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油茶(Camellia oleifera Abel.)属于山茶科山茶属，是世界四大木本油料树种之一，我国油茶主产区主要集中在江西、安徽、湖南、福建、广西等长江流域及以南地区。茶油的不饱和脂肪酸含量高达96%以上，有“东方橄榄油”的美誉，保健功效明显，同时，大力发展油茶产业在食用油供应、环境美化、增加农林收入等方面具有重要作用[1-4]。
油茶炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)是油茶林最主要的病害，病菌常造成落果、落叶、枯梢，甚至整株死亡，江西、安徽、湖南等多地报道过油茶病株率高达70%以上，病果率可达100%，严重影响油茶产量[5]。
研究发现，植物抗病性与防御酶活性密切相关，如过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等防御酶，其在植物诱导抗性方面发挥着重要作用，有些指标甚至可以作为植物抗性水平和筛选抗病植物品种的重要参考标准[6-8]。过氧化物酶(Peroxidase，简称POD)是一种还原酶，能够清除细胞内有害物质、保护酶蛋白，与植物抗病性有密切关系，尤其与病原菌的侵染作用明显，如白粉病可以导致感病苜蓿品种POD活性显著高于抗病品种[9]。过氧化氢酶(Catalase，简称CAT)也称触酶，存在于植物体所有组织中，可以催化细胞内过氧化氢，与植物代谢、抗寒、抗病有一定关系，如马铃薯植株体内过量的CAT表达可以提高抗病性[10-11]。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是抵御活性氧的第一道防线，植物受到病原菌感染，体内活性氧增加，该酶作为内源活性氧清除剂参与抗植物逆境胁迫，如黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)侵染可以导致SOD活性上升[12-13]。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, 简称PPO)是一种铜结合酶，参与生物氧化，在植物体内具有抗病虫、生根等作用，如大斑病菌侵染无论在抗病和感病品种的玉米种PPO均明显升高[14]。
本实验采用活体针刺接种自然发病法，依托发病率、病情指数等鉴定油茶抗病性，划分抗炭疽病等级，利用光度分析法测定健康和感病植株叶片4种酶POD、CAT、SOD、PPO活性，分析油茶抗炭疽病与酶活性之间的关联，以期为控制该病害扩展蔓延提供生理生化方面的理论依据，同时也为油茶抗病品种的筛选和丰产奠定基础。
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油茶品种为岑软3号油茶(Cenruan 3)、博白大果油茶(C. gigantocarpa)、普通油茶(Camellia oleifera)、岑软2号油茶(Cenruan 2)、香花油茶(C. osmantha Ye CX)、陆川油茶(C. vietnamensis)。每个品种选30株，共180株相同苗龄植株，植株健康。
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供试菌种分离自油茶发病叶片。油茶炭疽病菌：胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.
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采用活体针刺接种自然发病法[15]，略有改动。从枝条顶端开始第二张至第四张成熟叶片作为接种叶片，叶片接种前用带75%酒精的脱脂棉擦拭表面，用沾有灭菌水的棉球擦拭3遍，用灭菌的解剖针在叶片上接种点刺6个针眼，每张叶片上取4个接种点，各接种点相距2 cm左右。用解剖刀在28℃暗培养5天的油茶炭疽病菌菌落菌丝体厚度0.5 mm，边缘切取1.0 cm×0.5 cm菌块，正面贴于针刺处，然后用沾有1.0%葡萄糖水脱脂棉敷于菌块上，最后用密封袋将有接种叶片的枝条密封，自然温度下(25℃30℃)保湿72 h后，除去密封袋。用无菌PDA培养基接种作对照。每个油茶品种接种10张叶片，逐日观察，记录发病情况。
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病害程度分级根据病斑的扩展情况确定，分级标准如下：
病级 感病程度
Ⅰ 病斑无扩展；
Ⅱ 病斑有1.03.0 mm长度范围扩展；
Ⅲ 病斑有3.16.0 mm长度范围扩展；
Ⅳ 病斑有6.19.0 mm长度范围扩展；
Ⅴ 病斑有9.1 mm以上长度范围扩展；
根据感病指数的计算结果，并结合病斑的扩张大小，将抗病品种等级划分：感病指数150，高抗；感病指数3150，中抗；感病指数5160为中感，感病指数在60以上为高感。
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选择接种炭疽病植株上的未接种叶片和未接种炭疽病植株上的正常叶片，自其嫩芽向下3050cm采集新鲜完整叶片，12个处理，每个处理15株，共180株，将相同处理叶片装入同一自封袋中，3次重复，标记，迅速带回实验室，低温-20℃保存，测前取出剪碎。
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测试POD活性采用愈创木酚氧化分光光度法进行测定，以每分钟光密度变化值(△OD470·g-1·min-1)表示酶活力大小[18-20]。CAT活性参照陈建勋等[18]、张以顺等[19]、刘萍等[20]的方法进行测定，略有改动，以每分钟光密度变化值(△OD240·g-1·min-1)表示酶活力大小[18-20]。SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法进行测定，活力大小以(△OD560·g-1)表示[2, 21]。PPO活性采用儿茶酚法进行测定，以每分钟光密度变化值(△OD525·min-1)表示酶活力大小[20]。
试剂 愈创木酚(天津市科密欧化学试剂有限公司AR 100 g)、氮蓝四唑(NBT)(南京旋光科技有限公司AR 250 mg)、儿茶酚(天津市大茂化学试剂厂AR 250 g)。
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计算酶活性发展曲线下面积(the area under enzyme activity progress curve，AUEAPC，以下简称A)，以4种酶AUEAPC的综合增长率表示防御酶系综合活性的提高程度。
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采用Excel和SPSS13.0对数据进行统计；采用R.A.Fister变异数分析法对不同油茶品种病斑长度和酶活性含量差异进行比较；采用关联分析度量酶活性与感病指数间的关联程度。
1.1. 材料
1.1.1. 供试油茶
1.1.2. 供试菌种
1.2. 方法
1.2.1. 接种
1.2.2. 感病评价
1.2.3. 取样和样品处理
1.2.4. 酶活性测试
1.3. 酶活性增长率
1.3.1. 防御酶活性诱导增长率[14]
1.3.2. 酶AUEAPC综合增长率[22]
1.4. 数据处理
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供试的6个油茶品种接种胶孢炭疽菌，感病程度略有不同，其中普通油茶、岑软2、3号油茶3个品种较陆川油茶、香花油茶、博白大果油茶3个品种感病重，病斑扩展长度较大，分别为8.01 mm、7.24 mm和7.63 mm，但差异不显著，感病指数均约在70.0左右；陆川油茶、香花油茶和博白大果油茶病斑扩展较小，其中博白大果油茶炭疽病病斑扩展最小，仅为2.62 mm，感病指数也最低，为26.9(表 1)。对接种感病后的叶片病原再分离，获得的病原菌与接种病原一致。对照处理叶片未发病。
油茶品种
Varieties病斑长度/mm
Disease Length感病指数
Disease Infected Index普通油茶Camellia oleifera 8.01±2.03a 68.8 岑软3号Cenruan 3 7.63±1.87a 74.4 岑软2号Cengruan 2 7.24±1.75a 70.6 陆川油茶C. vietnamensis 4.70±0.78b 50.0 香花油茶C.osmantha 3.98±0.72b 42.5 博白大果油茶C. gigantocarpa 2.62±0.40c 26.9 注：同一列中有不同字母的数据表示差异显著(P < 0.05)。
Note: Within the same columns, values with different superscripts letters (ac) differ (P < 0.05).Table 1. The result of Disease Infected Index
根据抗病等级划分标准，结合感病指数，将供试6个油茶品种划分为3个抗性级别，其中博白大果油茶为高抗品种，陆川及香花油茶为中抗品种，岑软2号、岑软3号、普通油茶为高感品种。
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从图 1可以看出，过氧化物酶在健康油茶植株上较感病油茶低，健康油茶过氧化物酶活性均在0.02U以下，其中普通油茶最高，陆川油茶最低，而感病后过氧化物酶活性均升高至0.03U以上，其中博白大果油茶最高；过氧化氢酶在博白大果油茶、普通油茶、香花油茶和陆川油茶感病后的植株叶片上活性较岑软3号油茶、岑软2号油茶高，其中博白大果油茶和香花油茶升高幅度最高；超氧化物歧化酶在感病后的陆川油茶植株叶片降低，普通油茶、岑软2号油茶感病后的植株叶片体内升高；多酚氧化酶在博白大果油茶、岑软2号油茶、陆川油茶感病后植株体内较岑软3号油茶、普通油茶、香花油茶高，其中博白大果油茶升高幅度最大，达12U以上。
Figure 1. The enzyme activities of Camellia oleifera in healthy and diseased
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以防御酶活性诱导增长率为评价指标进行比较(图 2)，博白大果油茶、香花油茶POD、CAT增长率均较其他品种油茶显著升高(p < 0.05)，普通油茶和岑软2号油茶4种酶诱导增长率相对其他品种低。
Figure 2. The enzyme activities growth rate of Camellia oleifera
以4种酶AUEAPC综合增长率为评价指标进行比较(图 3)，发现香花油茶、陆川油茶、博白大果油茶酶AUEAPC综合增长率均较高，达到200%以上，而岑软3号油茶和普通油茶在100%以下。
Figure 3. The AUEAPC growth rate of 4th enzyme activities
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感病指数与健康、感病油茶植株4种酶活性的相关分析见表 2。感病指数与健康油茶4种酶活性的相关性为低度或基本不相关，与感病油茶POD、CAT、PPO酶活性呈高度或中度负相关，与SOD酶活性呈高度正相关。
项目Items POD CAT SOD PPO 感病指数-健康油茶酶活性Disease Infected Index-enzyme activity of health Camellia oleifera 0.07 0.31 0.05 -0.28 感病指数-感病油茶酶活性Disease Infected Index-enzyme activity of disease Camellia oleifera -0.98 -0.96 0.86 -0.79 注：|r|>0.95存在显著性相关；|r|≥0.8高度相关；0.5≤|r| < 0.8中度相关；0.3≤|r| < 0.5低度相关；|r| < 0.3关系极弱，不相关。|r|>0.95 significant correlation；|r|≥0.8 highly correlation；0.5≤|r| < 0.8 moderate correlation；0.3≤|r| < 0.5 low correlation；|r| < 0.3 not correlation。 Table 2. The correlation of Disease Infected Index and enzyme activity
2.1. 接种结果
2.2. 酶活性
2.3. 酶活性增长率
2.4. 相关分析
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本次实验采用针刺接种法，浸染10天后油茶叶片病斑扩展出现明显差异，其中高抗品种博白大果油茶与高感品种普通油茶病斑长度差别3倍多，说明相比其他供试油茶，炭疽病菌更容易侵染普通油茶，且病斑在叶片上扩展迅速。邓艳等[2]通过对比健康油茶叶片的酶活性，认为普通油茶、陆川油茶抗病性、抗逆性较高，但是也认同病菌侵染能够更加准确判断油茶抗病性，其结果与本次实验不同。由于植物的抗病性是由多种因子共同作用的，抗病害侵染过程中需要其他重要因子参加防御体系的综合协调[23]，而通过抗病性接种也能够反映病原菌侵染的直观特征，所以开展油茶苗期炭疽病接种试验对于油茶抗性品种选育和抗性机制研究尤为重要。
感病植物酶的变化对于研究植物抗病机制具有重要作用，也是开展寄主与病原物互作研究的重要内容[24]。段琳等[25]的研究发现，健康油茶抗病性与防御酶活性关联较小，而通过接种炭疽菌可以诱导防御酶活性增加。邢会琴等[9]的研究也发现植物防御酶具有抵抗病原菌的能力，但是只有在植物遭受外界侵害后，才能表现出来。本次试验选用的6个不同抗性油茶品种，在接种炭疽病后，抗性强的博白大果油茶、陆川油茶、香花油茶过氧化物酶均较其他油茶品种明显升高，过氧化氢酶也明显升高(除岑软2号油茶外)，超氧化物歧化酶和多酚氧化酶则表现各异。油茶防御酶活性诱导增长率、酶AUEAPC综合增长率以抗性强的博白大果油茶、香花油茶、陆川油茶增长率较高，其余3种高感油茶品种相对较低。通过关联分析发现，油茶未接种炭疽病前酶活性与病斑大小、感病指数的相关性较弱，或者基本不相关，而接种炭疽病10天后，POD、CAT、PPO均与抗性呈正相关，而SOD与抗性呈负相关，相关性均在高度和中度以上。所以，本次研究也得到与郭文硕、叶建仁等[26-27]一致的结论，即健康植株防御酶活性与病害关联性较小，而受害植株防御酶活性与病害侵染明显相关。也说明病原菌的侵染能够引起不同抗病油茶品种体内防御酶活性发生明显变化，且油茶抗性与酶活性变化有规律可循。
在植物抗病评价中，通过计算感病指数能够直接反映病害侵染的速度，通过分析酶活性可以摸清健康和感病植株的防御能力，由酶活性诱导增长率、酶AUEAPC综合增长率以及关联分析能够更加准确的对病害浸染后的油茶抗性做出全面评价，也为油茶抗病性选育提供参考。
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本研究系统评价了6种供试油茶的抗炭疽病等级，分析了油茶叶片POD、CAT、SOD、PPO的活性，进行了抗炭疽病与相关酶活性的关联程度分析。研究发现了博白大果油茶为高抗品种，陆川及香花油茶为中抗品种，岑软2号、岑软3号、普通油茶为高感品种，高抗的博白大果油茶、中抗的陆川油茶和香花油茶感病后POD活性均较其他高感油茶品种明显升高，防御酶活性诱导增长率、酶AUEAPC综合增长率均以高抗油茶高于高感油茶，而健康油茶酶活性与感病指数相关性极弱或基本无关，感病后酶活性均与抗性呈一定相关性。本结论进一步明确了油茶抗炭疽病及其防御酶在抗性评价中的作用，为早期鉴别油茶抗病性并筛选抗病油茶提供参考依据。
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