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山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers.)，属于樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea Lam.)，别名山苍子、山胡椒、木姜子、香桂等，多为灌木或小乔木[1]。山鸡椒原产于中国，主要分布于我国南方各省区以及东南亚各国，我国以福建、湖南、湖北、四川等省分布最多[2]。山鸡椒是我国重要的芳香油植物资源[3]，具有较高的经济价值，果实含油率高达4%~5%[4-5]，主要成分是柠檬醛，可制成香精用于食品、烟草、牙膏、肥皂、化妆品等各领域[6]，山鸡椒油还具有抗真菌作用。因此，山鸡椒是一种具有广阔发展前景的经济树种[7]。
山鸡椒为雌雄异株植物，花蕾黄色，花期为每年2—3月，果期为同年7—8月。花芽分化对植物花的质量、数量以及座果率等都有较大影响[8]，山鸡椒的主要经济性状指标为果实，在山鸡椒栽培中，花芽分化的好坏会直接关系到产量的高低，关系到最终的经济收益。关于植物花芽分化的形态学研究，已经有许多报道，但有关山鸡椒花芽分化形态特征的研究还较少，目前仅有许自龙等[9]对山鸡椒雄花进行了相关研究和报道。花芽分化与碳氮营养密切相关，甚至有研究者提出了影响花芽分化的碳氮比理论[10]，认为只有碳氮比达到较高的比例才会促使花芽分化。目前，有关山鸡椒碳氮营养方面的研究还未见报道。本研究通过对山鸡椒雌花花芽分化形态特征及碳氮营养变化的初步观测和分析，了解和掌握山鸡椒雌花花芽分化和发育规律，为山鸡椒人工栽培及杂交育种提供参考。
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本试验所用山鸡椒雌花芽以及叶片材料均来自浙江省杭州市富阳区黄公望城市森林公园(30°04′N，119°58′E，海拔169 m)的3株野生雌性山鸡椒，树龄为4~6 a。树体长势良好，无病虫害，环境透光性强，土壤肥力充足。
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2016年4月中旬山鸡椒花芽分化未启动时开始，每隔10 d采集雌花花芽30个，同时采集花芽邻近处的叶片30片，带回实验室，花芽直接置于FAA固定液中固定保存，叶片直接放入-80℃超低温冰箱保存。
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取FAA固定液中固定保存的雌花花芽，经过脱水、浸蜡、切片、脱蜡、染色和封片等步骤制作成常规石蜡切片，然后通过正置荧光显微镜(NI-U Eclipse Ni，日本尼康株式会社)进行观察，并对特征明显的切片进行拍照。
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本试验中可溶性糖(包括果糖、蔗糖、葡萄糖等各组分)、可溶性蛋白(BCA法)和淀粉等生理指标均采用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒(分光光度法)进行测定，每个指标的测定均进行3个生物学重复。
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可溶性糖(包括果糖、蔗糖、葡萄糖等各组分)、可溶性蛋白(BCA法)和淀粉等生理指标均利用试剂盒说明书中的计算方法，将吸光度值转换成实际含量(mg·g-1)，最终取3个重复的平均值；全糖含量(mg·g-1)=可溶性糖含量(mg·g-1)+淀粉含量(mg·g-1)[11]；碳氮比=全糖含量(mg·g-1)/可溶性蛋白含量(mg·g-1)[12]。
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试验数据采用Excel 2003软件进行分析处理。
1.1. 试验材料
1.2. 试验方法
1.2.1. 采样方法
1.2.2. 石蜡切片制作和观察
1.2.3. 生理指标测定
1.2.4. 生理指标计算
1.3. 数据分析
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许自龙等[9]将山鸡椒雄花花芽分化分为5个时期，即：未分化期、花序原基分化期、苞片原基分化期、花原基分化期和花器官分化期。本研究通过对山鸡椒雌花花芽分化内部形态特征的研究，发现雌花花芽分化与雄花并无较大差别，同样可以把其分化过程分为5个时期。
未分化期：此时期芽为叶芽状态，芽中未发现花器官原始体。芽体较小，呈细圆锥状，芽体核心部位可见叶芽原基生长点，该部位细胞排列紧密，染色较深(图 1A)。
Figure 1. Anatomical structure characteristics of female flower bud differentiation in L. cubeba
花序原基分化期：此时期芽体较未分化期体积变大，略饱满，核心叶芽原基分化明显，可见枝叶原始体。在叶芽与外层鳞片之间发现圆锥状突起，突起处细胞排列紧密，染色较深，突起即为花序原基，此时芽体既包含叶芽又包含花芽的原始体，故称为混合芽(图 1B)。
苞片原基分化期：此时期混合芽体较上一时期相差不大，但形状上却更为饱满，花序原基进一步分化，体积变大，且在其顶部边缘出现片状突起，称之为苞片原基(图 1C)。
花原基分化期：此时期混合芽体比上一时期有所增大，肉眼可见芽体外表鳞片从顶部略微裂开。从切片可以看出，位于叶芽周围的花芽体积已较上一时期增长数倍，在花芽顶部形成了明显的花原基(图 1D)。
花器官分化期：此时期花芽从混合芽中露出，肉眼可观察到花梗和花蕾，花梗柱状，花蕾球形。切片观察发现，花芽顶部的花原基已分化出花被等花器官原始体(图 1E)。
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通过分析山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片中可溶性糖及其组分含量变化后发现(图 2)，其含量随着分化时期的深入呈不断升高的趋势。从第1个分化期(未分化期)到第5个分化期(花器官分化期)，叶片中可溶性糖含量从38.28 mg·g-1增长到65.07 mg·g-1，增长0.70倍。从图 3可看出：可溶性糖各组分中，蔗糖含量占比最高，其比例为55.00%~61.67%；其次是果糖，比例为36.84%~42.28%；葡萄糖含量最低，比例低于2.78%。蔗糖较可溶性糖相对含量随着分化时期的深入呈现略微下降的趋势，而果糖和葡萄糖相对含量随着分化时期的深入呈略微升高的趋势。
Figure 2. The content of soluble sugar and its components in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
Figure 3. The proportion of soluble sugar components in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
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通过研究山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片中的淀粉含量发现(图 4)，其含量随着分化时期的推进呈先升高后下降的趋势，最高值出现在第3个分化期(苞片原基分化期)，达到81.30 mg·g-1，最低值出现在第5个分化期(花器官分化期)，为52.19 mg·g-1。全糖含量随着分化时期的推进同样呈现先升高后下降的趋势，第1个分化期(未分化期)含量最低，为91.50 mg·g-1，在第3个分化期(苞片原基分化期)达到最高值，为136.57 mg·g-1。在全糖含量中，淀粉相对含量在前4个分化期中均达到56.00%以上(图 5)，且4个分化期之间变化不大，相对稳定，在第5个分化期(花器官分化期)则有明显的下降，降到44.51%，而可溶性糖相对含量则在第5个分化期(花器官分化期)与淀粉相对含量相反，有明显的升高。在整个花芽分化过程中，淀粉和可溶性糖相对含量在前4个分化期保持稳定，而在第5个分化期(花器官分化期)出现了淀粉含量降低，可溶性糖含量升高的状况。
Figure 4. The content of total sugar and its components in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
Figure 5. The proportion of total sugar components in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
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从图 6可以看出：在山鸡椒雌花花芽的前3个分化期，随着花芽分化进程的深入，其叶片中可溶性蛋白含量呈现出持续下降的趋势，从61.32 mg·g-1下降到52.48 mg·g-1，下降14.41%，而从第3个分化期(苞片原基分化期)到第5个分化期(花器官分化期)，其基本保持稳定。从图 7可以看出：在山鸡椒雌花花芽的前3个分化期，叶片中的碳氮比随着分化时期的推进呈不断升高的变化趋势，从1.49升高至2.61，而后2个分化期碳氮比虽有所降低，但仍维持在较高水平。
Figure 6. The soluble protein content in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
Figure 7. The carbon to nitrogen ratio in leaves of L. cubeba in female flower bud differentiation
2.1. 山鸡椒雌花花芽分化内部形态特征及分化期划分
2.2. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片碳水化合物含量
2.2.1. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片可溶性糖及其组分含量
2.2.2. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片全糖及其组分含量
2.3. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片可溶性蛋白含量及碳氮比
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山鸡椒为雌雄异株树种，作为一种以产果为主要经济性状的经济林树种，雌花的分化发育状况在很大程度上决定了果实的品质，所以对雌花花芽分化进行相关的研究有着重要意义。本试验通过对山鸡椒雌花花芽分化内部形态特征的研究，发现其内部分化特征与许自龙等[9]关于雄花的研究结果基本一致，均经过未分化期—花序原基分化期—苞片原基分化期—花原基分化期—花器官分化期5个分化时期，说明雌雄花在整个花芽分化阶段基本分化特征是相同的。同时，这些分化时期的判断也与石万里等对菊花(Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.)[13]、韦三立等对大丽花(Dahlia pinnata Cav.)[14]、王亚庆等对小豆(Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi)[15]、季作梁等对荔枝(Litchi chinensis Sonn.)[16]花芽分化时期的研究非常相似，这也说明山鸡椒花芽分化的内部形态特征可能代表了一部分植物，这些植物包括花卉、农作物、木本树种等多种植物，所以山鸡椒花芽分化的形态特征在植物中具有一定的共性。另外，需要指出的是，在许自龙等[9]对山鸡椒雄花的划分中，雄花的花器官分化期又可进一步依次细分为花被原基、雄蕊原基和雌蕊原基分化期，而雌花的情况是否与其一致，需要今后进一步研究。
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碳水化合物是植物各种化学成分的碳架提供者，也是各项生命活动的能量携带者，在植物的花芽分化过程中起着不可或缺的重要作用[17]。碳水化合物主要指糖类物质，而可溶性糖和淀粉是在植物体各项生命活动中起主要作用的糖类物质。可溶性糖主要由果糖、蔗糖、葡萄糖等单糖或二糖组成，在本研究中，各个分化时期的果糖、蔗糖和葡萄糖三者含量之和均与同时期测得的可溶性糖含量相当，这在一定程度上互相印证了数据的可靠性。而在可溶性糖的各组分中，蔗糖高于果糖，且二者之和超过可溶性糖含量的97.00%，因此，山鸡椒雌株叶子中的可溶性糖主要以蔗糖和果糖的形式存在。可溶性糖是花芽形态分化进程中所需最多的营养物质之一，其含量的高低直接反映了植株体内可利用态物质和能量的供应基础[18]，它的升高可以提高细胞液的浓度，从而有利于花芽分化[19]，而且“库-源”理论[20]认为，叶片为“源”，花芽为“库”，糖在“源”与“库”之间进行积累和转运，植株一旦接收信号进入花芽分化期，叶片中的可溶性糖会源源不断往花芽内运输，提供其成花所需的物质和能量。在山鸡椒整个雌花花芽分化进程中，叶子中的可溶性糖(包括果糖、蔗糖和葡萄糖各组分)基本是持续升高的，可能意味着随着花芽分化的深入，需要积累越来越多的可溶性糖供分化所需，这与吴月燕等[21]对葡萄(Vitis vinifera L.)的研究结果基本一致。另外，蔗糖不仅为花芽分化过程提供能量，还可以充当一种信号物质在植物生命活动中发挥调节作用[22]，而本试验发现，蔗糖在整个可溶性糖中的相对含量会随着花芽分化的推进而有所下降，这是否是对花芽分化的一种信号调节，还有待于今后进一步研究。
淀粉是植物中除了可溶性糖之外另一种主要的糖类物质，它的积累有利于花芽分化，而其必须被转化成可溶性糖才能被植物利用[23]。在整个山鸡椒雌花花芽分化过程中，在苞片原基分化期淀粉含量达到最高值后，到花原基分化期以及花器官分化期却又出现了下降，并且其在全糖中的相对含量在器官分化期也出现明显的下降，这可能是因为有一部分淀粉转化成了可溶性糖，全糖中的淀粉相对含量在花器官分化期以前均高于可溶性糖，说明叶片中的全糖在花器官分化期以前更多的是以淀粉的形式存在，而在花器官分化期可能由于需要大量的可溶性糖，已有的可溶性糖不足时，需要通过转化淀粉才能满足分化的要求。
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在生物体的总蛋白中，可溶性蛋白是其中最活跃的一部分[24]，也是生物体吸收利用的主要蛋白，其在生命活动中发挥着运输协调、免疫保护、产生和传导神经冲动、控制生长分化等功能[25]，它是花器官形态建成的物质基础，是成花过程中必需的结构和营养物质[26]。在本研究中，山鸡椒雌株叶片中的可溶性蛋白从花芽未分化期到苞片原基分化期不断下降，说明雌花花芽分化需要较低含量的可溶性蛋白，也可能是因为随着分化进程的深入，花芽从叶子中运输更多的可溶性蛋白以维持花芽各原基的形成。另外，从本试验的碳氮比研究结果看，山鸡椒雌花碳氮比从花芽未分化期到苞片原基分化期不断升高，之后维持在较高水平，说明雌花在分化过程中需要较高的碳氮比才能维持花芽的分化。依据碳氮比试验结果，在山鸡椒花芽分化前后，可以通过控制氮肥施肥量以及环剥等栽培措施提高碳氮比，以调控其花芽分化进程，这在山鸡椒生产上具有实际应用价值。然而，众多研究表明[27-32]，植物的花芽分化可能并不是由单一因素所决定的，而是由碳氮营养、激素等多种因素综合作用的结果，因此，关于山鸡椒花芽分化的机理和发育规律仍有待于进一步研究和探索。
3.1. 山鸡椒雌花花芽分化期的划分
3.2. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片碳水化合物含量
3.3. 山鸡椒雌花花芽不同分化期叶片可溶性蛋白含量及碳氮比
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通过研究山鸡椒雌花花芽分化的内部形态，初步掌握了其花芽分化特征，整个花芽分化期分为未分化期、花序原基分化期、苞片原基分化期、花原基分化期、花器官分化期5个阶段，每个分化期都具有明显的分化特征，这与雄花花芽分化结果基本一致。对山鸡椒雌花花芽不同分化期的碳氮营养分析发现，在整个雌花花芽分化过程中，在叶片中需要积累越来越多的可溶性糖，而可溶性蛋白则需要维持在略低的水平，雌花的花芽分化进程需要较高的碳氮比。
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