Comprehensive Evaluation and Index Screening of Salt Tolerance for Three Afforestation Specie Seedlings in China

参照甘红豪等^[13]的方法在中国林业科学研究院科研温室中培养一年生苦楝、白榆和刺槐扦插苗，选取生长健康且株高基本一致（约30 cm）的幼苗进行后续试验。试验共设置0、100、200和300 mmol·L⁻¹ NaCl处理浓度，每个树种每个NaCl浓度10株幼苗。参照甘红豪等^[14]的方法进行NaCl处理。

NaCl处理30 d后，使用Li 6400光合仪（LI-Cor, Lincoln, Nebraska, USA）测定苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片的净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、胞间CO₂ 浓度（C_i）和蒸腾速率（E）^[13-14]。同时，计算苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片WUE=P_n/E，式中WUE为水分瞬时利用效率；并计算L_s= 1−C_i/C_a，式中L_s为气孔限制值，C_a 为空气中 CO₂ 浓度，本试验中该值为 400 μmol·mol^{−1 [15]}。

然后，分别收获不同NaCl处理下苦楝、白榆和刺槐幼苗的根、茎、叶样品并记录鲜质量。所有材料在液氮中研成粉末，并保存在−80 °C冰箱中备用。称取各NaCl处理组刺槐、苦楝和白榆的根、茎、叶鲜样50 mg左右，在80 °C下烘干后，称其质量、计算干湿比，并以此计算样品干质量。

各NaCl处理苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片的相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定^[13]。幼苗叶片电解质渗透率（REL）采用电导率仪（DDSJ-308F，雷磁）进行测定^[16]。使用80%丙酮浸提幼苗叶片叶绿素，并利用分光光度计测定其含量^[17]。

分别使用 Tamás 等^[18]和Luo等^[19]提出的方法测定各NaCl处理下苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸以及可溶性蛋白含量。

各NaCl处理下苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性参照Polle等^[20]所建立的方法测定。

依据甘红豪等^[14]的方法测定各NaCl处理下苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶片中的Na⁺、K⁺、Ca²⁺ 和Mg²⁺ 含量，计算Na⁺/K⁺、Na⁺/Ca²⁺、Na⁺/Mg²⁺ 的比值。利用公式S_{x, Na}=(叶片X/Na⁺)/(根X/Na⁺)（X代表K⁺、Ca²⁺ 和Mg²⁺ 中的一种）计算离子选择运输系数S_{K, Na}、S_{Mg, Na} 和 S_{Ca, Na}，用以评价NaCl处理下从幼苗根向叶片运输离子的选择性，其值越大，代表离子向叶片运输的选择性吸收积累就越高^[14]。

使用Statgraphics Centurion XVI.I（STN, St, Louis, MO, USA）软件对正态分布检验后的数据进行分析。采用双因素方差分析研究树种（S）和盐分（T）对各变量的影响。当F检验的P-Value < 0.05时，认为数据间具有统计学差异。使用OriginPro 2021（OriginLab Inc.，Massachusetts，USA）进行相关性分析、主成分分析和图表绘制，并利用隶属函数法和主成分权重赋值法分析评价不同幼苗的耐盐能力差异，同时使用灰色关联分析筛选在苦楝、白榆和刺槐幼苗适应盐胁迫过程中起主要作用的变量指标。

白榆和刺槐幼苗根、茎、叶片生物量随着NaCl浓度的增加呈下降趋势；苦楝幼苗叶生物量在NaCl处理下没有发生显著变化，但根和茎生物量在200 mmol·L⁻¹ NaCl处理下达到最大值（表1）。与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使苦楝、白榆、刺槐幼苗根、茎和叶生物量出现不同程度降低，其中刺槐根和叶生物量降低幅度最大，为45.1%和52.2%；而白榆茎生物量下降最多，为24.8%。三者幼苗叶RWC在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下显著下降、REL显著升高，其中苦楝幼苗叶片RWC显著降低了28.0%，而刺槐幼苗叶片REL显著升高了125.3%，改变幅度最大。

与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，苦楝和白榆幼苗叶片的叶绿素（叶绿素a和叶绿素b）和类胡萝卜素含量在100和200 mmol·L⁻¹ NaCl处理下差异不显著，但刺槐幼苗叶片色素含量显著降低（表2）。在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，三种幼苗叶片的色素含量均显著降低，其中白榆幼苗叶片叶绿素b显著下降了59.4%，降幅最大；而刺槐幼苗叶片叶绿素a和类胡萝卜素含量减少了48.0%和51.0%，下降最多。

与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使苦楝幼苗叶片的P_n、G_s、C_i和E分别降低了52.7%、80.1%、38.9%和81.3%，使白榆幼苗叶片上述指标分别下降了71.1%、83.7%、33.8%和79.1%，使刺槐幼苗叶片上述指标分别下降了68.8%、76.9%、21.8%和80.0%；而三种幼苗叶片的WUE分别升高了165.0%、37.8%和56.1%，Ls分别升高了107.4%、70.6%和28.6%（表3）。

苦楝、白榆和刺槐根和叶中游离脯氨酸含量出现不同程度的增加（图1）。在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，苦楝、白榆和刺槐根中游离脯氨酸含量分别比0 mmol·L⁻¹ NaCl处理提高了2.4、11.0和4.3倍，叶中游离脯氨酸分别升高了65、10和16倍。三者幼苗根中可溶性蛋白质在NaCl胁迫下显著增加，与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使它们根中可溶性蛋白质含量分别升高了10.7、3.4和2.8倍；苦楝叶中可溶性蛋白质含量仅在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下显著降低；白榆叶中可溶性蛋白在受到盐胁迫后显著下降；而刺槐叶中可溶性蛋白在100 mmol·L⁻¹ NaCl处理下却显著增加。

Figure 1.  The effects of NaCl on free proline (a, b) and soluble protein (c, d) contents in roots and leaves of of M. azedarach, U. pumila and R. pseudoacacia

随着NaCl浓度增加，苦楝和白榆根和叶中CAT活性逐渐增强，与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，CAT活性在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理的苦楝和白榆刺槐根中分别增加了197.0%和408.0%，在叶中分别增加了411.4%和204.3%（图2）。刺槐根和叶中CAT活性在100 mmol·L⁻¹ NaCl处理下分别比0 mmol·L⁻¹ NaCl处理升高了43.2%和199.2%。在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，三者根和叶中APX活性分别比0 mmol·L⁻¹ NaCl处理提高了1.7、5.6、3.1倍和3.3、3.2、1.9倍。

Figure 2.  The effects of NaCl on CAT (a, b) and APX (c, d) activities in roots and leaves of of M. azedarach, U. pumila and R. pseudoacacia.

NaCl胁迫使苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中的Na⁺ 含量升高（表4）。在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，苦楝、白榆和刺槐幼苗根中Na⁺ 含量比0 mmol·L⁻¹ NaCl处理分别升高了99.3%、601.2%和594.0%，叶中Na⁺ 含量分别增加了151.9、128.1和7.1倍。另外，苦楝幼苗根中Na⁺ 含量在不同浓度NaCl处理间无显著差异，白榆幼苗根中Na⁺ 含量在100 mmol·L⁻¹ 和200 mmol·L⁻¹ NaCl间无显著差异，但刺槐幼苗根中Na⁺ 含量随NaCl浓度增加而显著升高。

与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，100 mmol·L⁻¹ 和200 mmol·L⁻¹ NaCl处理对苦楝幼苗根中K⁺含量无显著影响，但使白榆和刺槐幼苗根中K⁺ 含量显著降低（表4）。与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使苦楝、白榆和刺槐幼苗根中K⁺ 含量分别下降了25.1%、56.5%和46.7%，但使三者幼苗叶中K⁺ 含量分别升高了12.5%、53.4%和39.5%。另外，NaCl胁迫使苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中的K⁺/ Na⁺ 显著降低，与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，它们根和叶中的K⁺/ Na⁺ 分别降低了62.5%、94.0%、92.3%和99.1%、98.8%、85.3%（表5）。

NaCl胁迫苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中Ca²⁺ 含量的影响并不一致（表4）。NaCl胁迫对苦楝和刺槐幼苗根中Ca²⁺ 含量无显著影响，但使白榆幼苗根中Ca²⁺ 含量显著下降。与0 mmol·L⁻¹ NaCl处理相比，100 mmol·L⁻¹ NaCl处理对苦楝、白榆和刺槐幼苗叶中Ca²⁺ 含量无显著影响；200 mmol·L⁻¹ NaCl处理对苦楝和白榆幼苗叶中Ca²⁺ 含量无显著影响，但使刺槐幼苗叶中Ca²⁺ 含量显著升高；300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使苦楝幼苗叶中Ca²⁺ 含量显著降低，使刺槐幼苗叶中Ca²⁺ 含量显著升高，但对白榆幼苗叶中Ca²⁺ 含量无显著影响。苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中Ca²⁺/Na⁺ 均在受到NaCl胁迫后显著降低，300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使它们根中Ca²⁺/Na⁺ 比0 mmol·L⁻¹ NaCl处理分别减少了50.2%、89.4%和84.1%，使叶中Ca²⁺/Na⁺ 分别减少了99.5%、99.3%和89.4%。

NaCl胁迫对苦楝和白榆幼苗根中Mg²⁺ 含量没有显著影响，但使刺槐幼苗根中Mg²⁺ 含量升高（表4）。在叶中，NaCl胁迫使苦楝和白榆幼苗的Mg²⁺ 含量显著降低，但对刺槐幼苗没有显著影响。然而，NaCl胁迫使苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中的Mg²⁺/Na⁺ 显著降低，在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下，它们根和叶中的Mg²⁺/Na⁺ 分别下降了54.3%、87.4%、82.8%和99.5%、99.3%、90.6%。

苦楝幼苗的离子转运系数S_K,Na、S_Ca,Na 和S_Mg,Na 随着NaCl浓度增加而显著增大，在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下达到最大值，分别为0 mmol·L⁻¹ NaCl处理组的39.3、85.1和96.3倍（表6）。100 mmol·L⁻¹ 和200 mmol·L⁻¹ NaCl处理使白榆幼苗的离子转运系数显著降低，但300 mmol·L⁻¹ NaCl处理使其显著升高。刺槐幼苗的离子转运系数在100 mmol·L⁻¹ NaCl处理下升高，但在200 mmol·L⁻¹ NaCl处理下下降，而300 mmol·L⁻¹ NaCl仅使S_Ca,Na 和S_Mg,Na 显著升高。

由相关系数矩阵可知（图3），除个别指标间相关性较小外，其余指标之间存在显著相关关系，这使得它们提供的评价信息发生重叠。由于这些指标在植物适应盐胁迫中所发挥的作用不同，导致直接利用上述指标对苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐性进行评价会产生较大的偏差，因此，需要进一步鉴定才能够筛选出适宜的耐盐指标。

Figure 3.  Correlation coefficient matrix and significance of variation of 28 indexes of M. azedarach, U. pumila and R. pseudoacacia

对不同NaCl浓度下苦楝、白榆和刺槐幼苗的这些指标进行主成分分析，结果如表7。前4个综合评价指标（CI）的贡献率分别为42.8%、25.6%、15.6%和3.9%，累计贡献率为87.9%，已经对苦楝、白榆和刺槐幼苗的大多数指标信息给出了充分的概括，因此，可将28个初始测定指标转换为4个相互独立的综合指标，分别为 CI1、CI2、CI3和CI4。数据显示，对CI1贡献较大的指标有叶片相对含水量、根中可溶性蛋白质、根和叶中APX活性、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率；CI2主要和叶中可溶性蛋白质、根和叶中Mg²⁺、叶中Ca²⁺和叶片干质量相关；在CI3中贡献较大的指标有根中CAT、根和叶中K⁺、叶中Ca²⁺ 和Na⁺、根和茎干质量；对CI4贡献较大的指标为气孔导读、蒸腾速率、根中K⁺、叶中Mg²⁺。同时根据28个直接测定指标在盐胁迫下的标准化值及各综合指标的特征向量系数，计算出苦楝、白榆和刺槐幼苗的4个综合指标值。

苦楝、白榆和刺槐幼苗各综合指标的隶属函数值使用以下公式计算：μ_i= (X_i−X_imin) /( X_imax−X_imin)。其中，X_i为苦楝、白榆和刺槐幼苗的第i 个综合指标值，X_imin和X_imax 分别为该综合指标值中的最小值和最大值。根据公式求出苦楝、白榆和刺槐幼苗所有综合指标的隶属函数值（表8）。

利用公式 $ Wi=Pi/\sum _{i=1}^{n}Pi $，根据各综合指标贡献率的大小计算各综合指标在主成分贡献率中的权重。其中，Wi表示第i个综合指标的权重；Pi表示苦楝、白榆和刺槐幼苗的第i个综合指标的贡献率。经计算，求得4个综合指标的权重分别为0.487、0.292、0.177和0.045。利用公式 ${D}=\sum _{i=1}^{n}[\mu i\times Wi]$ 计算苦楝、白榆和刺槐幼苗的综合耐盐性评价值(D)。结果发现，D值最高的为白榆（0.970）、最低的为刺槐（0.148），表明白榆幼苗的耐盐性在三者中最强，刺槐幼苗的耐盐性最弱（表8）。

使用灰色关联分析法筛选苦楝、白榆和刺槐幼苗的关键性耐盐指标。将3个树种的耐盐综合评价值（D，表8）及测定得到的28个指标作为一个整体。其中，耐盐综合评价值为因变量，其余生理生化指标为自变量。将自变量进行标准化处理后，计算因变量和各自变量之间的关联系数及关联度^[8]。结果发现，根中游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量，根和叶中CAT和APX活性，根中Ca²⁺和叶中Na⁺含量与苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐性关联度较高（表9）。

土壤中过量的盐分会影响植物正常的生理发育过程，导致植物生长减缓、光合作用减弱、渗透调节物质和抗氧化酶活性改变等，最终阻碍了植物生物量的累积^{[5, 13-14, 21-22]}。生物量作为植物耐盐性评价的最可靠指标，是植物响应盐胁迫的综合表现特征^[23]。本研究中，NaCl抑制了苦楝、白榆和刺槐幼苗的生物量，并且对刺槐幼苗生物量的抑制最强。叶片相对含水量是衡量植物水分状况的重要指标之一，盐胁迫会降低植物根系向地上部分的水分运输^[13]。本研究发现NaCl胁迫导致苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片的相对含水量显著降低，且在300 mmol·L⁻¹ NaCl处理下降低幅度大小为苦楝＞刺槐＞白榆。电解质渗透率是衡量植物细胞膜完整性的重要指标之一^[24]。盐胁迫会导致植物叶片膜系统受损、电解质外渗，使电解质渗透率升高，在相同NaCl浓度下，三种幼苗叶片电解质渗透率升高幅度大小为刺槐＞白榆＞苦楝。叶片相对含水量下降及膜系统受损引起叶绿体结构破坏、叶绿素酶活性升高，导致叶绿体色素合成受阻或者分解加快^{[13, 25]}。本研究发现，苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片的色素含量在NaCl处理下出现不同程度下降^[2]，使植物光合作用受阻、光合参数降低。在相同NaCl浓度下P_n降低幅度大小为刺槐≥白榆＞苦楝。WUE反映了植物对外界环境的适应能力^[13]，L_s反映了NaCl胁迫对叶片气孔通过气体能力的影响。NaCl处理使苦楝、白榆和刺槐幼苗叶片的WUE和L_s升高，说明NaCl提高了三种幼苗叶片的WUE但限制了气孔功能。

盐胁迫破坏植物的渗透势，导致细胞内渗透失衡^[26-27]。脯氨酸和可溶性蛋白质是调节植物细胞渗透势的重要有机物质，能够增强植物对盐胁迫的适应能力^[28-31]。本研究中，苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中游离脯氨酸含量，以及根中可溶性蛋白质含量在受到NaCl胁迫后增加，其中苦楝根中积累量高于白榆和刺槐，表明苦楝根的渗透调节能力强于白榆和刺槐。盐胁迫还对植物造成氧化胁迫，使植物体内抗氧化酶活性增强^{[13, 26, 32-33]}，从而加快对细胞内过量活性氧的清除，抑制细胞膜的过氧化，尽可能保证植物正常的生理代谢过程^[34]。本研究发现，苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中CAT和APX的活性在受到NaCl胁迫后均显著升高，并且在同一NaCl浓度下，白榆幼苗根中CAT活性最强，苦楝幼苗叶中CAT活性强于白榆和刺槐；根中APX活性大小排序为白榆＞刺槐＞苦楝，叶中APX活性强弱排序为白榆＞苦楝＞刺槐，表明白榆清除活性氧、维持细胞膜稳定的能力强于苦楝和刺槐。

矿质离子在植物适应盐胁迫过程中起着重要作用^{[5, 28]}。本研究中，NaCl胁迫导致苦楝、白榆和刺槐幼苗根和叶中Na⁺ 含量显著升高，并且苦楝幼苗根中Na⁺ 升高程度小于白榆和刺槐，但叶中Na⁺ 却相反；表明在较高浓度的NaCl胁迫下，白榆和刺槐倾向于把Na⁺ 留存在根中，而苦楝则倾向于把Na⁺ 转移到叶中。同时，苦楝幼苗叶片的离子选择运输系数S_K，Na、S_Ca，Na 和S_Mg，Na 在受到NaCl胁迫后显著增加，表明K⁺、Ca²⁺ 和Mg²⁺ 向叶片的选择性运输增强；而白榆和刺槐幼苗的离子选择系数变化趋势与苦楝幼苗并不一致。这表明，三种幼苗可能采取了不同措施应对NaCl胁迫。

植物的耐盐性是受众多指标控制的综合性状，而各指标间也存在着相互关系^[35]。因此，通过单一指标存在局限性，不能有效的评价不同植物的耐盐性，而采用生长、生理、生化等多种指标可以准确的筛选耐盐性植物 ^{[9-10, 35]}。本研究通过相关性分析、主成分分析、隶属函数法及灰色关联分析等方法对苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐性进行综合评价，并筛选关键的耐盐性鉴定指标，发现白榆幼苗的耐盐性最强，刺槐幼苗的耐盐性最差。然而，植物在不同的土壤中以及不同的生长发育阶段，其耐盐性是不同的。而本文仅探讨了苦楝、白榆和刺槐幼苗适应NaCl胁迫的生长、生理、生化指标变化，故此仍需深入研究它们在土壤盐分环境中的响应差异。

本研究采用生长、生理、生化指标来评价苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐能力，分析比较了三者在不同NaCl浓度下的生长、生理和生化响应差异，并通过综合评价，初步确定了苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐能力强弱为白榆＞苦楝＞刺槐。同时，发现根中游离脯氨酸和可溶性蛋白质含量、根和叶中CAT和APX活性、根中Ca²⁺ 和叶中Na⁺ 含量与苦楝、白榆和刺槐幼苗的耐盐性关联度较高，这些指标反映了苦楝、白榆和刺槐幼苗响应NaCl胁迫下的渗透调节能力、抗氧化能力和对离子的选择吸收转运能力，可以用来评价苦楝、白榆和刺槐幼苗对盐胁迫的适应能力。