤韶75-2和粤韶77-1外的10个品种存在显著差异（p＜0.05）。高温胁迫下不同油茶品种的POD活性全都显著高于CK（p＜0.05），在高温条件下，长林4号、长林40号、长林53号、华金和华硕的POD活性显著高于其他10个品种的POD活性（p＜0.05），且这10个品种间POD活性均无显著差异（p＞0.05）。高温胁迫下不同油茶品种的CAT活性与CK相比均显著升高（p＜0.05），高温胁迫后粤韶75-2的CAT活性与其他品种差异显著（p＜0.05），增幅为249.90%；同时，高温胁迫后的CAT活性，岑软3号和粤韶77-1间无显著差异（p＞0.05），但这两个品种与其余品种间存在显著差异（p＜0.05）。

Figure 4.  Effect of high temperature stress on the antioxidant enzyme activities of different Camellia oleifera leaves

对高温胁迫下油茶各项生理指标的耐热系数进行相关性分析，结果如表2。由表2可知，干物质含量与叶绿素b含量存在显著负相关关系（p＜0.05），叶绿素a含量和叶绿素总含量之间存在极显著相关关系（p＜0.01），与叶绿素b含量和类胡萝卜素含量存在显著相关关系（p＜0.05）；叶绿素b含量与叶绿素总含量存在极显著相关关系（p＜0.01），与可溶性糖含量、SOD活性存在显著相关关系（p＜0.05）；叶绿素总含量与类胡萝卜素含量存在显著正相关关系，与SOD活性存在显著负相关关系（p＜0.05）；类胡萝卜素含量与SOD活性存在显著负相关关系（p＜0.05）。各指标间存在不同程度的相关性，由此可见，植物的耐旱性是一个复杂的综合性状，其耐热性还需要通过多个指标进行判断。

对叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量等9个生理指标的耐热系数进行主成分分析（表3），提取出4个主成分，累积贡献率为87.042%，具有较强的代表性。油茶耐热性评价主成分1中叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量、类胡萝卜素含量和SOD活性的载荷较大，可反映原始数据的43.918%；主成分2中可溶性蛋白含量的载荷最大，可反映原始数据的18.716%；决定主成分3的主要是CAT活性，可反映原始数据信息中的13.134%；决定主成分4的主要是可溶性糖含量，可反映出原始数据中的11.274%。

为进一步明确4个综合指标（主成分）对不同油茶品种的贡献度，根据公式（7）、（8）、（9）计算得到各品种在不同综合指标下的隶属函数值、权重和综合评价值（表4），并通过综合评价值（D值）来判断油茶耐热性的强弱。耐热性强弱顺序为华金＞赣州油1号＞华硕＞岑软2号＞湘林210＞赣无2＞长林53号＞粤韶75-2＞粤韶77-1＞长林4号＞岑软3号＞华鑫＞长林40号＞赣州油7号＞赣石83-4。由表4可知，华金的D值最大，为0.844，表明其在高温下具有较强的耐受性，而赣石83-4的D值最小，为0.174 ，说明其对高温胁迫较为敏感。

不同植物品种对高温胁迫的生理响应存在差异，也会通过多种生理生化过程来调节体内环境以适应高温条件，高温环境会对植物体内的多种代谢途径产生负面影响^[22-23]。植物叶片中相对含水量能够直接反映植物的保水能力，叶片干物质含量能够间接反映植物对高温环境的耐受性^[24]。本试验的研究结果表明，在不同油茶品种在受到高温胁迫后，叶片相对含水量和干物质含量呈现不同程度的降低，仅从相对含水量和干物质含量这两个指标来看，相对含水量岑软2号下降的幅度最低，说明其叶片在高温下具有较强的保水能力，耐热性相对更好，干物质含量长林40号下降幅度最低，说明高温对其干物质含量的积累造成了较大的影响。

叶绿素在植物感知光能中起重要的作用，研究证实在外界胁迫条件下叶绿素含量的变化情况能够反映植物的抗性^[25]。本研究中，在高温胁迫下15个油茶品种的叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量均呈下降趋势，这与前人对东方铁筷子（Helleborus orientalis）在高温胁迫下叶绿素含量的变化情况一致^[26]。在15个油茶品种中，华金和华硕叶绿素总含量下降最少，赣石83-4叶绿素总含量下降最多，表明华金和华硕的耐热性要强于赣石83-4，隶属函数分析的结果同样也证实了这一结论。

植物长时间处在高温条件下，会导致膜脂过氧化，丙二醛是膜脂过氧化的重要产物之一^[27]，在本研究中丙二醛含量升高的幅度因品种而异，华鑫、岑软2号和岑软3号丙二醛含量升高的幅度较低，长林4号、长林53、华金和赣州油7升高的幅度较大，丙二醛含量上升较大表明在高温胁迫下膜的受损程度越大^[28]。可溶性糖和可溶性蛋白可以有效的维持植物细胞受到外界环境干扰时的稳态，因此其会在植物受到胁迫时含量上升^[29]，但在本研究中赣石83-4的可溶性糖含量出现下降，这可能是因为在高温胁迫下与光合作用光反应有关酶活性的降低或者失活，导致光合产物的总量降低，进而造成可溶性糖含量下降的情况^[30]。抗氧化酶可以延缓膜脂的氧化过程，从而保护细胞内的成分免受损伤，因此，在植物受到外界胁迫时，抗氧化酶活性会提升，从而保护细胞免受活性氧（ROS）损伤^[31-32]，高温胁迫下不同油茶品种的SOD、POD和CAT活性均上升，这与韩一林等^[33]的研究结果相吻合，说明油茶在应对高温胁迫时主要是通过调节3种抗氧化酶的活性共同来应对高温胁迫。综上所述，认为华金、赣州油1号、华硕、岑软2号和湘林210耐热性较强的原因可能是：在高温环境下能够维持较高的叶绿素含量，以此来降低高温胁迫对叶片形态和光合作用的损伤，同时在高温胁迫下形成相应的保护机制，通过调节可溶性蛋白含量以及提高SOD、POD活性来保持膜的透性和稳定性^[34-35]。

此外，高温胁迫对植物的危害不仅表现在其生理上，还有外部形态，例如：高温胁迫下，阻碍植物生长^[36]，使植物严重萎蔫、干枯变黄^[37]，加速植物叶片衰老甚至死亡^[38]等。本研究引入了较为全面的生理指标来评价不同油茶品种的耐热性，结合主成分分析的结果，并将9个相关性较强的生理指标转换为4个全新且独立的综合指标，此方法已在多种农作物和树种上使用，较为科学合理。不过仅从油茶对高温胁迫的生理响应还不足以揭示其耐高温机制，还需要在分子的水平上进行更深层次的分析。

15个油茶品种应对高温胁迫的方式有所不同，采用主成分分析和隶属函数分析的结果表明：15个油茶品种的耐热性强弱排序为华金＞赣州油1号＞华硕＞岑软2号＞湘林210＞赣无2＞长林53号＞粤韶75-2＞粤韶77-1＞长林4号＞岑软3号＞华鑫＞长林40号＞赣州油7号＞赣石83-4，在夏季温度较高的地区，建议选用耐热性较强的华金、赣州油1号、华硕、岑软2号和湘林210进行引种栽培，同时可作为亲本来培育耐热新品种。