Tissue Culture and Plantlet Regeneration of Betula pendula Roth 'Dalecarlica'

于2016年3月中旬在沈阳农业大学林学院科研基地大棚内选取当年的裂叶垂枝桦带顶芽或腋芽的幼嫩茎段和木质化茎段作为试验材料。

幼嫩茎段：将剪成12 cm至少带1个芽的茎段置于烧杯中，洗去茎段表面附着的灰尘，然后用流水冲洗12 h。置于超净工作台在无菌操作下，用75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl₂二次消毒时间分别为：2、3、4 min，最后用无菌水冲洗57次，用解剖刀或剪刀切去茎段两端少许，接种备用。

木质化茎段：在室温20℃条件下水培5 7 d后，用毛刷清洗整个枝条，流水下冲洗12 h，然后将其剪成12 cm带1个芽的茎段置于烧杯中，加入少量洗衣粉充分振荡，用流水冲洗1 2 h。在无菌操作下，用75%酒精消毒30 s (轻轻振荡)，再加12滴20%吐温，再用0.1% HgCl₂消毒，消毒时间分别设为：6、8、10 min，无菌水冲洗58次，置于灭过菌的滤纸上备用。

试验采用双因子全试验方法，以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA(0.2、0.5、1.0 mg·L^-1)，NAA(0.05、0.2、0.5 mg·L^-1)和0.2 mg·L^-1GA₃，共9个处理，每个处理接种10瓶，每瓶2个外植体，重复3次。30 d后观察裂叶垂枝桦嫩茎的萌发情况，并对数据进行分析。

采用1/2MS、MS、WPM三种培养基作为初代培养基，分别加入0.5 mg·L^-16-BA、0.05 mg·L^-1NAA、0.2 mg·L^-1GA₃、20 g·L^-1蔗糖和6 g·L^-1琼脂，pH值为5.8。共3个处理，每个处理接种10瓶，每瓶2个外植体，重复3次。培养室温度(25±2)℃，光强1 000 2 000 Lx，每天12/12 h光照培养，湿度60%70%。30 d后观察裂叶垂枝桦外植体诱导及萌发情况。

在MS培养基中附加6-BA1.0 mg·L^-1、NAA0.1 mg·L^-1、GA₃(0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L^-1)，共3个处理，每个处理接种10瓶，每瓶2个外植体，重复3次。30 d后观察裂叶垂枝桦茎段的萌发情况。

裂叶垂枝桦茎段萌发生长高度达到35 cm时，剪切成长约1.52 cm，转接到增殖培养基中，20 d后观察芽的增殖情况。

待增殖的芽长到35 cm高时，进行生根培养。生根培养基采用无机盐成分降低的1/2MS培养基，分别添加质量浓度为NAA(0.05、0.1、0.5 mg·L^-1)和IBA(0.05、0.1、0.5 mg·L^-1)的生长素，蔗糖20 g·L^-1，琼脂6 g·L^-1，pH5.8，2周后开始注意观察裂叶垂枝桦无菌苗生根情况，记录生根条数。

将生根状态理想的组培苗放置在自然光照下，逐渐打开瓶口适应外界环境12 d，用流水冲洗净组培苗根部的培养基，将无菌苗移植至装有草炭土和细沙比例3:1的已灭菌基质的营养杯中，使根系充分伸展，压实土壤，喷水后用保鲜膜将苗覆盖，用镊子尖在保鲜膜上戳几个小孔，以便植物呼吸和保持土壤湿度，之后每天喷水12次，57 d后撤去保鲜膜进行常规管理。移植后注意后期水分、光照、营养等条件的管理。15 d后观察成活情况。

实验数据采用Excel及SPSS软件进行统计分析。

从表 1中可看出：幼嫩茎段用0.1% HgCl₂消毒处理3 min时污染率最低为8.3%(图 1A)，而成活率和消毒2 min时均较高，为75%左右，但消毒2 min污染率相对提高，消毒4 min时幼嫩茎段褐化率大幅度提高；说明消毒时间过长消毒液渗透进入茎两端会产生毒害作用。木质化茎段由于外植体表面菌群数量较多，0.1%HgCl₂消毒时间长短不易掌握，导致外植体污染率极高，虽然用0.1%HgCl₂消毒10 min，但污染率仍可达40%(图 1B)，因此，在对木本植物进行离体快繁时选择外植体非常重要，尽量选择幼嫩的茎段进行离体快繁。本试验得出：裂叶垂枝桦幼嫩茎段的最佳消毒时间为23 min，木质化茎段由于污染率较高，在后续试验中全部采用幼嫩茎段进行离体快繁。

Figure 1.  The influence of disinfection time on the growth of different explants of Betula pendula Roth 'Dalecarlica'

从表 2可以看出：处理4幼嫩茎段的分化效果显著，萌芽率最高为73.3%，激素浓度组合为6-BA为0.5 mg·L^-1+NAA0.05 mg·L^-1+GA₃0.2 mg·L^-1诱导分化效果最好，苗生长健壮，叶色鲜绿(图 2A)。在研究过程中发现，当细胞分裂素BA浓度一定，GA₃为0.2 mg·L^-1时，随着生长素NAA浓度升高，裂叶垂枝桦幼嫩茎段的分化率逐渐降低，愈伤组织膨大(图 2B)；当生长素NAA浓度一定，GA₃为0.2 mg·L^-1时，随着6-BA浓度的升高，叶片长度越长，有徒长的趋势(图 2C)。试验最终筛选出裂叶垂枝桦幼嫩茎段离体培养的最佳激素浓度组合为：MS+0.5 mg·L^-16-BA+0.05 mg·L^-1NAA+0.2 mg·L^-1GA₃。

Figure 2.  Effect of mass concentrations of hormone concentration young stem in Betula pendula Roth.'Dalecarlica'lignified stems

由表 3可知：不同培养基种类对带芽茎段萌发率和成活率具有显著影响，MS培养基的幼嫩茎段萌发启动时间相对早一些，芽膨大，15 d左右展叶(图 3A)，展叶情况好于1/2MS和WPM培养基，成活率也高于1/2MS和WPM培养基，且叶色鲜绿，无菌苗生长建壮。1/2MS和WPM培养基上的茎段接种1周后基部才开始膨大(图 3B、C)，叶片逐渐萌发，但展开的叶片色浅且裂叶狭长，叶片深裂；茎段基部也形成愈伤组织；MS培养基上的茎段形成的愈伤组织与1/2MS和WPM培养基上形成的愈伤组织块相比较小，且幼嫩茎段萌发后的叶片鲜绿色，长势比较正常。1/2MS培养基上的无菌苗，叶片狭长，叶色较浅，长势较弱，启动较晚(图 3C)；WPM培养基上的无菌苗，基部愈伤组织明显，展叶抽枝较晚。试验结果表明：不同培养基种类对裂叶垂枝桦带芽茎段的诱导及萌发均有显著影响，MS培养基比1/2MS和WPM培养基更适合初始培养。

Figure 3.  Effect of tender stem in vitro sprout in different medium of the Betula pendula Roth.'Dalecarlica'

赤霉素的主要作用是加速细胞伸长，促进细胞分裂，在大多数情况下对已形成的器官和胚状体的生长通常有促进作用。所以，添加适宜质量浓度的GA₃对外植体生长有促进作用。由P(展叶率)=0.018 < 0.05，P(污染率)=0.041 < 0.05可知：GA₃的浓度对裂叶垂枝桦带芽茎段的展叶情况和污染情况有显著影响。如表 4:随着GA₃浓度的升高，GA₃抑制了外植体的分化，展叶率成下降趋势，且伴随着愈伤组织明显与茎逐渐褐化现象。当GA₃浓度为0.1 mg·L^-1时，无菌苗展叶率最高为50%，但伴随有叶色较浅轻微玻璃化现象(图 4A)；当GA₃浓度为1.0 mg·L^-1时，展叶率最低为26.7%，污染率最高为53.3%，茎褐化严重(图 4B)；GA₃浓度为0.2 mg·L^-1时，展叶率较高为46.7%，污染率较低为33.3%，叶片颜色浓绿，生长健壮(图 4C)；当GA₃浓度为0.5 mg·L^-1时，茎段未见萌发，但在茎段基部出现了愈伤组织(图 4D)。因此得出，在MS培养基中添加GA₃浓度为0.2 mg·L^-1时最适于裂叶垂枝桦幼嫩茎段的萌发生长。

Figure 4.  Effect of stem bud growth in different concentrations of GA₃ of Betula pendula Roth.'Dalecarlica'

裂叶垂枝桦带芽茎段长到2 cm左右时，切取带芽的嫩茎，分别转接到MS+0.5 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1NAA+0.2 mg·L^-1GA₃、MS+1.0 mg·L^-16-BA+0.5 mg·L^-1NAA和WPM + 1.0 mg·L^-1 6-BA + 0.5 mg·L^-1 NAA + 20 g·L^-1蔗糖+ 6 g·L^-1琼脂的3种增殖培养基中，20 d后观察芽在3种增殖培养基的增殖情况。通过培养发现，裂叶垂枝桦无菌苗在WPM+1.0 mg·L^-1 6-BA + 0.5 mg·L^-1 NAA + 20 g·L^-1蔗糖+ 6 g·L^-1琼脂的增殖培养基上生长状况良好，叶片嫩绿色，叶型舒展，基部有少量愈伤组织，离体培养20 d后，当增殖芽长至4 6 cm即可进行生根培养(图 5A、B)。

Figure 5.  The aseptic seedling and proliferation of seedling growth condition of the Betula pendula Roth.'Dalecarlica'

从表 5可以看出：当NAA质量浓度为0.1 mg·L^-1时生根率及平均根数最优，根系粗壮较长，须根较密(图 6A)；NAA质量浓度为0.05 mg·L^-1时次之，根系短粗成密集辐射状生长(图 6B)。而IBA浓度为0.1 mg·L^-1时，生根率最高为75%，平均根数最多(图 6C)；IBA浓度为0.05 mg·L^-1时次之，培养基上的根生长也较好，但从萌发生长状态看生长较慢，叶片有发黄现象(图 6D)。综合分析得出：裂叶垂枝桦生根培养基和激素组合为1/2MS+NAA 0.1 mg·L^-1+20g·L^-1蔗糖+6g·L^-1琼脂。

Figure 6.  The rooting complexion of Betula pendula Roth.'Dalecarlica' in different types and concentration of auxin

将组培苗移植15 d后，生长健壮，成活率达到80%以上(图 7A~C)。

Figure 7.  Transplanting seedlings condition of Betula pendula Roth.'Dalecarlica'

在组织培养过程中，培养基是人为添加的为植物生长提供生长的营养物质。不同植物组织和器官对外界提供的营养有不同的要求，即使同一物种不同部位的器官对外源营养的要求也有所不同，只有满足各自需求才能离体生长。薛丽宁等^[8]将外植体接种在未添加任何激素的MS、1/2MS、WPM培养基上对不定芽进行诱导，结果表明，WPM培养基的诱导率显著高于MS和1/2MS，并且芽体成活率也较高。孙晓敏等^[9]对光皮桦进行最适基本培养基筛选，结果表明，MS培养基适合光皮桦不定芽的诱导，启动时间较快，芽体多且健壮；WPM培养基上的无菌苗长势较弱；1/2MS培养基上的芽体较少且长势较差。张彦妮等^[10]以复叶槭的茎段为外植体在多种培养基上附加多种激素进行配比试验，探讨不同激素对复叶槭茎段诱导及再生的影响，研究发现，仅在MS+0.000 5 mg·L^-1TDZ+0.01 mg·L^-1NAA培养基上出现再生芽，芽的分化率为22.8%。在植物组织培养过程中，大多在培养基中添加不同种类及浓度的外源激素才能刺激外植体细胞的启动和分化，因此，培养基的选择、激素种类和浓度配比在诱导过程中尤为重要。腋芽萌动时间受培养基中激素配比的影响而不同，当培养基中激素种类仅含NAA时，芽的初始萌动时间随NAA浓度的增加而延长；当培养基中激素种类仅含6-BA时，随6-BA浓度的增加，腋芽萌生时间也明显延迟^[11]，在NAA浓度水平相同时，低浓度的6-BA对茎段腋芽的诱导率低，在一定范围内高浓度6-BA对光皮桦腋芽诱导有促进作用^[12]。Venta等^[14]和Niels等^[15]对月季的茎段芽增殖进行研究发现，细胞分裂素对其增殖有影响，细胞分裂素能诱导芽的萌发与生长，CPUU利于芽增值系数的提高。

李国福等^[7]研究认为，添加生长素NAA或IBA在不同程度上都可以促进试管苗生根，但不同质量浓度NAA和IBA对垂枝桦的生根影响较大，当NAA为0.05 mg·L^-1时，最适合垂枝桦不定根的诱导。添加不同浓度的NAA和IBA比较可知，当NAA质量浓度为0.1 mg·L^-1时，生根率最高为80%，平均根数最多为4.7个，根呈多层辐射状生长。薛丽宁等^[8]在对虎榛子试管苗诱导生根的培养中发现，0.2 mg·L^-1的NAA为最适生根浓度，较高的NAA对根的生长有抑制作用，随着NAA浓度的升高，生根率下降，且根的生长状况也较差。黄烈健等^[13]研究马占相思优树组培快繁时，发现无菌苗在1/2MS+IBA2.0 mg·L^-1+NAA0.5 mg·L^-1的培养基上生根效果最好，生根率可以达到86%，当试管苗根长25 cm时，便可将瓶盖打开炼苗，35 d后即可进移植。

本研究以裂叶垂枝桦幼嫩茎段和木质化茎段为实验材料进行离体快繁技术研究，建立了12年生幼嫩茎段的离体快繁技术体系，裂叶垂枝桦幼嫩茎段离体培养最适培养基和激素组合为MS+0.5 mg·L^-16-BA+0.05 mg·L^-1NAA+0.2 mg·L^-1GA₃，幼嫩茎段离体诱导效果最好；增殖培养基为WPM + 1.0 mg·L^-16-BA + 0.5 mg·L^-1 NAA + 20 g·L^-1蔗糖+ 6 g·L^-1琼脂；生根培养基为1/2MS+0.05 mg·L^-1 NAA+20 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂生根效果最佳。将生根状态理想的无菌苗移植至草炭土和细沙比例3:1的已灭菌的基质中，15 d后，组培苗生长健壮，成活率可以达到80%以上。建立了裂叶垂枝桦组培快繁技术体系，获得了大量的无性繁殖苗木，为该树种选育优良单株奠定了基础。