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杜鹃花是世界上最著名的观赏花卉之一,因种类繁多、花美色艳而闻名于世。全世界超过1 000余种,起源于距今约6 700万年至13 700万年中生代的白垩纪;广泛分布于亚洲、欧洲和北美洲,但有2种进入北美阿拉斯加和格陵兰东部,形成分布区的北缘;有1种越过赤道达昆士兰,形成分布南界[1-3]。中国约581种,被划分为6个亚属,其中421种为特有种;主要集中于西南地区,为植物群落中常见的伴生种、优势种或建群种;云南、四川、西藏三省的高海拔山地几乎拥有中国杜鹃花种类的90%以上,有“世界杜鹃大花园”之称[3-4]。中国西南的高山、亚高山因有杜鹃花而绚丽多彩。
欧美至今流传着一句名言“没有中国的杜鹃花,就没有西方的园林”。近百年来,比利时、美国、英国、日本等通过从我国西南引进野生种,并与本地种进行杂交培育出了大量极具商品性的杜鹃新品种[5],可见,我国众多的杜鹃种质资源为世界杜鹃花育种做出了重大贡献;而我国杜鹃花育种工作进行得较晚,仅34个品种进行了登记[6]。时至今日,常规杂交育种仍是培育杜鹃花新品种的主要途径,且当前国际上杜鹃花的花色育种趋向于培育纯色花,尤其是明亮的黄色。同时,为迎合中国节日活动布置和年宵花供应所需,培育不同花期的杜鹃品种也是杜鹃花育种者的目标之一[7]。长梗杜鹃(Rhododendron longipedicellatum Lei Cai & Y.P. Ma)因其罕见的花期和纯黄色的花朵为上述育种目标提供了契机,若将其与其他优良种质进行杂交,使有益基因相互渗透,有望创制出更多市场所需的新品种,进而加快国内外杜鹃花育种产业的快速发展。
长梗杜鹃隶属类越桔杜鹃亚组,为1.0~3.3 m高的多分枝常绿灌木;其树形美观、花叶兼美,花梗长达3.0~5.5 cm;花冠鲜黄、无任何斑点。与野生杜鹃花期多集中于3~6月不同,长梗杜鹃的自然花期从11月下旬持续至翌年的2月上旬,历时3个月之久且正值春节和圣诞节[4,8],在市场上有巨大的产业发展前景。然而,其分布区极其狭窄,仅发现残存于麻栗坡县石灰岩生境的5个自然居群,植株数量不足2 000株。根据IUCN Red List Categories and Criteria (version 3.1) [9]属于极危状态[CR B1ab (ⅰ, ⅲ, ⅴ)]。
花粉是遗传信息的载体,其形态特征受核基因的控制,具有很强的遗传保守性,其固有的轮廓、外壁纹饰、萌发孔数目及位置等特征有助于解决某些植物在分类系统上的地位问题[10-11]。杂交亲本的花粉生活力高低、贮藏寿命的长短直接影响着育种的成效。为避免其盲目性,在开展杂交育种之前,对亲本材料的花粉生活力和贮藏特性进行检测尤为必要。测定杜鹃花花粉活力的染色法和液体培养基方法已有一些报道[12-14],而固体培养基法很少见。鉴于此,本研究利用光学显微镜和扫描电子显微镜对滇东南稀有濒危植物长梗杜鹃的花粉形态进行了观察;通过TTC染色法和花粉离体萌发法对长梗杜鹃的花粉生活力进行比较检测,同时研究了其在不同贮藏温度下花粉活力随贮藏时间的变化情况。本研究旨在对长梗杜鹃开花过程中的花粉活力进行快速检测,明确采粉的最佳时期,找出适合测定长梗杜鹃花粉萌发力的最佳固体培养基配方,并了解其花粉适宜的贮藏温度,为今后开展以长梗杜鹃为父本材料的杂交育种积累有用的资料;同时,也为探讨该种的起源演化和亲缘关系提供孢粉学理论依据。
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通过光学显微镜和扫描电镜观察,长梗杜鹃的花粉为复合型四合体,呈正四面体(即极面观:1粒在上3粒在下或3粒在上1粒在下)或十字形(即赤道面观:2粒在上2粒在下)排列。四合体直径43.0~65.4 μm,平均直径51.3 μm; 花粉表面具粘丝,单粒花粉近球形,均具3个子午向的孔沟,沟长9.03~23.9 μm,相对长为0.15~0.51,平均沟长和平均相对长分别为13.9 μm和0.27;沟宽3.6~8.6 μm,平均5.9 μm。相邻花粉分体上的孔沟相连,并且相通,沟通常与相邻花粉粒紧靠的一端平,向着花粉粒极面的一端尖。孔沟边缘呈加厚,沟内内含物外露,花粉分体间区为均匀的颗粒状同外壁,孔沟周围颗粒细密呈波状突起,与外壁纹饰区别明显。
花朵不同发育时期在扫描电镜下的花粉结构特征存在一定差异,而光镜下无明显不同。花蕾膨大期:四合花粉初具形状,花粉分体中部凹陷,三萌发沟可见雏形;四合体间缝浅,花粉分体间区为粗糙的聚颗粒状,有清晰裂纹;沟周围纹饰不明显(图 1: Ⅰ-1、2、3)。花瓣初开期:花粉形状趋于清晰,呈正四面体排列时为锐角三角形,单花粉粒椭圆形,四合体间缝较浅,萌发沟内出现疏松的内含物;花粉分体间区为均匀的粗颗粒状,沟周围开始加厚(图 1: Ⅱ-1、2、3)。花瓣盛开期:花粉成熟,形状饱满,呈正四面体排列时为圆角三角形;单花粉粒近球形,四合体间缝深,萌发沟内充满内含物。花粉分体间区为均匀的细颗粒状,沟周围加厚且呈波状突起(图 1: Ⅲ-1、2、3)。
光学显微镜下观察到长梗杜鹃花粉外壁为内外2层,厚度约相等为0.8~1.2 μm, 表面可见模糊的细网状雕纹(图 1: Ⅳ-1、2、3)。
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通过TTC(氯化三苯基四氮唑)染色法能使长梗杜鹃新鲜花粉在短时间内快速着色,且染色效果明显,容易区分。花粉活力检测结果见图 2。从图 2A可看出:长梗杜鹃开花当天从9:00—17:00花粉活力随着开花时间的延长逐渐递减,以9:00最高,达92.18%;17:00最低,为42.85%;17:00之后有缓慢上升的趋势。从图 2B可看出:长梗杜鹃合瓣期(开花前1~2 d)的花粉活力相对较高,为78.20%,但显著低于开花当天(Student’s t-test, t = 22.54; P<0.001);之后,随着花粉从花粉囊散出其活力逐渐下降,直至花末期(花后第9天)仍保持着较高的花粉活力(48.5%),约为最高花粉活力的一半。由此可见,整个单花花期长梗杜鹃能维持较高的花粉活力,有利于后期相关杂交育种工作的开展。
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试验观察发现:大部分培养基上的花粉培养4 h后已开始萌发,培养9 h后,2号和6号培养基上的花粉萌发量达最大,而22号和25号培养基直到26 h后花粉萌发数才达到稳定。L25(53)正交试验各培养基组合的花粉萌发率差异较大(表 1),以100 g·L-1蔗糖+ 200 mg·L-1 H3BO3+ 0 mg·L-1 CaCl2培养基配方培养17 h的萌发率最高(达90.26%)。对表 1中的数据进行极差分析,表明3因素的主次顺序为:蔗糖→ CaCl2→ H3BO3,极差分别为2.36, 0.92和0.88,相对应的最佳蔗糖因子为A3 (k3 = 3.72), H3BO3为B4 (k4 = 3.35), CaCl2为C1 (k1 = 2.93),即适宜的蔗糖和H3BO3浓度组合最有利于长梗杜鹃的花粉萌发,而CaCl2的添加显著抑制了其萌发。蔗糖作为影响长梗杜鹃花粉萌发率高低的决定因素,随其浓度的增加,萌发率呈现出先增后减的趋势,且以100 g·L-1为最适浓度,当浓度达到300 g·L-1时,花粉萌发率下降,萌发所需时间延长,部分培养基花粉管先端出现破裂现象;H3BO3的促萌效果虽不如蔗糖显著,但在一定程度上也促进了其花粉萌发。此外,蔗糖、H3BO3以及CaCl2都并非是长梗杜鹃花粉萌发的必要条件,在仅含10 g·L-1的琼脂培养基中仍有22.54%的萌发率。
试验号
No.蔗糖
Sucrose/(g·L-1)硼酸
H3BO3/ (mg·L-1)二氯化钙
CaCl2 /(mg·L-1)萌发率
Germination rate/%1 0 0 0 22.54±1.59c 2 0 50 50 71.06±1.72mn 3 0 100 150 58.73±1.20j 4 0 200 250 74.32±1.58n 5 0 300 350 43.21±1.72g 6 50 0 50 78.44±1.40o 7 50 50 150 69.38±3.16lm 8 50 100 250 63.82±1.27k 9 50 200 350 68.27±1.65lm 10 50 300 0 74.05±1.52n 11 100 0 150 78.22±1.13o 12 100 50 250 85.90±1.41p 13 100 100 350 46.72±1.47h 14 100 200 0 90.26±1.92q 15 100 300 50 70.48±1.75lm 16 150 0 250 53.20±0.96i 17 150 50 350 67.58±0.94l 18 150 100 0 87.52±1.43pq 19 150 200 50 87.94±0.95pq 20 150 300 150 32.71±1.62e 21 300 0 350 40.36±1.68g 22 300 50 0 18.57±1.37b 23 300 100 50 36.65±1.51f 24 300 200 150 13.86±0.77a 25 300 300 250 25.90±1.53d 注:同列数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
Note: Different small letters in each column indicate significant difference at P<0.05 level.Table 1. The germination rate of R. longipedicellatum pollen grains in L25(53) orthogonal experiment
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试验对长梗杜鹃在室温(20~25℃)、4℃和-18℃ 3个贮藏温度下不同贮藏时间的花粉萌发率进行了测定,结果(图 3)表明:随着贮藏天数的增加,3个温度下的花粉萌发率均呈逐步下降的趋势。在室温条件下,长梗杜鹃花粉萌发率下降最迅速,在第8天,已降至较低水平(18.86%),至第12天,其萌发率已低于5%,基本不能再用作父本进行杂交授粉(图 3A)。4℃和-18℃低温条件下其萌发率下降较缓慢,在贮藏的前12天,4℃的贮藏效果稍好一些,但在第24天萌发率出现较大降幅,至第36天仍有13.21%的萌发率;而-18℃保存的花粉直到第36天才出现较大降幅,在第48天仍有9.65%的萌发率(图 3B)。因此,适宜长梗杜鹃花粉贮藏的温度为-18℃,其次是4℃,即一定的低温有利于延长其花粉寿命。