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随着我国沿海地区工农业的快速发展以及城市化区域的不断扩大,工农废水和生活污水的排放量越来越大。大量污水涌入江河海湾造成了很大的环境压力[1]。红树湿地系统处在陆地向海洋的过度带,对各种污染物有很强的吸附能力,具有净化污水、沉积污染物的能力[2-4]; 然而,污水排放对红树植物的正反影响效应存在较大的争议。一方面,污水排放能为红树植物带来丰富的营养物质,促进红树的生长;另一方面,污水中重金属污染物的胁迫作用对红树植物存在一定的不利影响,减缓红树植物的生长发育。因此,探究红树植物响应污染胁迫的机制是当前研究的热点[5]。有研究表明,红树植物能够通过多种途径应对重金属胁迫, 如:根部发达的凯氏带可以防止重金属离子向地上部分转运;植物体内的小分子有机酸等物质可以将重金属沉淀于细胞壁或局限于液泡等细胞器;通过增强植物体自身抗氧化系统活性或促进各种抗氧化物质合成来清除重金属胁迫下产生的大量活性氧自由基[6-8]; 然而,这些研究大多停留在生理层面,从分子层面分析重金属胁迫处理对红树植物生长影响的研究鲜有报道[9-10]。
数字基因表达谱(DGE)是一种高效的高通量测序技术,DEG能用于分析某一物种特定组织在特定条件下基因的表达情况。通过对差异基因涉及到的生物学过程进行搜索、比较和分析,可预测基因的表达模式和蛋白质的功能等信息。目前,已有学者利用该技术在转录水平分析了美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)、泡泡刺(Nitraria sphaerocarpa Maxim.)、花生(Arachis hypogaea Linn.)等植物基因表达谱[11-13]。如,赖晓娟等[14]通过分析坛紫菜(Pyropia haitanensis Rhodophyta)的数字基因表达谱,筛选出了256个上调表达基因和3 820个下调表达基因,证明了高温胁迫对坛紫菜的生长发育有一定的抑制作用,但同时也诱导了补救途径。
作为常见的红树林优势树种白骨壤(Avicennia marina (Forsskål) Vierhapper)广泛分布于陆地向海洋过渡的潮间带,在我国分布于海南、广东、广西等省的滨海地区。白骨壤能耐受一定浓度的污染胁迫,可在污水污染的潮间带生长[15]。有研究表明,白骨壤模拟湿地系统可对污水起到很好的净化效应,在栽种白骨壤植物的土壤子系统中,重金属积累含量显著降低[16]。进一步研究表明,白骨壤正是通过调控湿地系统中氮、磷的分配、循环达到净化作用[17-18]。周涵韬等[19]通过mRNA差异显示技术,分离得到了白骨壤耐盐相关cDNA,为揭示白骨壤盐胁迫响应机制打下了基础。本文采用基于高通量测序的数字基因表达谱技术研究污水胁迫处理下白骨壤的基因表达变化,从分子层面分析白骨壤对重金属污染胁迫的耐受机制,为深入研究重金属污水胁迫对红树植物生长的影响机制提供参考。
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Hoagland营养液;人工污水;Trizol试剂盒(TaKaRa, 大连,中国);琼脂糖;寡聚(dT)-纤维素;片段化缓冲液(fragmentation buffer);dNTPs;六碱基随机引物;RNase H;DNA polymerase I;QiaQuick PCR试剂盒;EB缓冲液;PrimeScriptTMRT Master Mix (TaKaRa,大连,中国);SYBR Green supermix;PCR仪型:Bio-Rad CFX96 touchTM。
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2015年7月在湛江雷州附城镇红树林育苗场采集20~30 cm且具有3~4对叶片的白骨壤幼苗。将株高相近、长势旺盛、完好无损的36株白骨壤幼苗随机分成重金属处理组和对照组,每组设置3个重复。随后加入1/2 Hoagland营养液于室温条件下进行复壮培养,30 d后处理组进行人工重金属污染胁迫处理。人工重金属污水胁迫处理参照Wang等[15]的方法,其中,Pb2+、Cd2+、Hg2+作为外界胁迫因素,其浓度分别为10、2、2 mg·L-1。对照组用等量的1/2 Hoagland营养液处理。对照组和处理组在相同环境下继续培养2 d后分别摘取无缺损、完全开展的白骨壤嫩叶,并将嫩叶保存于液氮中备用。
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采用Trizol法提取污水胁迫处理组和对照组白骨壤叶片样品的总RNA,对照和处理各3份生物学重复;然后,将对照和处理的各自3份RNA样品等量混合,由广州基迪奥公司构建测序文库,采用Illumina HiSeqTM 2000平台进行转录组测序。
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基因的表达量由比对到基因表达区域序列的readcount频率来估算,通过edgeR软件对得到的readcount数据进行差异分析,以筛选差异表达基因。本实验差异基因筛选标准为P-value < 0.05,|log2 Fold Change|>1,其中,Fold Change为污水胁迫处理样本与对照样本中各基因表达量的比值。对于差异表达基因,其log2 Fold Change>0时,认为该差异表达基因是上调的;反之,若log2 Fold Change < 0,则认为该差异表达基因是下调的。
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采用GO数据库(http://www.geneontology.org/)对污水胁迫处理下白骨壤的差异表达基因进行GO功能富集显著性分析。采用GOseq方法计算得到一个特定的P-value。一般校正后的P-value≤0.05,表示差异表达基因在该GO中出现了富集。同时,使用KOBAS(2.0)软件对差异基因进行KEGG代谢通路富集性分析,当FDR(错误发现率)≤0.05时,表示该通路中差异表达基因富集显著。
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随机选取8个与白骨壤抗污染胁迫相关的关键基因进行qRT-PCR技术,以验证白骨壤数字基因表达谱测序数据的可靠程度。白骨壤RT引物在Premier primer 5软件上设计,扩增平均长度控制在200~250 bp,相关引物见表 1。内参基因为白骨壤组成型表达基因tubulin。白骨壤对照样本及污水胁迫处理样本各取1 μg总RNA作为模板,采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa,大连,中国) 试剂盒进行逆转录,逆转录得到的cDNA用于实时荧光定量检测。反应总体系为10 μL,体系中SYBR Green超混合液(2×)、正向引物、反向引物、cDNA、和ddH2O的体积分别为5.0、0.2、0.2、1.0、3.6 μL。PCR反应程序为96℃预变性1 min,95℃变性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸45 s,40次循环。每个差异基因验证3次,以降低实验误差,并依照2-ΔΔCt的方法计算基因的相对表达量。
基因编号
Gene number正向引物序列(5’-3’)F
orward primer sequence反向引物序列(5’-3’)
Reverse primer sequence0003922 CAATTTGGCTGATATAAG CAAGGACTGAAGAATGAAGC 0048831 GCTCTTTTCAAAGAGTGAG GCGTTGCCGGGTTGTAACT 0026527 GAACCTTTCTCAGTGACC CATTGGGTACAAAAGCAGC 0053069 CGTTTGATCAGCCATCTG CAAACTCAGTATAATCAC 0020253 GTGGAGGCTGAAGGTTGC GTAGGTTACATCTTCGCCA 0055711 CTTGACATTTTCAATCGG CTCTGCACTGGTTCATTG 0016422 GACAATGGCGACCGTTAC CCGCAACCGCAAAAGTTGC 0049777 CAGCTTTCCTGCCTTCCG GGACCATCAGGTGTCTCCA 微管蛋白基因
Tubulin geneCAGGCCAGTCAAGAGAAAC CATTCATGGCCAAGTTAGC Table 1. Primer sequences
1.1. 实验试剂与仪器
1.2. 白骨壤材料处理和收集
1.3. 总RNA提取和基因表达谱测序
1.4. 差异表达基因的筛选
1.5. Gene Ontology (GO) 基因功能注释和KEGG代谢通路分析
1.6. qRT-PCR验证
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分析白骨壤数字基因表达谱测序数据发现,重金属污水胁迫处理样品和对照样品测序所得数据,经过滤筛除含有接头和低质量部分后,得到高质量Clean reads的比例分别为98.26%、98.23%,证明测序质量较高。将得到的Clean reads与参考基因比对,对照样本和重金属污水胁迫处理样本分别有89.20%和87.45%的Clean reads可比对上参考基因,这为白骨壤转录组序列的注释打下了结实的基础。测序结果提交到Genebank,登录号为SRA487295。
饱和度是用来衡量单一样本测序得到的基因数量是否覆盖全基因组的标准,检测所得的基因数量随测序量的增加而增加,当测序量接近基因组的大小时,其检测到的基因总数达到峰值,表明检测到的基因数已基本覆盖全基因组。本研究中,对照样本和污水胁迫处理样本的Reads数量超过10 M时,检测到的基因数量趋于饱和,而实验中2个样品的测序量分别为25.26、25.64 M,证明绝大部分基因已被检测到。随机性分析表明:各样本的Reads呈正态分布,具有很高的随机性。上述结果表明:本次测序结果能够较好地反映各样本中基因表达的真实情况,可用于分析重金属污水胁迫处理下白骨壤基因的表达变化。
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MeV聚类分析显示:聚在同一类的基因表达量在对照样本和重金属污水胁迫处理样本间差异极大,大部分基因表现为在污水胁迫处理样本中的表达量比对照样本中的高。
通过比较对照样品与重金属污水胁迫处理样品基因表达谱,共筛选出10 459个差异表达基因,其中,有8 685个基因表达量增加,1 774个基因表达量减少,表明重金属污水胁迫处理极大的诱导了白骨壤基因的表达。
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将白骨壤差异表达基因比对到GO数据库,共得到2 041条terms,其中,“分子功能”514条,占25.18%;“细胞组分”202条,占9.90%;“生物学过程” 1 325条,占64.92%。以P-value≤0.01为标准筛选极显著富集条目,共得到230条,其中,“分子功能”39条,“细胞组分”46条,“生物学过程”145条。对差异表达基因GO功能分类发现,大部分类别中,表达量上调的基因数比表达量下调的基因数多,其中,与“生物学过程”相关的差异表达基因主要涉及“代谢过程”、“对刺激因素的响应”、“区域化”、“生物调节”等过程,与“分子功能”相关的差异表达基因主要与“结构分子活性”、“转运体活性”、“催化活性”、“结合活性”等分子活性相关,与“细胞组分”相关的差异表达基因主要与“细胞器组分”、“细胞组分”、“大分子复合物”、“膜组分”等结构相关。此外,重金属污水胁迫处理还提高了白骨壤的“抗氧化因子”、“蛋白质结合转录因子”、“核酸结合转录因子”、“电子载体”、“鸟嘌呤核苷酸交换因子”等关键因子的活性,进而影响“生物粘附”、“信号传导”、“多细胞调节”等过程。
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通过KEGG代谢通路富集分析,可以揭示差异表达基因参与的主要生理活动途径。结果表明:重金属污水胁迫处理下,白骨壤差异表达基因辐射到126条Pathway中。从表 2可以看出:在P≤0.05显著性富集的20条Pathway中,富集在“核糖体途径”的基因数量最多,共有409个差异表达基因;其次是“碳代谢途径”,富集了303个差异表达基因。“乙醛酸盐代谢”途径、“光合生物固碳途径”和“丙酮酸代谢途径”也是3个显著性富集的代谢途径,分别富集了107、103、113个差异表达基因,占差异表达基因总数的6.32%、6.08%、6.67%。此外,在“苯丙环素的生物合成”、“氮素代谢”、“光合作用”、“脂肪酸代谢”、“氨基酰-tRNA的生物合成”、“半乳糖代谢”等途径也富集了一定数量的差异表达基因。
KEGG代谢途径
KEGG metabolic pathway差异基因数量/个
The number of differentially expressed genesKEGG代谢途径
KEGG metabolic pathway差异基因数量/个
The number of differentially expressed genes核糖体Ribosome 409 光合作用天线蛋白Photosynthesis-antenna proteins 51 苯并环素的生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 77 脂肪酸代谢Fatty acid metabolism 80 氮素代谢Nitrogen metabolism 46 丙酮酸代谢Pyruvate metabolism 113 萜类化合物的生物合成
Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis24 不饱和脂肪酸的生物合成
Biosynthesis of unsaturated fatty acids41 光合作用Photosynthesis 83 植物的昼夜节律Circadian rhythm-plant 34 乙醛酸盐代谢Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 107 氰氨酸代谢Cyanoamino acid metabolism 28 光合生物固碳Carbon fixation in photosynthetic organisms 103 氨基酰-tRNA生物合成Aminoacyl-tRNA biosynthesis 46 碳代谢Carbon metabolism 303 阿尔法亚麻酸代谢Alpha-Linolenic acid metabolism 34 类黄酮生物合成Flavonoid biosynthesis 21 半乳糖代谢Galactose metabolism 52 硫胺素代谢Thiamine metabolism 19 喹啉生物碱的生物合成Isoquinoline alkaloid iosynthesi 23 Table 2. KEGG metabolic pathway enrichment analysis
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植物激素是一类参与植物生长发育、代谢和环境响应的重要化学物质[20]。通过对白骨壤DEG分析,得到了生长素、乙烯、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内脂等一系列激素相关基因的表达差异情况,并分析了污水胁迫对上述基因的影响。结果(表 3)表明:在污水胁迫处理下,一个生长素上调小RNA基因SAUR(0052024)显著上调。多个乙烯信号途径基因也得到了分析,其中,乙烯不敏感3基因EIN3(0016997)的表达保持稳定,而乙烯响应转录因子1基因ERF1(0013995)的表达受到污水胁迫的明显诱导。众多细胞分裂素基因的表达受到污水胁迫的显著影响,如细胞分裂素脱氢酶7基因CKX7(0057124)的表达显著上调,而一个富含组氨酸的磷酸转移蛋白1基因AHP1(0029198)的表达受到极大的抑制。另一个内源细胞分裂素相关基因玉米黄质环氧化酶基因ZEP(0021189)在污水胁迫处理下表达水平也显著上调。在脱落酸途径中,一个脱落酸不敏感5基因ABI5(0061511)的表达显著上调。最后笔者发现,油菜素内脂的一个信号转导组分基因——油菜素内酯信号激酶基因BSK(0043741)的表达受到极大的诱导。
基因编号Gene number 基因注释Gene annotation log2比值log2 ratio 0046155 生长素转运子基因(AUX1)Auxin transporter(AUX1) -0.805 890 0052024 生长素上调小RNA基因(SAUR)Small auxin-up RNA(SAUR) 1.120 046 0047099 组成型三重相应基因(CTR1)Constitutive triple response 1(CTR1) -0.339 360 0016997 乙烯不敏感3基因(EIN3)Ethylene-insensitive 3(EIN3) -0.052 400 0013995 乙烯响应转录因子1基因(ERF1)Ethylene-responsive transcription factor 1(ERF1) 11.059 680 0002348 乙烯响应转录因子5基因(ERF5)Ethylene-responsive transcription factor 5(ERF5) 0.226 346 0057124 细胞分裂素脱氢酶7基因(CKX7)Cytokinin dehydrogenase 7(CKX7) 11.593 530 0018620 组氨酸激酶3基因(HK3)Histidine kinase 3(HK3) -0.200 330 0029198 富含组氨酸的磷酸转移蛋白1基因(AHP1)Histidine-containing phosphotransfer protein 1(AHP1) -8.692 090 0021189 玉米黄质环氧化酶基因(ZEP)Zeaxanthin epoxidase(ZEP) 12.930 480 0061511 脱落酸不敏感5基因(ABI5)Abscisic acid-insensitive 5(ABI5) 12.079 980 0001111 丙二烯氧化物合酶基因(AOS)Allene oxide synthase(AOS) -8.549 980 0043741 油菜素内酯信号激酶基因(BSK)Brassinosteroid signaling kinase(BSK) 11.713 390 Table 3. The changes of expression of plant hormones related genes under artificial heavy metal stress
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通过KEGG分析发现:污水处理可显著影响白骨壤中萜类和黄酮类次生代谢相关基因的表达(表 4),其中,萜类物质生物合成的限速酶牻牛儿基焦磷酸合酶(0009238)、甲基赤藓醇磷酸胞苷酰转移酶(0057458)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(0025369)的表达都受到污水胁迫的显著诱导。另外,黄酮类生物合成的几个关键酶,如:黄酮醇合成酶(0001833)和查尔酮合成酶(0000917)的编码基因表达水平也受到明显的诱导。大量次生代谢相关基因的上调表达,暗示污水胁迫可能加速白骨壤内次生代谢产物的积累。
基因编号Gene number 基因注释Gene annotation log2比值log2 ratio 0025369 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase) 8.960 871 0057458 甲基赤藓醇磷酸胞苷酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase) 11.739 490 0009238 牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase) 12.017 850 0022506 牻牛儿基转移酶(geranylgeranyl transferase) 1.000 000 0000917 查耳酮合成酶(chalcone synthase) 11.701 310 0001833 黄酮醇合酶(flavonol synthase) 11.868 510 0050834 无色花色素加双氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase) 0.175 194 Table 4. The changes of expression of secondary metabolism related genes under artificial heary metal stress
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一系列转录因子家族成员在植物环境胁迫响应中起到了重要的作用[21]。基于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)转录因子数据库,笔者对白骨壤转录组进行比对和注释,一共鉴定到了分属于56个常见家族的6 662个转录因子,转录因子家族及其包含的家族成员数据见表 5。研究发现:bHLH、NAC、MYB_related、WRKY等家族在白骨壤中拥有大量的成员。此外,一批与激素相关的转录因子家族也得到了鉴定,如ARF、ERF、ARR-B等;一些与植物环境胁迫密切相关的转录因子家族也得到了不同程度的分析,如bZIP、GATA家族。鉴定转录因子家族,有利于形成一个完整的调控网络,揭示白骨壤污水胁迫响应的分子机制。
转录因子家族
Transcription factor family数量
Number转录因子家族
Transcription factor family数量
Number转录因子家族
Transcription factor family数量
Number转录因子家族
Transcription factor family数量
Number转录因子家族
Transcription factor family数量
NumberbHLH 685 GRAS 179 LBD 76 CO-like 37 RAV 15 NAC 487 HD-ZIP 156 Nin-like 75 CPP 34 EIL 14 MYB_related 431 HB-other 129 NF-YB 72 STAT 33 VOZ 13 WRKY 377 Trihelix 115 M-type 70 WOX 31 HB-PHD 13 C3H 347 GATA 108 SBP 66 BES1 29 LSD 13 C2H2 320 TALE 104 S1Fa-like 65 DBB 28 HRT-like 9 FAR1 319 HSF 103 AP2 64 BBR-BPC 28 Whirly 6 B3 308 MIKC 94 E2F/DP 62 NF-X1 24 LFY 5 ERF 266 TCP 92 NF-YA 49 ARR-B 22 bZIP 263 ARF 83 GeBP 44 CAMTA 21 MYB 219 YABBY 81 NF-YC 42 ZF-HD 17 G2-like 185 Dof 79 GRF 39 SRS 16 转录因子总数量Total No.of TF 6 662 Table 5. Analysis of transcription factors
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为了验证测序数据的可靠性,笔者选择显著富集的GO分类条目“GO: 0016491”、“GO: 0005198”、“GO: 0016866”和“GO: 0003723”中的8个差异表达基因进行qRT-PCR分析,这8个基因分别是:0003922、0048831、0026527、0053069、0020253、0055711、0016422和0049777,它们都是白骨壤中参与基础代谢的关键基因。实验结果表明:这8个基因的qRT-PCR结果与数字基因表达谱中检测到的表达趋势有较高的一致性。