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象甲科Curculionidae在鞘翅目昆虫中种间变异程度极其复杂,不同地区受到环境、植被等因子的影响往往出现与各区系生态环境相适应的象虫种类[1]。象甲科昆虫均为植食性害虫,幼虫和成虫对寄主植物的根、茎、叶、花、果、种子、幼芽和嫩梢等部位均有不同程度的危害,其中幼虫阶段长期蛀食植物内部,破坏输导组织,危害最为严重[2]。香樟齿喙象(Pagiophloeus tsushimanus)隶属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae魔喙象亚科Molytinae树皮象族Hylobiini齿喙象属Pagiophloeus[3-4],是一种重要的钻蛀性害虫。分布于我国(上海和福建)和日本,2014年首次报道其在上海危害香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl),且被鉴定为中国新记录种[3]。以幼虫钻蛀香樟主干和侧枝的韧皮部和木质部,常常导致树势衰弱,生长不良,易受其他病虫害的侵害[5]。
随着分子系统学研究的逐步深入,通过分子生物信息学对物种分类地位进行鉴定的分析技术日趋成熟。分子系统学的研究主要是依据DNA和蛋白质序列,其主要原理是通过分子遗传标记,将各物种进行系统分析,以此探讨各物种在遗传进化中的分类地位。常用的分子标记主要有进化速率快,具有母系遗传,几乎不发生重组的核外线粒体DNA中细胞色素氧化酶第亚基(Ctyochrome oxidase subunit Ⅰ)[6-7],以及进化速率较慢,各区保守性不同的核内核糖体DNA(Ribosomal DNA, rDNA)[8]。但是无论是以线粒体基因还是核基因作为标记,都有各自的优缺点,不能全面反映物种间的真实进化关系,因此联合基因的应用已成为研究昆虫分子系统发育学领域的一种发展趋势。COⅠ基因与rDNA基因的进化速率不同,适用于不同的分类阶元,因此可以相互弥补和验证,从而更全面、准确的反映系统发育关系。Malvadi利用18S rDNA构建了象虫总科Curculionoidea的系统发育树,并提出18S rDNA的部分序列适用于科级以上阶元的分类[9-11]。黄华平等根据国内外研究结果对常用的几种分子标记的特点、适用范围进行了总结[12]。张健等分别用线粒体16S rDNA和核糖体28S rDNA为分子标记对天牛亚科Cerambycinae间系统发育关系做了系统研究,分析了天牛亚科Cerambycinae的进化关系[13-14]。近几年,国内利用分子生物学对部分象甲科昆虫的系统进化分析也取得了一定成果,王志良和张润志曾结合已有研究,通过传统形态学结合分子生物学方法,综合比较小蠹亚科Scolytinae分类地位,认同小蠹亚科是象甲科的一个亚科的结论[15]。栾丰刚等通过对COⅠ基因标记分析萧氏松茎象(Hylobitelus xiaoi)的分类地位,为萧氏松茎象的鉴定提供了可靠的分子生物学依据[16]。
本研究通过对香樟齿喙象成虫的线粒体COⅠ基因和核糖体18S rDNA、28S rDNA进行测序分析,与GenBank已有的象甲科昆虫的相关基因序列比对,探讨研究香樟齿喙象在象甲总科中的系统进化关系,为分子鉴定、生物学、生态学及防治技术等研究提供参考依据。
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供试昆虫:香樟齿喙象(P. tsushimanus)的成虫采自上海市松江区泖冈镇香樟(C. camphora(L.)Presl)人工林,将采集的成虫置于100%的乙醇溶液中,带回室内于-20℃冰箱保存备用。
主要试剂:DNA提取试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA聚合酶、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,基因克隆相关试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
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采用磁珠法提取基因组DNA:取虫体约30 g,用双蒸水冲洗去除残留乙醇后,将组织进行研磨,加入适量的裂解液及蛋白酶K,随后根据基因组提取试剂盒(上海生工)进行操作,利用Nano Drop 1 000紫外分光光度计(Thermo Scientific,America)和琼脂糖凝胶电泳对所抽提出的总DNA进行浓度和纯度(OD260/280)检测,检测合格的DNA置于-20℃保存备用。
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COⅠ引物参照Loxdale等[17]合成:C1-J-1718(5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTGTTCC-3′)和C1-N-2191(5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′);18S rDNA V4区和V7区的扩增引物片段参照Raupach等[18]:CV4F(5′-TGGTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和CV4R(5′-CCTCTAACGTCGCAATACGAATGCCC-3′),CV7F(5′-CTTAAAGGAATTGACGGAGGGCACCACC-3′)和CV7R(5′-GATTCCTTCAGTGTAGCGCGCGTG-3′)及28S rDNA D2区基因序列的引物参照Gillespie等[19]:D2F(5′-GGACCCGTCTTGAAACAC-3′)和D2R(5′-GCATAGTTCACCATCTTTC-3′)。
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PCR反应体系含10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP 4.0 μL、DNA模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、无菌水补至50 μL。PCR条件为:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,循环35次,72℃充分延伸7 min。将PCR扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳上检测并回收,回收产物与pEASY®-T1载体连接,转化大肠杆菌Trans1-T1,涂布过夜培养后筛选出阳性克隆,送至上海杰李生物技术有限公司测序。
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利用软件MEGA 5.1[20]和SeqMan[21],进行序列的拼接与比对,确保获得目的基因片段。拼接好的序列提交NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源性比对,防止外源基因的污染,并获得近缘种的COⅠ和rDNA基因序列(表 1)。并选取鞘翅目中与象甲科亲缘关系较为接近的种作为外种群,以避免构建进化树时产生长枝吸引现象[22]。将所得序列载入软件Clustal X 1.83[23]进行比对,比对结果导入MEGA 5.1[20],计算序列间的遗传距离并进行碱基替换饱和度分析。分别采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和邻接法(neighbor joining,NJ)构建系统发育树。
科/亚科
family/subfamilyCOⅠ种
species登录号
accession number科/亚科
family/subfamily18S rDNAV4
种species登录号
accession numberCryptorhynchinae Kyklioacalles provincialis GU987894.1 Curculioninae Eusomus ovulum JN619090.1 Magdalinae Magdalis ruficornis KJ962562.1 Curculioninae Acalles ptinoides AJ850002.1 Ceutorhynchinae Ceutorhynchus gallorhenanus DQ058700.1 Curculioninae Cleopomiarus meridionalis JX091170.1 Entiminae Naupactus ambiguus AY790879.1 Molytinae Calvertius tuberosus AF389070.1 Baridinae Baris picicornis KM439312.1 Entiminae Polydrusus sericeus AF250086.2 Ceutorhynchinae Ceutorhynchus rapae DQ058702.1 Molytinae Tranes lyterioides KP419321.1 Ceutorhynchinae Ceutorhynchus erysimi DQ058698.1 Molytinae Sympiezoscelus spencei KP419304.1 Scolytinae Xylocleptes adeniae JX263819.1 Scolytinae Ips lecontei KJ531085.1 Entiminae Galapaganus ashlocki AF211488.1 Scolytinae Ips pini KJ531081.1 Baridinae Brachypera zoilus KM447815.1 Scolytinae Ips typographus KJ531078.1 Hyperinae Hypera postica KU188400.1 Cyclominae Talaurinus subvittatus AF389054.1 Hyperinae Hypera diversipunctata KR487166.1 Scolytinae Pityokteines minutus AF308342.1 Molytinae Hylobitelus xiaoi KC476444.1 Curculioninae Rhinusa bipustulata JX091146.1 Molytinae Hylobius abietis EF450122.1 Curculioninae Rhinusa neta JX091122.1 Cerambycidae Desisa variabilis FJ559008.1 Entiminae Barypeithes pellucidus JN619047.1 Scolytinae Hylesinus varius KC845462.1 Lamiinea Anoplophora-glabripennis KF142077.1 Lepturinae Nanostrangalia chujoi FJ559029.1 Lamiinea Anoplophora chinensis KF141949.1 Entiminae Naupactus dissimulator JX440497.1 Lamiinea Monochamus alternatus KF141961.1 Ceutorhynchinae Ceutorhynchus fallax DQ058699.1 Entiminae Pachylobius picivorus AF250103.2 科/亚科
family/subfamily18S rDNAV7
种species登录号
accession number科/亚科
family/subfamily28S rDNAD2
种species登录号
accession numberCryptorhynchinae Acalles ptinoides AJ850002.1 Entiminae Trichalophus caudiculatus KU748546.1 Hyperinae Hypera postica JX239438.1 Curculionidae Aesiotes notabilis FJ867654.1 Entiminae Sciaphilus asperatus JN619105.1 Scolytinae Ambrosiodmus aegir FJ867655.1 Magdalinae Magdalis barbicornis JN619019.1 Brentidae Aporhina australis FJ867657.1 Cryptorhynchinae Bepharus ellipticus FJ867740.1 Cossoninae Araucarietius viridans FJ867658.1 Entiminae Meira crassicornis DQ337113.1 Curculioninae Curculio niveopictus FJ867675.1 Chrysomelidae Lilioceris merdigera AJ841445.1 Curculioninae Eisingius chusqueae FJ867680.1 Curculioninae Gymnetron antirhini AJ850004.1 Curculionidae Gymnetron tetrum FJ867684.1 Entiminae Sitona striatellus AJ849997.1 Curculioninae Myrmex floridanus FJ867694.1 Curculionidae Chrysolopus spectabilis FJ867745.1 Entiminae Sitona hispidulus FJ867710.1 Chrysomelidae Aulacoscelis appendiculata AJ841524.1 Molytinae Hylobius piceus HQ883576.1 Curculioninae Curculio glandium KP419065.1 Molytinae Hylobius abietis JN544547.1 Ceutorhynchinae Ceutorhynchus scrobicollis JX091171.1 Curculioninae Curculio lateritius AB573462.1 Curculionidae Philopedon plagiatum JN619148.1 Scolytinae Pityokteines curvidens KJ531136.1 Cossoninae Araucarius minor AF308304.1 Brachyceridae Notaris acridulus KP419545.1 Curculionidae Hypera nigrirostris AJ850005.1 Molytinae Tranes lyterioides KP419676.1 Lamiinea Anoplophora chinensis KF142013.1 Lamiinea Anoplophora glabripennis KF142077.1 Lamiinea Anoplophora glabripennis KF142012.1 Lamiinea Anoplophora chinensis KF142078.1 Lamiinea Monochamus alternatus KF142025.1 Lamiinea Monochamus alternatus KF142090.1 Table 1. GenBank accession numbers of COⅠ, 18S rDNA (V4 and V7), 28S rDNA (D2) sequences used in phylogenetic tree
1.1. 供试昆虫及试剂
1.2. 基因组DNA提取
1.3. PCR扩增和测序
1.3.1. 引物设计
1.3.2. PCR扩增及测序
1.4. 序列处理及分析
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PCR电泳结果如图 1所示,用4对引物扩增后均获得单一条带,对扩增产物进行克隆和测序,结果为:COⅠ片段长523 bp,18S rDNA的V4和V7区分别为387 bp、352 bp,28S rDNA D2区序列长447 bp。
利用MEGA 5.1进行比对与序列分析,比对筛选到的(COⅠ 20种、18S rDNA V4区20种及V7区20种、28S rDNA D2区20种)共涉及到鞘翅目象甲科(包括外缘3个科)16个亚科,24个属,70种,删除进化速度快的序用于序列分析,COⅠ序列碱基A、T(U)、C、G的平均含量分别为30.68%、36.08%、14.98%和18.26%。系统发育除28S rDNA外均无碱基插入或缺失现象。COⅠ的444个核苷酸中变异位点209个,占全部位点的47.1%,简约信息位点178个,占全部位点的40.1%。最大似然法估计转换(Transition)/颠换(Transversion)的R值为0.832,转换小于颠换;18S rDNA V4和V7区碱基A、T(U)、C、G的平均含量分别为21.75%、27.41%、28.72%、22.12%和20.45%、26.73%、29.45%、23.72%。18SrDNA V4和V7区系统发育分析的位点分别为340和351,变异位点分别为18个和21,分别占全部位点的5.3%和6.0%,简约信息位点15和14个,分别占全部位点的4.4%和4.0%。最大似然法估计转换(transition)/颠换(transversion)的R值为6.75和2.86,转换大于颠换;28SrDNAD2区碱基A、T(U)、C、G的平均含量分别为15.64%、22.25%、32.68%、29.43%。28S rDNA D2区系统发育分析的位点为461,变异位点为182个,占全部位点的39.5%,简约信息位点125个,占全部位点的27.1%。最大似然法估计转换/颠换的R值为1.723,转换大于颠换。
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用MEGA5.1计算获得香樟齿喙象COⅠ序列和其他象甲科昆虫及外种群的非校正P距离(见表 2~5),得到香樟齿喙象与欧洲松树皮象Hylobius abietis和Kyklioacalles provincialis遗传距离最为接近均为0.151。其次与Naupactus ambiguus的遗传距离为0.153。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 0.016 0.016 0.018 0.017 0.016 0.017 0.018 0.017 0.017 0.019 0.018 0.018 0.017 0.018 0.017 0.017 0.018 0.017 0.020 2 0.151 0.015 0.018 0.017 0.016 0.018 0.017 0.017 0.017 0.018 0.018 0.018 0.017 0.019 0.016 0.017 0.017 0.017 0.018 3 0.153 0.153 0.019 0.018 0.017 0.019 0.017 0.017 0.017 0.019 0.018 0.017 0.017 0.018 0.018 0.018 0.018 0.017 0.020 4 0.182 0.194 0.200 0.018 0.018 0.015 0.019 0.019 0.019 0.013 0.017 0.019 0.019 0.019 0.018 0.018 0.018 0.018 0.019 5 0.153 0.185 0.182 0.191 0.018 0.019 0.019 0.018 0.017 0.019 0.018 0.019 0.017 0.019 0.019 0.018 0.018 0.019 0.020 6 0.158 0.160 0.185 0.205 0.207 0.019 0.016 0.017 0.018 0.018 0.019 0.018 0.017 0.017 0.018 0.018 0.018 0.017 0.019 7 0.189 0.196 0.196 0.133 0.200 0.205 0.019 0.018 0.019 0.016 0.016 0.018 0.018 0.018 0.017 0.017 0.017 0.018 0.019 8 0.171 0.185 0.162 0.200 0.207 0.164 0.200 0.018 0.018 0.018 0.019 0.016 0.018 0.018 0.018 0.019 0.019 0.018 0.019 9 0.167 0.185 0.178 0.200 0.194 0.176 0.205 0.198 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.019 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 10 0.167 0.191 0.178 0.196 0.153 0.187 0.214 0.185 0.203 0.019 0.019 0.019 0.017 0.018 0.017 0.018 0.018 0.017 0.019 11 0.194 0.209 0.212 0.077 0.198 0.207 0.151 0.194 0.191 0.203 0.017 0.018 0.018 0.019 0.018 0.018 0.018 0.018 0.019 12 0.196 0.178 0.185 0.144 0.198 0.209 0.149 0.196 0.176 0.203 0.158 0.019 0.019 0.018 0.018 0.018 0.019 0.019 0.019 13 0.178 0.205 0.185 0.212 0.200 0.180 0.212 0.149 0.194 0.214 0.212 0.198 0.018 0.018 0.019 0.019 0.018 0.018 0.020 14 0.187 0.200 0.182 0.203 0.169 0.200 0.194 0.185 0.178 0.162 0.198 0.207 0.189 0.017 0.018 0.018 0.017 0.017 0.019 15 0.176 0.203 0.196 0.196 0.194 0.182 0.189 0.178 0.218 0.189 0.209 0.180 0.191 0.178 0.015 0.015 0.018 0.017 0.019 16 0.173 0.151 0.182 0.205 0.189 0.185 0.203 0.189 0.203 0.178 0.214 0.182 0.214 0.180 0.122 0.007 0.019 0.017 0.019 17 0.169 0.149 0.187 0.198 0.185 0.182 0.200 0.191 0.209 0.189 0.214 0.187 0.207 0.180 0.128 0.027 0.018 0.018 0.020 18 0.182 0.160 0.200 0.216 0.200 0.187 0.203 0.207 0.198 0.198 0.225 0.200 0.200 0.180 0.191 0.189 0.185 0.014 0.019 19 0.151 0.155 0.160 0.203 0.210 0.169 0.194 0.185 0.185 0.176 0.216 0.185 0.185 0.171 0.180 0.173 0.178 0.097 0.018 20 0.227 0.221 0.236 0.234 0.223 0.212 0.225 0.200 0.169 0.232 0.230 0.218 0.221 0.203 0.207 0.216 0.225 0.216 0.194 1 (Pagiophloeus tsushimanus); 2 (Kyklioacalles provincialis); 3 (Magdalis ruficornis); 4 (Ceutorhynchus gallorhenanus); 5 (Naupactus ambiguus); 6 (Baris picicornis); 7 (Ceutorhynchus rapae); 8 (Hylesinus varius); 9 (Nanostrangalia chujoi); 10 (Naupactus dissimulator); 11 (Ceutorhynchus fallax); 12 (Ceutorhynchus erysimi); 13 (Xylocleptes adeniae); 14 (Galapaganus ashlocki); 15 (Brachypera zoilus); 16 (Hypera postica); 17 (Hypera diversipunctata); 18 (Hylobitelus xiaoi); 19 (Hylobius abietis); 20 (Desisa variabilis). Table 2. p-Distance of COⅠ gene in 20 specie (lower triangle) and standard errors (up triangle)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 0.004 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.011 0.011 0.011 2 0.006 0.004 0.004 0.005 0.005 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.007 0.006 0.006 0.006 0.007 0.010 0.010 0.010 3 0.012 0.006 0.000 0.003 0.003 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.005 0.004 0.005 0.005 0.006 0.009 0.009 0.009 4 0.012 0.006 0.000 0.003 0.003 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.005 0.004 0.005 0.005 0.006 0.009 0.009 0.009 5 0.015 0.009 0.003 0.003 0.004 0.005 0.005 0.005 0.003 0.003 0.003 0.005 0.005 0.004 0.004 0.006 0.009 0.009 0.009 6 0.015 0.009 0.003 0.003 0.006 0.005 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.006 0.005 0.004 0.004 0.005 0.008 0.008 0.008 7 0.012 0.012 0.006 0.006 0.009 0.009 0.005 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.010 0.010 0.010 8 0.018 0.012 0.006 0.006 0.009 0.003 0.012 0.004 0.004 0.004 0.004 0.006 0.005 0.005 0.005 0.006 0.008 0.008 0.008 9 0.018 0.012 0.006 0.006 0.009 0.003 0.012 0.006 0.004 0.004 0.004 0.005 0.006 0.005 0.005 0.005 0.008 0.008 0.008 10 0.018 0.012 0.006 0.006 0.003 0.003 0.012 0.006 0.006 0.000 0.000 0.006 0.005 0.003 0.003 0.005 0.008 0.008 0.008 11 0.018 0.012 0.006 0.006 0.003 0.003 0.012 0.006 0.006 0.000 0.000 0.006 0.005 0.003 0.003 0.005 0.008 0.008 0.008 12 0.018 0.012 0.006 0.006 0.003 0.003 0.012 0.006 0.006 0.000 0.000 0.006 0.005 0.003 0.003 0.005 0.008 0.008 0.008 13 0.018 0.018 0.012 0.012 0.009 0.015 0.012 0.018 0.012 0.012 0.012 0.012 0.007 0.005 0.005 0.003 0.009 0.009 0.009 14 0.018 0.012 0.006 0.006 0.009 0.009 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 0.012 0.018 0.006 0.006 0.007 0.008 0.008 0.008 15 0.021 0.015 0.009 0.009 0.006 0.006 0.015 0.009 0.009 0.003 0.003 0.003 0.009 0.015 0.000 0.004 0.009 0.009 0.009 16 0.021 0.015 0.009 0.009 0.006 0.006 0.015 0.009 0.009 0.003 0.003 0.003 0.009 0.015 0.000 0.004 0.009 0.009 0.009 17 0.021 0.021 0.015 0.015 0.012 0.012 0.015 0.015 0.009 0.009 0.009 0.009 0.003 0.021 0.006 0.006 0.009 0.009 0.009 18 0.041 0.035 0.029 0.029 0.032 0.026 0.035 0.029 0.024 0.029 0.029 0.029 0.035 0.024 0.032 0.032 0.032 0.000 0.000 19 0.041 0.035 0.029 0.029 0.032 0.026 0.035 0.029 0.024 0.029 0.029 0.029 0.035 0.024 0.032 0.032 0.032 0.000 0.000 20 0.041 0.035 0.029 0.029 0.032 0.026 0.035 0.029 0.024 0.029 0.029 0.029 0.035 0.024 0.032 0.032 0.032 0.000 0.000 1 (Pagiophloeus tsushimanus); 2 (Pachylobius picivorus); 3 (Eusomus ovulum); 4 (Acalles ptinoides); 5 (Cleopomiarus meridionalis); 6 (Calvertius tuberosus); 7 (Polydrusus sericeus); 8 (Tranes lyterioides); 9 (Sympiezoscelus pencei); 10 (Ips lecontei); 11 (Ips pini); 12 (Ips typographus); 13 (Talaurinus subvittatus); 14 (Pityokteines minutus); 15 (Rhinusa bipustulata); 16 (Rhinusa neta); 17 (Barypeithes pellucidus); 18 (Anoplophora glabripennis); 19 (Anoplophora chinensis); 20 (Monochamus alternatus). Table 3. p-Distance of 18S rDNA V4 gene in 20 specie (lower triangle) and standard errors (up triangle)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 0.008 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.006 0.005 0.005 0.005 0.007 0.006 0.005 0.006 0.006 0.006 0.005 0.009 0.009 2 0.026 0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 0.006 0.008 0.008 0.008 0.006 0.008 0.008 0.009 0.009 0.008 0.008 0.006 0.007 3 0.011 0.026 0.000 0.004 0.004 0.000 0.007 0.004 0.004 0.006 0.007 0.005 0.004 0.003 0.003 0.003 0.005 0.010 0.009 4 0.011 0.026 0.000 0.004 0.004 0.000 0.007 0.004 0.004 0.006 0.007 0.005 0.004 0.003 0.003 0.003 0.005 0.010 0.009 5 0.011 0.026 0.006 0.006 0.000 0.004 0.007 0.000 0.004 0.005 0.007 0.005 0.004 0.003 0.005 0.005 0.003 0.010 0.009 6 0.011 0.026 0.006 0.006 0.000 0.004 0.007 0.000 0.004 0.005 0.007 0.005 0.004 0.003 0.005 0.005 0.003 0.010 0.009 7 0.011 0.026 0.000 0.000 0.006 0.006 0.007 0.004 0.004 0.006 0.007 0.005 0.004 0.003 0.003 0.003 0.005 0.010 0.009 8 0.014 0.014 0.017 0.017 0.017 0.017 0.017 0.007 0.007 0.008 0.000 0.007 0.006 0.007 0.007 0.007 0.006 0.007 0.006 9 0.011 0.026 0.006 0.006 0.000 0.000 0.006 0.017 0.004 0.005 0.007 0.005 0.004 0.003 0.005 0.005 0.003 0.010 0.009 10 0.011 0.026 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.017 0.006 0.005 0.007 0.005 0.004 0.005 0.005 0.005 0.005 0.010 0.009 11 0.011 0.026 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.020 0.011 0.011 0.008 0.005 0.005 0.006 0.006 0.006 0.005 0.009 0.010 12 0.017 0.014 0.017 0.017 0.017 0.017 0.017 0.000 0.017 0.017 0.023 0.007 0.006 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.006 13 0.014 0.023 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009 0.020 0.009 0.009 0.009 0.020 0.005 0.005 0.006 0.005 0.005 0.010 0.009 14 0.011 0.023 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.014 0.006 0.006 0.011 0.014 0.009 0.005 0.005 0.004 0.005 0.010 0.009 15 0.014 0.029 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.020 0.003 0.009 0.014 0.020 0.011 0.009 0.004 0.004 0.004 0.010 0.009 16 0.014 0.029 0.003 0.003 0.009 0.009 0.003 0.020 0.009 0.009 0.014 0.020 0.011 0.009 0.006 0.004 0.006 0.010 0.009 17 0.014 0.026 0.003 0.003 0.009 0.009 0.003 0.017 0.009 0.009 0.014 0.017 0.011 0.006 0.006 0.006 0.005 0.010 0.009 18 0.009 0.026 0.009 0.009 0.003 0.003 0.009 0.014 0.003 0.009 0.009 0.017 0.011 0.009 0.006 0.011 0.009 0.009 0.009 19 0.032 0.011 0.037 0.037 0.037 0.037 0.037 0.017 0.037 0.037 0.031 0.020 0.034 0.034 0.040 0.040 0.037 0.032 0.006 20 0.032 0.020 0.032 0.032 0.032 0.032 0.032 0.014 0.032 0.032 0.037 0.014 0.034 0.029 0.034 0.034 0.032 0.032 0.014 1 (Pagiophloeus tsushimanus); 2 (Anoplophora chinensis); 3 (Hypera postica); 4 (Sciaphilus asperatus); 5 (Magdalis barbicornis); 6 (Bepharus ellipticus); 7 (Meira crassicornis); 8 (Lilioceris merdigera); 9 (Gymnetron antirhini); 10 Sitona striatellus); 11 (Chrysolopus spectabilis); 12 (Aulacoscelis appendiculata); 13 (Curculio glandium); 14 (Ceutorhynchus scrobicollis); 15 (Philopedon plagiatum); 16 (Araucarius minor); 17 (Hypera nigrirostris); 18 (Acalles ptinoides); 19 (Anoplophora glabripennis); 20 (Monochamus alternatus). Table 4. p-distance of 18S rDNA V7 gene in 20 species (lower triangle) and standard errors (up triangle)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 0.015 0.017 0.017 0.016 0.015 0.016 0.016 0.017 0.017 0.017 0.009 0.009 0.016 0.019 0.019 0.019 0.018 0.017 0.014 2 0.087 0.012 0.015 0.016 0.012 0.014 0.014 0.014 0.016 0.015 0.015 0.015 0.014 0.019 0.020 0.019 0.018 0.014 0.013 3 0.133 0.080 0.010 0.015 0.013 0.015 0.014 0.015 0.017 0.010 0.017 0.017 0.014 0.018 0.019 0.018 0.019 0.013 0.013 4 0.142 0.113 0.050 0.016 0.015 0.017 0.016 0.015 0.017 0.002 0.017 0.017 0.016 0.019 0.020 0.019 0.019 0.013 0.014 5 0.129 0.115 0.115 0.124 0.017 0.017 0.018 0.018 0.019 0.016 0.016 0.016 0.017 0.018 0.019 0.018 0.017 0.015 0.016 6 0.100 0.065 0.073 0.098 0.138 0.012 0.011 0.013 0.014 0.015 0.016 0.016 0.011 0.019 0.020 0.020 0.019 0.015 0.012 7 0.121 0.092 0.108 0.130 0.139 0.068 0.014 0.015 0.017 0.017 0.016 0.016 0.009 0.019 0.019 0.020 0.018 0.015 0.013 8 0.123 0.095 0.101 0.117 0.163 0.050 0.088 0.013 0.017 0.016 0.017 0.017 0.015 0.019 0.020 0.020 0.019 0.016 0.013 9 0.139 0.085 0.114 0.123 0.163 0.080 0.115 0.081 0.018 0.015 0.018 0.018 0.015 0.019 0.020 0.020 0.017 0.016 0.014 10 0.145 0.133 0.145 0.145 0.181 0.111 0.156 0.154 0.174 0.017 0.018 0.018 0.017 0.020 0.021 0.020 0.017 0.018 0.016 11 0.139 0.111 0.047 0.002 0.122 0.096 0.132 0.115 0.120 0.145 0.017 0.017 0.016 0.019 0.020 0.019 0.018 0.013 0.014 12 0.036 0.102 0.134 0.136 0.131 0.115 0.128 0.144 0.161 0.157 0.139 0.000 0.016 0.019 0.019 0.019 0.018 0.017 0.015 13 0.036 0.102 0.134 0.136 0.130 0.115 0.128 0.144 0.160 0.157 0.139 0.000 0.016 0.019 0.019 0.018 0.018 0.017 0.015 14 0.104 0.080 0.093 0.111 0.134 0.050 0.032 0.087 0.101 0.138 0.114 0.108 0.108 0.020 0.020 0.020 0.018 0.015 0.012 15 0.211 0.202 0.179 0.184 0.191 0.206 0.209 0.209 0.206 0.231 0.187 0.205 0.204 0.202 0.004 0.012 0.020 0.018 0.019 16 0.213 0.204 0.181 0.187 0.194 0.208 0.212 0.211 0.209 0.233 0.189 0.207 0.207 0.202 0.007 0.012 0.020 0.019 0.019 17 0.215 0.202 0.186 0.187 0.182 0.213 0.212 0.236 0.221 0.238 0.189 0.205 0.204 0.202 0.070 0.073 0.019 0.019 0.019 18 0.166 0.165 0.179 0.173 0.166 0.166 0.172 0.175 0.158 0.165 0.171 0.174 0.173 0.151 0.233 0.235 0.233 0.018 0.017 19 0.126 0.097 0.080 0.094 0.104 0.107 0.117 0.118 0.132 0.170 0.092 0.138 0.137 0.109 0.196 0.199 0.203 0.172 0.014 20 0.089 0.072 0.078 0.091 0.127 0.068 0.082 0.074 0.090 0.137 0.088 0.099 0.099 0.072 0.187 0.189 0.204 0.135 0.094 1 (Pagiophloeus tsushimanus); 2 (Trichalophus caudiculatus); 3 (Aesiotes notabilis); 4 (Ambrosiodmus aegir); 5 (Aporhina australis); 6 (Araucarietius viridans); 7 (Curculio niveopictus); 8 (Eisingius chusqueae); 9 (Gymnetron tetrum); 10 (Myrmex floridanus); 11 (Sitona hispidulus); 12 (Hylobius piceus); 13 (Hylobius abietis); 14 (Curculio lateritius); 15 (Anoplophora glabripennis); 16 (Anoplophora chinensis); 17 (Monochamus alternatus); 18 (Pityokteines curvidens); 19 (Notaris acridulus); 20 (Tranes lyterioides). Table 5. p-Distance of 28S rDNA D2 gene in 20 species (lower triangle) and standard errors (up triangle)
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从表 2和表 3可以看出,香樟齿喙象18S rDNA V4区序列与Pachylobius picivorus遗传距离最为接近(0.006),其次是Eusomus ovulum、Acalles ptinoides和Polydrusus sericeus,均为0.012,而V7区序列遗传距离最近的是Acalles ptinoides,遗传距离0.009,其次是Hypera postica、Sciaphilu asperatus、Magdalis barbicornis、Bepharus ellipticus、Meira crassicornis、Gymnetron antirhini、Sitona striatellus、Chrysolopus spectabilis,遗传距离均为0.011。
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28S rDNA比对到的近缘种中遗传距离最近的是欧洲松树皮象、Hylobius piceus(0.036),其次是Trichalophus caudiculatus和Tranes lyteroides,遗传距离分别是0.087和0.089。
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由于COⅠ、18S rDNA(V4、V7)、28S rDNA(D2)序列分析的碱基置换度不同,因此在构建进化树前需要进行碱基置换饱和度分析,确保序列可以用于进化分析。以p距离作为横坐标,以碱基置换度作为纵坐标构建散点图(图 2),进行饱和度分析。其中COⅠ基因的检测样本中,随着样本间遗传距离(p-distance)的增大,碱基替换表现出不同的变化规律,碱基颠换与遗传距离呈明显线性关系,即随着遗传距离的增加,mtDNA COⅠ基因序列碱基转换和颠换数均呈直线增加;碱基颠换数则随着遗传距离的增加在0.14左右时超过转换数。总体上mtDNA COⅠ基因序列碱基替换数与遗传距离呈显著的线性关系,表明香樟齿喙象等象甲科昆虫种间及种内的mtDNA COⅠ基因的遗传变异丰富,该基因在物种进化中存在着巨大的进化潜能。18S rDNA的V4和V7区,保守性较强,随着遗传距离的增加,碱基的颠换值趋于饱和,但碱基转换与p距离成线性关系,碱基突变未达到饱和,适用于进化树的构建。28S rDNA D2区转换与颠换值与p距离均呈线性关系,碱基突变未达饱和,进化中存在着巨大的进化潜能,适用于进化树的构建。
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分别采用最大似然法、邻接法对香樟齿喙象扩增的四个序列片段构建系统发育树。通过比较COⅠ与rDNA的进化树发现,两种方法构建的进化树中,COⅠ序列均和外源种形成两个独立分支,且在象甲科群系里香樟齿喙象与隐喙象亚科Cryptorhynchinae的Kyklioacalles provincialis和大盾象象亚科Magdalinae的Magdalis ruficornis聚为一个群系,随即又与萧氏松茎象以及欧洲松树皮象形成的节点聚在一起,但这一分支的置信度远低于70%,与距离最远的是以鞘翅目为第二大分支的外源种群,即天牛亚科Cerambycinae的斑纹锈天牛Desisa variabilis和连纹小花天牛Nanostrangalia chujoi,外源种群的比对能更直观、系统地体现香樟齿喙象的进化关系,同时避免产生长枝吸引现象。18S rDNA序列无插入缺失现象,相较于COⅠ基因序列保守,变异程度相对较低,在V4区序列构建的进化树中,与鞘翅目中的天牛科分化明显,并且与P. picivorus聚为一支,且置信度较高,最大似然法为76%、邻接法(NJ)为78%。V7区序列构建的进化树中,香樟齿喙象与所有的象甲科种类聚在一起,与天牛科分化明显,遗传距离最远,香樟齿喙象以及其它象甲科种类形成的一个大支与隐喙象亚科的Lilioceris merdigera和Aulacoscelis appendiculata形成姊妹分支。28S rDNA D2区在进行比对时,有插入、缺失现象,加权分析后的进化树中,香樟齿喙象首先与魔喙象亚科树皮象族树皮象属Hylobius的欧洲松树皮象最先聚在一起,在两种方法得到的进化树中置信度均高达99%。