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胡杨(Populus euphratica Oliv.)对干旱和盐碱具有极强的忍受能力，属于耐盐碱而非盐生植物，能在极端干旱、盐碱的荒漠地带中正常生长，被视为研究、发掘林木特异功能基因的模式生物[1]。Chen等发现，大多数植物耐盐性等生物表型是由多个基因片段共同调节控制[2]，但目前大多数研究仅局限于单基因克隆，对大片段基因簇的功能研究鲜有报道[3]。鉴于此，张瑷等[4]、周婧等[5]等将胡杨基因组片段导入拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh)中挖掘潜在的胡杨耐盐功能基因簇，朱晓静[6]发现了与叶绿体发育有关的胡杨基因组大片段，王智[7]得到赤霉素高合成转化型拟南芥植株，但有关胡杨基因组片段潜在功能的挖掘仍需进一步深入研究。本研究将继续探索胡杨基因组片段功能，为进一步开展林木基因工程育种研究发掘优异的基因资源。
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拟南芥材料为拟南芥哥伦比亚野生型植株。
质粒pCLD04541携带有新霉素磷酸转移酶(NPT Ⅱ)基因及四环素(Tet)抗性基因，全长约为27.3 kb。引物序列[5]如下：
NPT-R：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’；
NPT-F：5’-ATCTCCTgTCATCTCACCTTgCTCCT-3’；
Tet R3：5’-TCAACGTTCCTGACAACGAG-3’；
Tet F3：5’-GTCTGACGACACGCAAACTG-3’；
PCR引物由华大基因公司合成。NPT Ⅱ扩增片段大小约为490 bp，Tet扩增片段大小约为540 bp。
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操作方法参考文献[8]。转化前，先活化菌液，解冻摇菌、划平板，28℃扩大培养，提取的质粒DNA加入引物(Tet)进行PCR检测，确认农杆菌是否携带目的基因片段。离心机浓缩活化好的菌液，弃去上清液，得到的农杆菌体用质量体积比为50%的蔗糖溶液重悬，按0.5%体积加入silwet-77，浸染野生型拟南芥花序。
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收获的拟南芥种子，5%次氯酸钠溶液消毒后接种在含50 μg·ml-1的卡那霉素1/2 MS培养基上，并设对照。4℃条件下，春化2~3 d后，在温度20~23℃、湿度60%、光照16 h·d-1条件的培养室中培养10 d。种子萌发形成的幼苗移于土壤中，在同样条件的培养室中继续培养。
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摘取拟南芥幼苗2~3片嫩叶，CTAB法提取DNA[9]。加入引物(NPT Ⅱ)进行PCR扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳检测并拍照记录[9]。
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随机抽取4株转化型和野生型拟南芥叶片，数码相机拍照，采用Photoshop软件计算叶片面积[10]，重复3次。用SPSS statistics 19软件统计分析叶片面积。每周定期测量转化型和野生型拟南芥的株高，并拍照、记录。
1.1. 材料
1.2. 方法
1.2.1. 农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)活化及转化
1.2.2. 转基因植株平板筛选
1.2.3. 转基因植株分子检测
1.2.4. 植株形态观测
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培养的菌落及拟南芥t2代幼苗叶片DNA的PCR扩增结果见图 1。由图 1A可知：菌落于540 bp处有条带，PCR扩增出的Tet基因和NPT Ⅱ基因的特异片段表明菌液携带有大片段基因78A2D10，可进行花序浸染。由图 1B可知，t2代幼苗叶片DNA于490 bp处有条带，表明t2代抗性植株基因组中携带有外源大片段78A2D10。
Figure 1. PCR identification image
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t1代转化型植株(T)与野生型植株(WT)生长表现见图 2A~C。由图 2A可知：与野生型植株相比，转化型植株莲座叶的叶片数量明显偏多，多些细小的叶片。抽薹后(图 2B)，转化型植株同时抽出2根几乎等高等粗的主茎，而野生型植株先抽出1根主茎再萌发侧茎。转化型植株的莲座叶数量多于野生型。3次重复试验，转化型与野生型植株的生长表型差异一致(图 2C)。但是，植株停止生长后，转化型与野生型植株的株高差异在统计学上不显著。
Figure 2. The Comparison of transgenic and wild plants
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转化型t2代与野生型植株在不同生长时期的株高差异见图 2D~G。野生型植株播种4周后开始抽薹，播种5周后型差异一致(图 2D)主茎达到22.0 cm，播种10周后型差异一致主茎达到36.0 cm (图 2E)，随后停止生长。转化型t2代植株营养期较长，播种17周后型差异一致(图 2F)才开始抽薹，播种27周后型差异一致株高达到63.0 cm(图 2G)。与野生型相比，转化型植株的株高明显增高。从图 2F可看出，播种17周后型差异一致，野生型植株开始枯萎，而转化型植株仍能正常生长。
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t2代转化型和野生型植株的叶片形态、数量以及侧茎形态特征见图 2H~J。由图 2H可知：与野生型植株相比，t2代转化型植株的莲座叶边缘向下内卷，严重皱缩，具有明显的远轴化叶片特征[11]。播种12周后型差异一致，野生型的莲座叶已经逐渐枯萎(图 2H)，但t2代转化型植株仍继续生长并不断从中心生出小叶，叶片数量增多。播种22周后型差异一致，野生型植株完全枯萎死亡；而t2代转化型植株仍能继续正常生长(图 2I)，直到播种29周后型差异一致，才枯萎。由此，笔者初步推测，胡杨基因组大片段78A2D10可能具有延长营养生长期及延长植株寿命的功能。同时，与野生型对比，t2代转化型植株侧茎分化成次生莲座(图 2I、2J)，具有典型的莲座叶特征。前期实验，从卡那霉素培养基中随机挑选12株抗性植株幼苗，移植于土壤后，4株出现特异表型。重复筛选，随机从卡那霉素培养基中挑选36株抗性植株幼苗中，获得特异表型植株11株。
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t2代转化型和野生型植株莲座叶的叶面积、株高及花期统计分析结果见图 3。由图 3A可知：转化型植株t2代莲座叶面积明显大于野生型莲座叶面积(P＜0.05)，在统计学上有显著意义。t2代转化型植株莲座叶叶面积比野生型莲座叶增长近3倍。由图 3B可知：t2代转化型植株株高明显高于野生型，株高平均增长近32.0 cm。由图 3C可知：t2代转化型植株花期与野生型花期差异极明显(P＜0.01)，野生型植株在4周即开始抽薹，而转化型植株在17周才陆续抽薹，比野生型晚抽薹13周。
Figure 3. Analysis of leaf area (A), flowering time(B) and plant height(C) of Arabidopsis transgenic and wild plants
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利用收获到的t2代无特异表型植株的种子进行卡那霉素平板筛选，种子萌发形成的150株t3代幼苗中，绿色抗性植株118株，黄化植株32株，比例接近3:1。随机从绿色抗性植株中挑取36株移植土壤中，结果发现，11株表现为抽薹晚、植株叶量多、叶面积大等特异表型，无特异表型与特异表型比例接近2:1。利用t2代特异表型植株的种子进行卡那霉素平板筛选，种子萌发形成的t3代幼苗均为绿色抗性植株，无黄化苗。从中随机挑取12株，移植于土壤中，结果发现，所有植株表现为特异表型。
2.1. DNA分子检测
2.2. 转基因植株的表型观察
2.2.1. t1代转基因植株
2.2.2. t2代转基因植株株高观测
2.2.3. t2代转基因植株莲座叶及侧茎形态特征
2.2.4. t2代转基因植株莲座叶片面积、株高及花期统计
2.2.5. t3代转基因植株
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植物抽薹、开花是经过一连串的信号转导与一系列基因家族协同调控的[12-14]。有研究认为，植物内源激素[15-16]与小分子RNA(miR156)及其靶基因[17-18]影响植物营养生长和花发育。胡杨大片段基因长度远远大于单个基因序列长度，随机插入拟南芥植物体内，可能会发生中断调控、破坏正常基因阅读框或高效表达等[19]情况。本研究中，胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥表现为营养生长期长、抽薹晚等现象是否与上述机理有关，有待进一步研究。有报道指出，GRF转录因子能参与调控植物细胞体积大小[20]，油菜素甾醇(BR)、生长素(IAA)、赤霉素(GA)均能促进植物细胞伸长[21-22]，胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥株高明显高于野生型、主茎变粗，是由上述机理决定的，还是由于转化型植株的前期营养生长积累了大量营养物质[23]造成的，目前还不清楚。
对胡杨基因组大片段78A2D10转化型拟南芥植株的后代(t2至t3)进行反复筛选，发现转化型植株后代群体中，无特异表型植株与特异表型植株比例接近2:1，性状分离比例与孟德尔遗传定律中分离比基本吻合。这表明，胡杨基因组大片段78A2D10遗传方式符合孟德尔定律[24]，胡杨基因组大片段78A2D10为隐性遗传方式[25]，无特异表型植株为杂合体，特异表型植株为纯合体。本研究中，t1代转化型植株出现的抽双薹性状未在t2代杂合体中出现，尚不清楚其原因。
为了进一步探讨胡杨基因组大片段78A2D10的功能，下一步计划将携带胡杨基因组大片段78A2D10的农杆菌原始菌液转入其他模式植物如烟草(Nicotiana tabacum L.)中，观察烟草转化型植株是否会出现延长营养生长的现象。基于基因测序方法，获取其碱基序列，通过生物信息学分析，在分子水平上进一步探讨该大片段基因的时空表达模式。
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本研究中，导入胡杨基因组大片段78A2D10的拟南芥转化型植株在莲座基叶数量、基叶面积、营养生长期、莲座叶的叶片伸展程度、株高、茎粗、茎生叶、抽薹时间、侧茎发育方式以及植株寿命等方面与野生型存在明显差异，转化型植株的营养期明显延长、株高明显增高，这表明胡杨基因组大片段78A2D10可能与植物营养生长有关。如果将胡杨基因组大片段78A2D10转化到重要用材林树种，如杨树(Populus L.)中，可望提高树木的高生长量和胸径生长量，增加单位面积蓄积量，为林业新品种创制提供新的基因资源。
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