Advances in Dendrobium Molecular Biology

石斛属植物常用的传统分类鉴定方法为性状鉴别，由于石斛属植物种属间形态学和组织学特征差异很小，给鉴别评价带来极大难度。显微技术的发展将性状鉴别与组织结构显微鉴别相结合，推动了石斛属鉴别的发展。随着现代分析技术的发展，以成分分析为主的指纹图谱鉴别法，弥补了性状鉴别法的缺陷，但容易受诸多因素的干扰^[14-15]。石斛属植物分类鉴定随着分子生物学的发展提升到分子水平，近20年来，DNA分子标记在石斛属分类鉴定方面得到广泛应用。与其它分类鉴定方法相比，DNA分子标记遗传稳定性好，多态性高，检测准确迅速，直接反映不同种属间DNA的差异性，能够快速准确地鉴定外形相近的石斛属植物。目前，用于石斛属植物种质资源鉴定的DNA分子标记技术主要有：以southern杂交为核心的DNA分子标记技术，如限制性片段长度多态性(RFLP)等；基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记技术，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复间隔序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)等；DNA序列标记，如叶绿体基因组核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(rbcL)，叶绿体赖氨酸tRNA基因(trnK gene)和叶绿体赖氨酸基因的内含子序列(matK)，以及核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)^[15-16]。

以southern杂交为核心的RFLP开发应用最早，分类鉴定结果可靠且稳定，但检测周期长，多态性差、操作复杂，且具有种属特异性^[15-16]。在石斛属分类鉴定中，常将RFLP与PCR技术相结合，避免了单纯使用RFLP操作繁琐等缺点，同时弥补了序列测定和位点特异性鉴别差的不足。张婷等^[17]利用RFLP结合PCR技术，成功鉴定了束花石斛(Den. chrysanthum Lindl.)、流苏石斛(Den. fimbriatum Hook.)及其形态相似种。

基于PCR技术的RAPD、ISSR和AFLP在石斛属植物研究中应用较多。RAPD标记分析简单，引物多态性好，可快速区分种间的亲缘关系及遗传多样性。张铭等^[18]、丁鸽等^[19]、顾慧芬等^[20]通过RAPD获得铁皮石斛(Den. officinale Kimura et Migo)的特异性标记，可以快速分离鉴定铁皮石斛及其相似种。AFLP兼具RAPD的方便性和RFLP的可靠性，对石斛属区分能力强大^[9]，王慧中等^[21]、虞泓等^[22]、包英华等^[23]采用AFLP技术对外形很难区别的石斛属植物成功进行分类鉴别。在SSR基础上开发的ISSR标记重复性高、稳定性好、引物设计简单，适用于种间关系分析，沈颖等^[24]、武荣花等^[25]利用ISSR标记获得几种相近石斛的ISSR分子标记特征性条带。

核糖体ITS/ITS2序列种内保守，种间差异显著，广泛应用于鉴定石斛属的种内、种间变异和近缘属间变异。金建峰等^[26]、顾慧芬等^[27]、丁小余等^[28]、张蕾等^[29]、郑司浩等^[30]分别基于rDNA ITS序列成功鉴定多种石斛近缘种及相似种，Lau等^[31]应用ITS2序列成功区分了石斛属相似种，丁小余等^[32]、叶子等^[33]和Takamiya等^[34]应用rDNA ITS/ITS2成功鉴别性状难以区分的多种石斛药材干品。

用于石斛属植物鉴定研究的叶绿体基因组主要有rbcL、matK、psbA-trnH。石斛属中的rbcL进化较慢，变异性低，不适合用于种间水平鉴定。滕艳芬等^[35]、刘静等^[36]用matK基因成功鉴定区分了石斛与非石斛属混淆品，但matK基因进化速率略低，物种鉴定效率并不高。石斛属叶绿体psbA-trnH基因通用性高，广泛用于石斛属药用植物及其混淆品的鉴别。Yao等^[37]、彭小凤等^[38]利用psbA-trnH序列成功区分了石斛属易混淆品种。

石斛属具有白色、黄色、绿色、粉红色、粉紫色、紫红色、红棕色和棕色等诸多花色^[2]。类胡萝卜素和叶绿素是使石斛属呈现黄色和绿色的重要色素，新黄质、紫黄质、花药黄质、叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素、叶绿素a和叶绿素b是黄色花石斛兰的主要色素，类胡萝卜素和花青苷的共同作用使唇瓣呈现橙色和红色斑^{[12, 39]}。Saito等^[40]发现一种酰化矢车菊素糖苷是紫红色石斛兰的主要色素。Kuehnie等^[41]分析了28个石斛兰切花品种，发现红色、橙色、棕色等花瓣中3-羟基矢车菊素糖苷是主要色素，天竺葵糖苷和飞燕草糖苷比较少见。Mudalige等^[42]从开桃红色花的石斛变种中发现98%的天竺葵素和2%的矢车菊素，花瓣中的黄酮成分主要是山奈酚衍生物而非槲皮素衍生物，推测该变种F3’H基因突变，从而DFR基因高表达使DHK转变为天竺葵素。

Mudalige等^[42]从2种石斛杂交种中分离的CHS4具有高保守性，在未着色花蕾中高表达，随着着色过程表达量降低。孟衡玲等^[43]从铁皮石斛中分离得到CHS基因，发现其不仅参与类黄酮合成，还参与早期的器官形态建成和激素运输。Pitakdantham等^[44]从4种石斛中分离到的DFR基因的氨基酸序列，它们具有99%的相似度，都在花蕾着色期表达，而在半开期时表达量达到最高。Piluk等^[45]将石斛兰‘Sonia Earsakul’花开放分为7个时期，DFR基因在盛开期不表达，在花蕾着色期表达量高。Rasika等^[46]从石斛兰‘Earsakul’中克隆了CHS和DFR基因，发现DFR在花蕾中高表达，而CHS在幼嫩的花芽中高表达。Whang等^[47]从细茎石斛中分离到DFR、CHS、和F3′5′H基因，发现F3′5′H在蕊柱中的表达量比花瓣中的高，利用离子轰击法短暂表达F3′5′H，花被片由白色变为红紫色，推测F3′5′H是使细茎石斛花被显色的关键基因。Sahagun等^[48]发现，F3′H在石斛兰‘Sonia Earsakul’花开放过程中表达量逐渐上升，在完全开放后略有下降，通过基因沉默可阻断其内源色素形成。Krianghan等^[49]从4种石斛杂交种中分离到CHS、CHI1、CHI2、F3′H、DFR、ANS、F3′5′H和FLS基因，推测石斛兰花瓣呈白色是因F3′H、DFR和ANS低表达而FLS高表达，石斛突变体的花色深浅与花青素合成相关基因的上调和下调表达有关。Wu等^[50]从石斛兰‘Woo Leng’中克隆得到21个MYB转录因子，发现DwMYB4表达局限于石斛花中，DwMYB9幼蕾期低表达而成熟期高表达。Lau等^[51]认为，DwMYB1与唇瓣表皮的锥细胞发育有关。Li等^[52]从石斛兰杂交种中克隆得到DhMYB2和DhBHLH1，发现这2个转录因子参与石斛兰花瓣花青素的生物合成，其中，DhBHLH1与唇瓣花青素的合成密切相关，通过粒子轰击短暂表达DhMYB2或DhBHLH1，会在白色花瓣上生成紫色斑点。有关石斛属类胡萝卜素合成相关基因的研究还未见报道。

MADS-box基因调控兰花花器官形态发育是近年来花发育生物学的研究热点。2016年公布的铁皮石斛全基因组中，Zhang等^[53]发现63个功能MADS-box基因和12个假基因参与兰花花器官形态发育，与小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris (Schauer) Rchb. f.)一样，FLC、AGL12和AGL15的同源基因也在铁皮石斛中缺失。铁皮石斛中发现28个Ⅰ型MADS-box基因和35个Ⅱ型MADS-box基因，数目明显少于大多数被子植物，其中，Ⅰ型MADS-box少于Ⅱ型MADS-box可能和兰科种子形成过程中无法形成胚乳有关^[53-54]。

在多数被子植物花发育过程中，经典ABCDE模型用于描述被子植物萼片、花瓣、雄蕊与心皮的分化，但兰花花器官高度特化^[55]，花形态发育模式有所不同，因此，Mondragón-Palomino等^[56-57]提出‘兰花代码’用以解释兰花的花发育过程，并指出，A类基因(AP1/SQUA-like，AP2-like)和E类基因(SEP-like)在各个花器官中都有表达，而C类基因和D类基因(AG-like，STK-like)仅在蕊柱和子房中表达^[56]。兰花B类基因可能负责形成花瓣状萼片、花瓣和唇瓣，包括AP3/DEF类和PI/GLO类，AP3/DEF基因在萼片、花瓣和唇瓣发育中起关键作用，而PI/GLO类基因与其它双子叶植物B类基因功能相似。AP3/DEF类基因又被分为4个分支，Clade1(PeMADS2-like)和Clade2(OMADS3-like)形成萼片花瓣唇瓣，Clade3(PeMADS3-like)形成花瓣唇瓣，而Clade4(PeMADS4-like)在花发育过程中相对晚的时期决定唇瓣形成。

目前已经从石斛中分离到6个A类、12个B类、3个C类、3个D类、5个E类基因^{[55, 58-60]}。进一步对这些石斛兰花器官MADS-box特征基因进行分析，发现金钗石斛(Den. nobile Lindl.)中分离得到的MADS-box基因DnAGL19和DnSEP3-like除调控花器官形态发育外，还参与到冬春两季的低温春化调控过程^[58-59]。Yu等^[61-62]从石斛兰‘Madame Thong-In’中分离到2个E类基因DOMADS1、DOMADS3，在花发育中的各个花器官中均有表达；Skipper等^[63-64]从球花石斛(Den. thyrsiflorum Rchb. f.)中分离出3个A类基因DthyrFL1、DthyrFL2和DthyrFL3、1个C类基因DthyrAG1和1个D类基因DthyrAG2，其中，DthyrFL1-3三个基因在花发育过程中起着重要作用，DthyrAG1只表达在子房及胎座发育的初期，而DthyrAG2在整个子房发中都有表达。Xu等^[65]从木石斛(Den. crumenatum Sw.)中分离到6个基因，其中，A类基因DcOAP2在叶片及各个花器官中都有表达，3个B类基因中，DcOAP3A在叶片及所有花器官中均有表达，DcOAP3B在唇瓣、花瓣、花粉囊和蕊柱中表达，DcOP1在各个花器官中均有表达，D类基因DcOAG2在花粉囊和蕊柱中表达，E类基因DcOSEP1在所有花器官中都有表达。石斛兰‘Spring Jewel’中得到的Clade3 DenAP3-3在唇瓣表达^[66]，细茎石斛的Clade4类DMMADS4在唇瓣花瓣和蕊柱表达^[67]，石斛兰‘Chao Praya smile’中的DOAP1在不同开花阶段的花器官中都有高表达^[60]，这些都基本符合‘兰花代码’；但木石斛中的C类基因，DcOAG1却在所有花器官中表达^[65]，石斛‘Madama Thong-In’中的AP3/DEF类基因DOMADS2在唇瓣和子房中表达而在外轮萼片中不表达^[61]。这些基因的精确表达模式和功能还需要进一步研究。

对这些石斛兰花器官中的MADS-box基因进行功能鉴定，发现大多数兰花的MADS-box类基因在拟南芥或拟南芥突变型中可以异位表达^[55]。拟南芥中过表达‘Chao Praya smile’中的DOAP1基因可以提前开花^[60]。拟南芥中异位表达木石斛DcOPI和细茎石斛DMPI导致外萼片变为花瓣状器官，可能是PI/GLO类基因保守性比较好，但是过表达木石斛DcOAP3A和细茎石斛DMAP3B，并未形成表型变异，可能是因为在兰科中AP3/DEF类基因是古AP3类型，序列与拟南芥AP3差别很大^{[65, 68]}。拟南芥中过表达细茎石斛DMMADS4，F1代外轮萼片转化为花瓣状器官，可能是DMMADS4和DMPI相互作用形成异质二聚体从而调节花瓣发育^{[55, 69]}。

石斛属多生长于温暖湿润气候，低温是影响石斛生长、分布与品质的重要因素^[1]，有关植物抗寒相关的功能基因和调控基因取得较快进展，为石斛属抗寒基因的研究提供了参考。

抗寒功能基因是与植物抗寒性直接相关的基因，如热休克蛋白(Hsp)基因家族参与植物抗逆反应，提高植物的低温耐性。铁皮石斛全基因组中发现20个Hsp70成员，远比小兰屿蝴蝶兰(9个)的多，这可能是铁皮石斛更具有广泛生态适应性的原因^[53]。李东宾等^[70]从铁皮石斛中克隆出Hsp70，qRT-PCR分析证实，Hsp70可在4℃冷胁迫下被诱导。李东宾等^[71]利用SCoT-PCR差异表达分析筛选出冷胁迫下11条与铁皮石斛抗寒性相关的基因片段。Wu等^[72]利用代谢组学和转录组学分析铁皮石斛的冷驯化幼苗，发现了一些石斛幼苗冷驯化时的标记基因。

抗寒调控基因主要通过控制抗寒基因的表达，寒冷信号传导等过程来提高植物的耐寒性。如WRKY转录因子是植物特有的调控逆境反应的转录因子家族，参与植物应对各种生物胁迫如低温、高温、干旱、盐胁迫等和非生物胁迫如病毒、细菌等的响应过程^[73]。He等^[74]在铁皮石斛根茎基因组中确认63个DoWRKY基因，它们的表达受低温调控，在铁皮石斛冷应激反应中发生作用。潘园园等^[75]将从金钗石斛中分离得到的WRKY基因导入烟草，表明DnWRKYI1转录因子在调节氧化胁迫方面起到一定的积极作用。蒋园等^[76]克隆得到铁皮石斛DnWRKY5基因，qRT-PCR分析表明，DnWRKY5基因在铁皮石斛应答低温胁迫中可能起重要的调控作用。张子凤等^[77]克隆DnWRKY6基因，发现它对铁皮石斛生长发育过程中不同组织的调控作用差异明显。

植物抗病基因(R基因)可有效提高植物病害防御能力，铁皮石斛全基因组中发现157个植物抗病基因(R基因)，数目明显比小兰屿蝴蝶兰(79个)的多，这可能是铁皮石斛拥有更好抗病性的原因^[53-54]。

除上述相关功能基因研究以外，参与菌根互作、多糖合成^[78]、生物碱合成^[79]、信号转导等诸多代谢通路的基因也被发掘克隆。铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰全基因组测序项目的完成，得到大量蛋白编码基因，获得大量参与萜类合成、抗病基因、热休克蛋白、多糖合成、CAM代谢、花形态建成等相关功能基因，极大推动了石斛属植物的基础科研。

石斛兰转基因研究起步较晚，目前报道的遗传转化体系多采用农杆菌介导法、基因枪法和农杆菌子房注射法，遗传转化体系建立的相关条件，如转化方法选择、转基因条件优化、标记基因选择等是目前研究重点。

农杆菌介导转化方法目前已经广泛应用于双子叶植物和一些单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等。Nan等^[80]提出，农杆菌介导法可用于转化石斛兰。Yu等^[81]首次将经薄层切片处理的类原球茎与农杆菌共培养之后用卡那霉素进行筛选，发现原球茎易诱导，转化后也易分化成苗，但易产生嵌合体。Zheng等^[82]利用超声波辅助农杆菌介导法将CHS基因成功转入石斛‘Sanya’中。Sawettalake等^[60]以愈伤组织为材料，利用农杆菌介导法将DoAP1基因成功转入石斛兰‘Chao Praya smile’。Men等^[83]建立了稳定的农杆菌介导转化原球茎的方法。杨翠芹等^[84]、闻真珍等^[85]优化了金钗石斛的转化体系，以其类原球茎为材料，研究了影响农杆菌介导转化的因素。张妙彬等^[86]、冯莹等^[87]、张振华等^[88]利用农杆菌介导转化石斛兰类原球茎，讨论了不同侵染条件等对石斛兰转化的影响。Ling等^[89]建立了稳定的农杆菌介导转化铁皮石斛原球茎的方法，并讨论了几个启动子对铁皮石斛转化效率的影响。

以石斛兰原球茎为材料进行的瞬时表达，应用较多的是基因枪转化法，成功率也略高于农杆菌介导转化法。Chang等^[90]将兰花花叶病毒外壳蛋白(CP)基因用微粒轰击法转入石斛原球茎，经过潮霉素筛选后得到抗兰花花叶病毒的转化植株。杨雪飞等^[91]用基因枪轰击类原球茎法将来源于大麦的抗旱耐盐碱基因lea3导入铁皮石斛。而以花器官材料进行的瞬时表达，应用较少，Li等^[52]通过粒子轰击短暂表达DhMYB2或DhBHLH1，发现这2个转录因子参与石斛兰花瓣花青素的生物合成，Whang等^[47]利用离子轰击法短暂表达F3′5′H，发现其是细茎石斛花被显色的关键基因。Pinthong等^[92]通过农杆菌渗入法将与花色相关的特异性基因在石斛‘Sonia’的萼片和花瓣中快速表达。

农杆菌子房注射法结合了花粉管通道法和农杆菌转化的优点，操作简单，为兰科植物育种提供一种简单高效的方法。刘其府等^[93]对人工自花授粉45 d的金钗石斛进行子房注射，发现成熟果实注射部位的种子GUS染色率最高。无菌播种之后，经潮霉素筛选，获得转基因植株。

随着石斛属基因组学的不断发展，分子标记理论的愈发成熟，DNA分子标记技术越来越多的应用于石斛属种群的分类和亲缘关系鉴定，为石斛属资源鉴定和物种保护提供参考；但DNA分子标记技术在实际生产应用中还有一定的局限性，要求一定的设备和技术，同时一些分子生物学标记的稳定性和重复性还需提高。随着测序成本的降低和生物信息学的发展，通过基因组序列分析寻找DNA候选序列，可以获得更合适的引物，更佳的多态性图谱，从而为石斛属分类鉴定提供更方便快捷的途径。

常规杂交育种一直用于改进石斛属的花色、花型、花期、抗病性等诸多品质，但石斛属的遗传背景研究相对落后，很多种具有自交不亲和特性，难以满足人们对兰花新品种的要求^[2]。随着花色、花发育、花香、抗逆性等相关功能基因的深入研究，利用分子模块设计育种，通过遗传转化，导入花色、花香、花期、株型等目的基因，培育出花大色艳、芳香、花期长且矮化的石斛兰新品种是石斛属育种的重要趋势。我国是石斛兰属许多支系分布的北部边缘地区，具有大量潜在的新性状和新基因，特别是一些抗逆性状，为石斛兰产业提供了丰富的人工育种种质资源^[2]。

石斛属功能基因的研究相对较少，多为克隆和表达模式分析，基因组和转录组研究也起步较晚。随着小兰屿蝴蝶兰全基因组以及铁皮石斛全基因组工作的完成，阐明了石斛属植物诸多重要基因调控机制，如石斛多糖基因调控、兰花花器官建成、抗性相关调控以及广泛的生态适应性调控机制等。在此基础上，进一步明确各机制的重要调控基因，建立候选基因稳定高效的功能验证体系，是未来石斛属研究的重点方向。全基因组及一系列转录组工作的完成，极大的推动了石斛属的基础科研，给石斛属植物的产业化发展带来新的机遇。