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ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)组成了已知转运蛋白家族中最大的超家族,它是由含NBD(Nucleotide-binding domain)、TMD(Transmembrane domain)、NTE(N-terminal extension)等结构域的蛋白共同组成的[1-2]。ABC转运蛋白具有跨膜结构域,可作为转运肽、糖、脂、重金属螯合物等有机物的膜整合蛋白来行使其功能[3]。根据ABC转运蛋白所含有结构域的类型和数量等因素,将其分为ABCA-ABCI等九个亚族[4]。不同亚族的功能及所处的亚细胞位置等存在一定的差异。ABC转运蛋白广泛存在于动物、植物、真菌、细菌等生物中,不同生物间ABC转运蛋白数量存在较大的差异[5]。ABC转运蛋白在抗真菌毒素或转运细胞毒素的过程中起着重要作用[6]。目前已知,ABC转运蛋白在保护人类血脑屏障不受外源化学物质或有毒代谢产物影响等作用;在植物中参与病原微生物应答、重金属调节、次生代谢产物运输以及植物生长等过程; 在真菌中具有分泌性信息素、合成铁硫蛋白、保护病原真菌不受细胞抗真菌毒素的影响及核糖体合成等功能[7-9]。病原真菌在侵入植物寄主的过程中,需要这些转运蛋白帮助克服寄主产生的抗真菌化合物或细胞毒素对自身的毒害作用[10]。
桉树焦枯病(Calonectria leaf blight)是热带和亚热带地区桉树种植区危害最为严重的病害之一,严重威胁桉树产业的发展[11]。桉树焦枯病菌是由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起的病害,其无性态为帚梗柱孢属(Cylindrocladium)真菌[12]。据统计Calonectria现有集群13个,共71种,其中C. pseudoreteaudii是福建省内发现最早、分布最广、致病力最强的病原菌株[13-15]。桉树富含次生代谢物质,包括类黄酮类和鞣质等酚类化合物以及蒎烯、萜烯醇等挥发性化感物质,这些物质有利于桉树抵御虫害、病害等有害生物的侵袭[16]。课题组前期研究也表明桉树叶片中多酚类物质含量、黄酮类化合物含量、多酚氧化酶活性水平及其同工酶谱带均与桉树对焦枯病抗性成正相关[17]。有鉴于此,本文在课题组前期已对桉树焦枯病菌(Ca. pseudoreteaudii)的全基因组进行测序的基础上,通过生物信息学方法对桉树焦枯病菌ABC转运蛋白进行鉴定及分类,并进一步进行亚细胞定位预测和系统进化分析等,旨在明确ABC转运蛋白在焦枯病菌对桉树侵染过程中所起的作用,为揭示桉树焦枯病菌致病机制提供理论依据。
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通过Hmmer与Pfam比对获得具有ABC转运蛋白结构域的原始数据, 总共在桉树焦枯病菌中鉴定出70个ABC转运蛋白,约占总编码蛋白数量的0.49%(表 1)。这些基因广泛分散于不同的桉树焦枯病菌基因组支架(Scaffod)上。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)含有50个ABC转运蛋白,约占总编码蛋白数量的0.32%;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)含有29个ABC转运蛋白,约占总编码蛋白数量的0.46%;禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中含有58个ABC转运蛋白,约占总编码蛋白数量的44%,其总量均低于桉树焦枯病菌(表 1)[9, 18]。根据HUGO(Human Genome Organization)系统分类法,将其划分为ABCA(1,1.4%)、ABCB(20,29%)、ABCC(15,21%)、ABCD(2,2.8%)、ABCE(1, 1.4%)ABCF(3,4.3%)、ABCG(24,34%)、ABC1(4,5.7%)8个亚族(表 2),并进行系统命名。其中,ABCG亚族为桉树焦枯病菌最大的ABC转运蛋白亚族,其数量远高于酿酒酵母与稻瘟病菌,说明该亚族存在明显的扩张。桉树焦枯病菌ABC转运蛋白的分类与稻瘟病菌的大致相同,都具有ABC1亚族,酿酒酵母和禾谷镰刀菌中并没有ABC1亚族。
菌种
Fungal speciesABCA ABCB ABCC ABCD ABCE ABCF ABCG ABC1 ABC转运蛋白占比
Percent of ABC transporterABC总数
Total ABCs基因总数
Total genes占比
Percent/%桉树焦枯病菌C. pseudoreteaudii 1 20 15 2 1 3 24 4 70 14 355 0.49 稻瘟病菌M. grisea 2 19 10 2 1 5 8 1 50 15 488 0.32 酿酒酵母S. Cerevisiae 0 4 6 3 1 5 10 1 29 6 275 0.46 禾谷镰刀菌F. graminearum 1 14 16 2 1 5 19 0 58 13 313 0.44 Table 1. Comparatively analysis of ABC transporter in C. pseudoreteaudii、M. grisea、S. Cerevisiae and F. graminearum
亚家族
Subfamily基因号
Gene ID命名
Name长度
Length/aa亚细胞定位*
Subcellular
localization亚家族
Subfamily基因号
Gene ID命名
Name长度
Length/aa亚细胞定位*
Subcellular
localizationABCA Cp_Cap08593 CpABCA1 1 621 PM ABCC Cp_Cap14344 CpABCC15 1 429 PM ABCB Cp_Cap00365 CpABCB1 798 EM ABCD Cp_Cap06579 CpABCD1 722 P ABCB Cp_Cap01810 CpABCB2 1 390 PM ABCD Cp_Cap04965 CpABCD2 656 P ABCB Cp_Cap02628 CpABCB3 1 277 PM ABCE Cp_Cap11665 CpABCE1 609 PM ABCB Cp_Cap02815 CpABCB4 1 211 PM ABCF Cp_Cap01280 CpABCF1 743 N ABCB Cp_Cap03102 CpABCB5 1 127 PM ABCF Cp_Cap11255 CpABCF2 752 CY ABCB Cp_Cap07322 CpABCB6 1 190 PM ABCF Cp_Cap12880 CpABCF3 621 CY ABCB Cp_Cap07912 CpABCB7 1 207 PM ABCG Cp_Cap00536 CpABCG1 1 457 PM ABCB Cp_Cap08600 CpABCB8 1 285 PM ABCG Cp_Cap00571 CpABCG2 635 PM ABCB Cp_Cap11484 CpABCB9 1 327 PM ABCG Cp_Cap01821 CpABCG3 1 439 PM ABCB Cp_Cap12067 CpABCB10 1 152 PM ABCG Cp_Cap01775 CpABCG4 701 PM ABCB Cp_Cap12521 CpABCB11 1 304 PM ABCG Cp_Cap02612 CpABCG5 1 468 PM ABCB Cp_Cap12529 CpABCB12 1 254 PM ABCG Cp_Cap02881 CpABCG6 1 433 PM ABCB Cp_Cap13243 CpABCB13 492 M ABCG Cp_Cap03218 CpABCG7 1 491 PM ABCB Cp_Cap00820 CpABCB14 1 048 V ABCG Cp_Cap03468 CpABCG8 1 348 PM ABCB Cp_Cap03996 CpABCB15 714 M ABCG Cp_Cap03823 CpABCG9 1 492 PM ABCB Cp_Cap04716 CpABCB16 838 M ABCG Cp_Cap04531 CpABCG10 755 PM ABCB Cp_Cap07127 CpABCB17 830 PM ABCG Cp_Cap04543 CpABCG11 1 369 PM ABCB Cp_Cap07577 CpABCB18 910 PM ABCG Cp_Cap04568 CpABCG12 611 PM ABCB Cp_Cap12746 CpABCB19 788 M ABCG Cp_Cap04890 CpABCG13 1 080 EM ABCB Cp_Cap12310 CpABCB20 1 427 PM ABCG Cp_Cap05904 CpABCG14 636 PM ABCC Cp_Cap00418 CpABCC1 554 V ABCG Cp_Cap06750 CpABCG15 1 507 PM ABCC Cp_Cap00722 CpABCC2 1 549 V ABCG Cp_Cap07730 CpABCG16 1 476 PM ABCC Cp_Cap01309 CpABCC3 1 382 PM ABCG Cp_Cap08510 CpABCG17 1 544 PM ABCC Cp_Cap01317 CpABCC4 1 556 PM ABCG Cp_Cap08616 CpABCG18 1 504 PM ABCC Cp_Cap02359 CpABCC5 1 340 PM ABCG Cp_Cap08595 CpABCG19 1 221 PM ABCC Cp_Cap02674 CpABCC6 1 709 PM ABCG Cp_Cap08765 CpABCG20 543 PM ABCC Cp_Cap03034 CpABCC7 1 486 V ABCG Cp_Cap08982 CpABCG21 1 399 PM ABCC Cp_Cap04080 CpABCC8 505 PM ABCG Cp_Cap09400 CpABCG22 1 472 PM ABCC Cp_Cap05392 CpABCC9 1 313 PM ABCG Cp_Cap10618 CpABCG23 1 420 PM ABCC Cp_Cap08340 CpABCC10 1 460 PM ABCG Cp_Cap14059 CpABCG24 1 301 PM ABCC Cp_Cap09471 CpABCC11 1 493 PM ABC1 Cp_Cap08118 CpABC1_1 383 M ABCC Cp_Cap11428 CpABCC12 1 550 PM ABC1 Cp_Cap08671 CpABC1_2 694 M ABCC Cp_Cap11474 CpABCC13 1 463 PM ABC1 Cp_Cap09029 CpABC1_3 497 M ABCC Cp_Cap14339 CpABCC14 1 464 EM ABC1 Cp_Cap10407 CpABC1_4 440 M *代表预测的蛋白双定位情况,M代表线粒体膜EM代表内质网,V代表液泡,PM代表细胞膜,P代表过氧化物酶体,S代表分泌蛋白,N代表细胞核,CY代表细胞质。 Table 2. Classification and subcellular localization of ABC transporter in C. pseudoreteaudii
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桉树焦枯病菌ABC转运蛋白结构域如图 1所示,其分别由全分子、四分之三分子、半分子及四分之一分子组成。其中,四分之一分子仅存在于ABC1亚族,其结构域为UbiB;ABCA亚族为全分子,其结构域为(TMD-NBD)2,其跨膜结构域与其他亚族不同的是在前两个螺旋之间额外多一个大环;ABCB亚族存在全分子及半分子,其结构域分别为(TMD-NBD)2和TMD-NBD。ABCC亚族通常为全分子,但是在桉树焦枯病菌中预测出较为特殊的半分子及四分之三分子;ABCE及ABCF亚族的结构域均有两个NBD结构域,前者具有RLI结构域,后者在两个NBD中间存在一个延伸结构域(Extension domain);此外,ABCG亚族的结构域为与除ABC1亚族外的其余亚族反向拓扑,其结构域为(NBD-TMD)2,还存在部分半分子。其中,最为特殊的半分子为CpABCG20,其结构域为TMD-NBD,与ABCB等亚族的结构域较为相似,但其却与裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的ABCG转运蛋白相似高达73.5%,我们推测其可能为假基因或与测序拼接错误导致编码蛋白序列的预测出错有关。
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Blastp比对结果如表 3所示,桉树焦枯病菌ABC转运蛋白各亚族功能具有多样性,参与焦枯病菌定殖过程中的各项生理活动。其中,ABCA转运蛋白与稻瘟病菌(M. oryzae)Abc4相似性达到了55%,我们推测其可能参与抗真菌药物及Na+的转运;桉树焦枯病菌共有20个ABCB转运蛋白,分为4类,分别含有13个多药耐药性转运蛋白(MDR,Multidrug Resistance Transporter)、5个重金属转运蛋白(HMT,Heavy Metal Transporter)、1个线粒体肽转运蛋白(MPE,Mitochondrial Peptide Exporter)及1个性信息素转运蛋白(STE,The a-Factor Sex Pheromone Exporter);桉树焦枯病菌ABCC转运蛋白的预测功能主要为药物耦合转运蛋白(DCT,Drug Conjugate Transporter);桉树焦枯病菌ABCD与酿酒酵母ABCD转运蛋白Pxa1p和Pxa2p相似性为30%~40%,其可能作为异源二聚体合成完整的过氧化物酶体,并参与脂肪酸的β氧化。桉树焦枯病菌ABCE转运蛋白与酿酒酵母ABCE(Rli1p)相似性高达73%,其可能主要参与核糖体的合成和翻译的起始;桉树焦枯病菌CpABCF3与酿酒酵母中ABCF(Arb1p)转运蛋白的相似度高达73%,其余两个相似度仅在30%左右。因此,CpABCF3可能与40S和60S核糖体的合成有关;ABCG转运蛋白主要为多效耐药性有关(PDR,Pleiotropic Drug Resistance),除参与药物转运外,还参与多种脂质分子的易位。桉树焦枯病菌ABC转运蛋白除CpABCG8外,与禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)ABCG转运蛋白(FgABC1)的相似度均达到30%,其中,CpABCG9与其相似度达到73%。此外,还含有部分半分子ABCG转运蛋白又被称为WBC(White-brown complex),其在真菌中的功能仍然未知;桉树焦枯病菌ABC1转运蛋白CpABC1_1蛋白与酵母ABC1蛋白(P27697)的相似度为54%,CpABC1_2蛋白没有相似度,其余两个的相似度在30%左右,说明CpABC1_1蛋白可能为辅酶Q的重要辅助因子。
亚家族Subfamily 功能Function 数量Amounts ABCA 转运植物毒素及药物(Transport phytotoxin and drug) 1 ABCB 多药耐药性转运蛋白(Multidrug Resistance Exporter,MDR) 13 重金属转运蛋白(Heavy Metal Transporter,HMT) 5 线粒体肽转运蛋白(Mitochondrial Peptide Exporter,MPE) 1 性信息素转运蛋白(The a-Factor Sex Pheromone Exporter,STE) 1 ABCC 药物耦合转运蛋白(Drug Conjugate Transporter,DCT) 15 ABCD 过氧化物酶体脂肪酰基辅酶A转运蛋白(Peroxisomal Fatty Acyl CoA transporter,P-FAT) 2 ABCE 核糖体合成及翻译(Sythesis and translation of ribosome) 1 ABCF 40s和60s核糖体合成(Sythesis of 40s and 60s ribosome) 3 ABCG 多效耐药性转运蛋白(Pleiotropic Drug Resistance,PDR) 24 ABC1 辅酶Q辅助因子(Cofactor of CoQ) 4 Table 3. Predicted of subfamily function of ABC transporter in C. pseudoreteaudii
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亚细胞结构定位预测如表 2所示,桉树焦枯病菌ABC转运蛋白的亚细胞结构具有多样性,广泛分布于细胞膜、线粒体、内质网、等膜系统上。其中,ABCA亚族位于线粒体膜;ABCB亚族分别位于内质网(1,5%)、线粒体(4,20%)、液泡(1,5%)、细胞膜(14,70%);ABCC亚族分别位于液泡膜(3,20%),细胞膜(11,73%),内质网膜(1,7%);ABCD亚族位于过氧化物酶体上;ABCE亚族位于细胞膜上,ABCF亚族位于核膜及细胞质基质中;ABCG亚族分别位于细胞膜(23,96%),内质网膜(1,4%);ABC1亚族均位于线粒体上。桉树焦枯病菌ABC转运蛋白71%的转运蛋白位于细胞膜、10%位于液泡, 其余部分位于线粒体、过氧化物酶体、内质网等内膜系统上。与已知ABC转运蛋白的亚细胞结构相符,各亚族间的亚细胞结构具有共性,这表明桉树焦枯病菌ABC转运蛋白在功能上具有一定的保守性。
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采用MEGA软件构建的neighbor-join系统进化树(图 2)显示,桉树焦枯病菌ABC转运蛋白分为6个亚群。其中,ABCE与ABCD处于同一个亚群,说明其进化关系较为接近。同理,ABCF亚族与ABCA亚族的进化关系较为接近。ABCA亚族、ABCF亚族与ABCG亚族的结构域各不相同,却处在同一分支上,说明这3个亚族的进化关系却较为接近。其余5个亚族的进化关系相当。