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横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌的多样性研究

李鸿博 马莉 黄耀华 康定旭 伍建榕 马焕成 陈诗

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横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌的多样性研究

    通讯作者: 马焕成; 陈诗, chenshi@swfu.edu.cn
  • 中图分类号: S718.81

Diversity of endophytic fungi from the Roots of alpine Quercus in subalpine regions of Hengduan Mountains

    Corresponding author: MA HuanchengCHEN Shi, chenshi@swfu.edu.cn
  • CLC number: S718.81

  • 摘要: 目的 了解横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌组成及多样性。 方法 以该地区3种高山栎根系为材料,利用根系浸泡染色方法观察根系内真菌共生状况,并对根内真菌进行分离和纯化,结合形态学与分子生物学的方法对其种类进行鉴定。 结果 根系染色可发现大量暗色有隔真菌和AMF丛枝结构,共鉴定出17科20属27种真菌,发现1种外生菌根真菌Ceratobasidiaceae(GSL1-7),4种暗色有隔真菌(DSE)Boeremia exigua var.exigua(GSL1-F)、Phoma herbarum(GSL20-A)、Phialophora.mustea(GSL2-2,GSL2-9)、Paraboeremia putaminum(GSL4-F,GSL20-B),以及2种有促生作用的真菌Pseudogymnoascus roseus(GSL4-1-A,GSL4-2)和Trichoderma.tomentosum(GSL80-D)。α多样性分析发现,3种高山栎根系内生真菌多样性丰富,但差异不显著。4种DSE和3种植物促生真菌在根系中占比可达31.3%。 结论 该类益生真菌对高山栎在横断山脉恶劣环境条件下的适应性生长发挥重要作用。本文研究结果初步为为阐明横断山脉地区高山栎的生态适应性机制提供了理论依据,同时为开发利用促生菌在高山栎育苗中的应用提供了活体菌种资源。
  • 图 1  3种高山栎根系中的真菌侵染结构

    Figure 1.  Fungal colonization and structures in roots cortex of Quercus spp.

    图 2  从高山栎根系分离真菌的菌落及显微形态结构

    Figure 2.  The colonies and microscopic structures of fungi isolated from three speices of alpine Quercus

    表 1  横断山脉亚高山高山栎样地

    Table 1.  Brief information of Quercus sampling plots in Hengduan Mountains

    树种
    Species
    采集地
    Sampling site
    经纬度
    Altitude &Longitude
    海拔
    Elevation
    树高
    Tree
    height
    胸径/地径
    DBH
    坡度
    Slope
    采集日期
    Sampling time
    编号
    NO.
    高山栎
    Quercus semicarpifolia
    西藏林芝察
    隅国道559旁
    97°29′17″E28°50′7″N 2 610 m 28 m 80 cm 33°3°4°4° 2020.10.23 GSL1
    GSL20
    GSL40
    GSL80
    长穗高山栎
    Quercus longispica
    西藏林芝察
    隅国道559旁
    97°11′29″E29°13′31″N 3 440 m 2.0 m 6 cm 12°阳坡 2020.10.22 GSL2
    川滇高山栎
    Quercus aquifolioides
    四川阿坝巴郎
    山国道310旁
    102°50′18″E30°59′35″N 3 480 m 2.1 m 4.5 cm 30°阳坡 2020.10.16 GSL3
    GSL4
    GSL5
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    表 2  从3种高山栎根系中分离获得的各真菌菌株的菌落特征

    Table 2.  Morphology characteristics of fungal colonies isolated from three species of Quercus

    菌株号
    Strain No.
    形态鉴定菌株
    Morphological
    identification strain
    菌落直径(14 d)
    Colony diameters
    形态特征
    Morphological characteristics
    GSL1-1 Mucor nederlandicus 9.0 菌落整体呈白色长毛状,生长迅速。直径为9 cm。表面无分泌物。菌丝无隔或极少分隔,直立,孢子囊球形、顶生,孢囊孢子球形、椭圆形或不规则。
    GSL1-5
    GSL5-G
    Cladosporium cladosporioides 2.4 菌落从中心向外有灰至白过渡。无分泌物且生长缓慢。菌丝无色或棕色,有隔,分生孢子梗直立,分生孢子无色至淡褐色,广椭圆形。
    GSL1-7 Ceratobasidiaceae,spp. 9.0 中央米黄,中圈白灰外圈浅褐至黄色,基底棕色。生长迅速且有分泌物。菌丝庞大,具横隔膜,无色,锁状联合结构,形成担子、担孢子。
    GSL1-8-B Dactylonectria estremocensis 3.4 中圈金黄,外圈白色。生长缓慢无分泌物。菌丝有隔,无色或浅褐色,分生孢子单孢或双孢,无色,圆柱或棍棒状,直或稍弯,厚垣孢子球形或椭圆形,褐色。
    GSL1-B Pestalotiopsistheae 5.9 白色花瓣状分层展开,呈绒毡状,未见分泌物。长速适中,分生孢子两端的细胞无色,中间的三个细胞暗色,顶端有3 ~ 5根的长附属丝。
    GSL1-F Boeremia var.exigua 6.6 整体黑色,外圈黑中圈黄。无分泌物,菌丝有隔,淡色薄壁或暗色厚壁,分生孢子器棕色,分生孢子小,单孢、无色,卵圆形。
    GSL2-2 Phialophora.mustea 2.3 内圈圆心淡褐色,外圈白色,内外圈明显分隔。菌丝黑色,分枝分隔,未见分生孢子。
    GSL2-3
    GSL2-11-D
    Ilyonectria robusta 8.8 圆心黄色,褐色第二圈为白色中圈褐色外圈白色。生长迅速,且无分泌物。菌丝褐色,有隔,分生孢子双孢或多孢,褐色,单生,有时具萌芽孔。
    GSL2-4-2 Penicillium daleae 5.6 菌落内圈圆心白色,向外墨绿色扩张,长速适中。分生孢子梗由菌丝垂直生出无足细胞,分生孢子梗顶部多次帚状分枝,最上层的产孢细胞瓶状(孢瓶体),分生孢子单细胞、近球形无色,串生。
    GSL2-4-A Trichocladium
    opacum
    2.6 菌落中央灰至黑色,隆起,边缘灰,长速慢。菌丝暗色有隔,呈分散状,顶端具簇状棕黑至黑色孢子,卵形。
    GSL2-5 Fusarium redolens 9 菌落整体白色,呈放射状向四周展开,可分层,生长迅速。菌丝透明可见分隔。分生孢子梗似藤蜷曲,分生孢子透明至浅黄,具内含物。
    GSL2-6
    GSL20-4
    Thelonectria veuillotiana 7.4
    7.1
    菌落圆心灰色,外部均呈白色,绒状,边缘不清晰。前期生长快,后生长缓慢。菌丝透明至微黄,两侧具大量簇生分生孢子,椭圆或长椭圆形。
    GSL2-9 Plectania,sp. 6.8 菌落灰色不规则,边缘深褐菌丝棕色,分枝分隔,产孢细胞单瓶颈,透明至棕色,领状结构单个或簇生,相互呈平行或分叉状,分生孢子单细胞,透明至淡
    褐色。
    GSL3-1 Coniochaeta hoffmannii 9.0 菌落中央稀薄,外圈逐渐增厚呈密织态,絮状,乳白色。分生孢子梗粗大,菌丝黄色透明,未见分隔,多呈同向排布,偶见黄色分生孢子盘踞。
    GSL3-E Preussia pilosella 2.0 菌落灰白色相间呈由中圈向外缘扩散,生长缓慢。菌丝浅黄有隔,密集无规则排布,未见分泌物。菌丝单侧偶见深黄卵形分生孢子。
    GSL3-F Pseudogymnoascus roseus 4.9 菌落中心黄灰色,外圈白色向周围延伸,长速适中,具分泌物。菌丝细长呈黄色,未见有隔,且末端分叉。分生孢子中间圆,两头间,少量。
    GSL4-1-A
    GSL4-2
    Ilyonectria Crassa 6.2
    5.2
    菌落内圈白色,外圈淡粉色并伴黄色分泌物,前期长速快,后停止生长。菌丝与分生孢子梗同向排布,分别为棕黄及淡黄色,可见卵形透明分生孢子在其周围分布。
    GSL4-5 Paraboeremia putaminum 3.9 菌落圆心处色灰,向外呈白色,生长较缓,无分泌物。棕色菌丝呈同向集中排列,可见分隔。有棕色、近圆形分生孢子成串排列。
    GSL4-F
    GSL20-B
    Pezicula radicicola 7.6 菌落中央为米黄色,基底黑色向外圈扩张,最外圈为灰色,绒状。长速适中,可见分泌物。菌丝深褐色,半透明,有隔,分生孢子梗末端可见明显膨大,圆形、近圆形分生孢子呈密集状分布。
    GSL3-B
    GSL5-2
    GSL5-C
    Pezicula melanigena 9.0 菌落内圈白点,中圈黑色,外圈白,气生菌丝不发达,平贴于培养基表面,且生长迅速,可见分泌物。菌丝深褐色,尖端较细,未见分隔。可见分生孢子盘及大量簇生的扁长条状分生孢子。
    GSL5-4 Diplodia corticola 3.3 菌落中央为米黄色点状基底褐色外圈黄色边界不晰,生长缓慢,有分泌物。菌丝呈红棕半透明有隔,分生孢子梗直立,具大量簇生近圆形棕红色分生孢子。
    GSL20-3 Thelonectria veuillotiana 7.8
    8.2
    菌落中央向外均为白色,絮状,生长较快。菌丝无色或暗色,有隔,分生孢子初期单孢、无色,后期双孢,深褐色。
    GSL20-A Phoma herbarum 8.2 菌落中央为米白色点状密集分布,基底为灰黑色,外圈灰白,生长较快,有分泌物。菌丝黑色半透明,无明显分隔。分生孢子为簇生,量极多,
    GSL20-F Penicillium janthinellum 5.6 菌落中央呈灰色向外呈扇形外圈白色,绒絮状,长势较快。菌丝浅黄透明,排布无序。分生孢子梗直立,分生孢子圆或近圆,透明,簇生。
    GSL40-3
    GSL80-1
    Fusarium acuminatum 8.8
    5.5
    菌落中央淡黄,中圈粉红,外圈白色,基底为粉红色菌丝无色或粉紫色,有隔,大型孢子镰刀型,多孢,无色,小型孢子卵形、长圆形,单孢,无色
    GSL80-D Trichoderma tomentosum 9.0 菌落白色,从中央向四周扩散,长速快,可布满培养皿。菌丝细,黑色透明,有隔。卵形浅黄色分生孢子紧密聚集于菌丝末端,可见大量分泌物。
    GSL80-H Penicillium griseum 6.1 菌落外圈白色,中央呈红褐色水滴状密集分布,长速快,有分泌物,一段时间后停止增大。菌丝棕,细长,褐色有隔。可见大量圆,近圆形分生孢子。
    GSL80-I Umbelopsis versiformis 5.4 菌落整体为白色,菌落边缘呈灰色,有龟裂纹。菌丝无色至浅褐色,有隔,孢子无色双孢,圆柱形,直或稍弯,
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    表 3  横断山脉高山栎根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果

    Table 3.  Blasting comparison results for rDNA ITS sequences of root endophytic fungi from three species of Quercus in Hengduan Mountains

    菌株号
    Strains No.
    GenBank中相近菌株
    Fungal species
    菌株GenBank登录号
    Accession No.
    相似度
    Identity%
    备注
    Notice
    分离频率
    Isolate Frequency%
    GSL1-1 Mucor nederlandicus EU551186.1 99.29 内生菌 0.96
    GSL1-5
    GSL5-G
    Cladosporium cladosporioides MT635286.1 100.00 叶斑病菌 2.12
    GSL1-7 Ceratobasidiaceae,spp. LC511152.1 96.85 外生菌根菌 1.16
    GSL1-8-B Dactylonectria 
    estremocensis
    NR_121497.1 100.00 内生菌 3.85
    GSL1-B Pestalotiopsistheae MT252050.1 100.00 叶斑病菌 3.85
    GSL1-F Boeremia var.exigua KP746412.1 99.62 内生菌
    DSE真菌
    3.47
    GSL2-2
    GSL2-9
    Phialophora.mustea MT576440.1
    MK102700.1
    99.65
    99.63
    内生菌
    DSE真菌
    6.74
    GSL2-3
    GSL2-11-D
    Ilyonectria robusta MK400321.1 100.00 根腐病菌 5.20
    GSL2-4-2 Penicillium daleae MH862989.1 100.00 内生菌 2.12
    GSL2-4-A Trichocladium
    opacum
    KF850373.1 100.00 内生菌 5.40
    GSL2-5 Fusarium redolens MT563396.1 100.00 根腐病菌 4.24
    GSL2-6
    GSL20-4
    Thelonectria veuillotiana MK656131.1 99.65 内生菌 3.85
    GSL3-1 Plectania,sp. MN341261.1 95.75 内生菌 2.31
    GSL3-E Coniochaeta hoffmannii MH857210.1 97.24 内生菌 1.54
    GSL3-F Preussia pilosella HQ637314.1 98.62 内生菌 0.77
    GSL4-1-A
    GSL4-2
    Pseudogymnoascus roseus MK587683.1 100.00 内生菌 4.05
    GSL4-5 Ilyonectria Crassa MT573482.1 100.00 根腐病菌 5.01
    GSL4-F
    GSL20-B
    Paraboeremia putaminum MH858878.1 100.00 DSE真菌 5.20
    GSL3-B
    GSL5-2
    GSL5-C
    Pezicula radicicola MT131335.1 100.00 内生菌 4.43
    GSL5-4 Pezicula melanigena MT131349.1 100.00 内生菌 3.08
    GSL20-3
    GSL40-2
    Diplodia corticola MH384927.1 99.64 基腐病菌 0.96
    GSL20-4 Thelonectria veuillotiana MK656131.1 99.65 内生菌 5.78
    GSL20-A Phoma herbarum KF313118.1 100.00 DSE真菌 4.82
    GSL20-F Penicillium janthinellum MN450589.1 100.00 内生菌 1.54
    GSL40-3
    GSL80-1
    Fusarium acuminatum MT635295.1
    MT525360.1
    100.00
    100.00
    根腐病菌 5.20
    GSL80-D Trichoderma tomentosum EF488143.1 99.30 生防菌 7.13
    GSL80-H Penicillium griseum MH855063.1 99.83 内生菌 2.12
    GSL80-i Umbelopsis versiformis KR085966.1 100.00 内生菌 2.12
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    表 4  3种高山栎根内生真菌的α多样性指数

    Table 4.  α diversity indices of endophytic fungal species of three alpine species of Quercus

    3种高山栎微生境
    Three microhabitats of Quercus altissima
    Simpson's指数
    Simpson's index
    Margalef's指数
    Margalef's index
    均匀度
    Evenness
    丰度
    Richness
    分离总个数
    Total Numbers
    高山栎 0.950 3.359 0.956 26 174
    长穗高山栎 0.943 3.402 0.928 26 163
    川滇高山栎 0.948 2.797 0.975 22 182
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-04
  • 录用日期:  2022-03-30
  • 网络出版日期:  2022-09-09

横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌的多样性研究

    通讯作者: 马焕成; 
    通讯作者: 陈诗, chenshi@swfu.edu.cn
  • 1. 西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室,云南昆明 650224
  • 2. 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室,西南林业大学 生物多样性保护学院,昆明 650224

摘要:  目的 了解横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌组成及多样性。 方法 以该地区3种高山栎根系为材料,利用根系浸泡染色方法观察根系内真菌共生状况,并对根内真菌进行分离和纯化,结合形态学与分子生物学的方法对其种类进行鉴定。 结果 根系染色可发现大量暗色有隔真菌和AMF丛枝结构,共鉴定出17科20属27种真菌,发现1种外生菌根真菌Ceratobasidiaceae(GSL1-7),4种暗色有隔真菌(DSE)Boeremia exigua var.exigua(GSL1-F)、Phoma herbarum(GSL20-A)、Phialophora.mustea(GSL2-2,GSL2-9)、Paraboeremia putaminum(GSL4-F,GSL20-B),以及2种有促生作用的真菌Pseudogymnoascus roseus(GSL4-1-A,GSL4-2)和Trichoderma.tomentosum(GSL80-D)。α多样性分析发现,3种高山栎根系内生真菌多样性丰富,但差异不显著。4种DSE和3种植物促生真菌在根系中占比可达31.3%。 结论 该类益生真菌对高山栎在横断山脉恶劣环境条件下的适应性生长发挥重要作用。本文研究结果初步为为阐明横断山脉地区高山栎的生态适应性机制提供了理论依据,同时为开发利用促生菌在高山栎育苗中的应用提供了活体菌种资源。

English Abstract

  • 高山栎(Quercus spp.),高山常绿硬叶植物,形态分乔木和灌木型。高山栎作为横断山脉亚高山区域的典型植被和重要生态资源,其垂直分布跨度为900 ~ 4 800 m,多集中于2 400 ~ 3 600 m之间[1],水平分布特征为集中型森林分布和离散型散点分布,遍布整个横断山脉,作为优势种与建群种,构成了横断山脉亚高山地区特有的森林植被生态系统 [2-4]。高山栎表现出对干旱和寒冷环境的高度适应性,对造林困难地段水土保持和生态恢复具有重要作用[5]。高山栎作为薪炭林,具极强的萌蘖更新能力,是理想的能源供应物质[6]

    真菌在土壤等自然环境中分布广泛,许多菌种可侵染植物根系并与其形成互惠共生的菌根。此外,近些年来研究发现暗色有隔真菌(DSE)是植物根系常见的内生菌,部分可与植物根系共生[7],也有一些属于植物病原菌,侵染根系后可对植物生理代谢造成严重破坏[8]。因此,研究植物根系内生真菌的组成与多样性对进一步了解宿主植物生态适应性机制,以及筛选对对植物生长发育有促进作用的内生真菌具有理论意义和实际应用价值。栎属植物根系能够与部分真菌形成外生菌根(ECM),形成后可提高土壤酶活,并为植物宿主提供水分、氮、磷等营养元素,增强宿主植物对干旱等逆境的抵抗力[9,10]。ECM在与宿主植物形成共生关系的过程中,与土壤中各种病原菌竞争生态位,并最终形成定殖。

    我国西部滇、藏地区国家自然资源虽储备丰富,但高原生态环境脆弱,对其如何保护与治理已成为近年来生态文明建设的重要课题。选择高山栎作为研究对象,是因其长期适应高原寒、旱等恶劣生态环境,可以作为高原地区植被恢复的造林备选树种。杨淑娇等[11]发现高山栎林下菌塘同时存在外生菌根(ECMF)和从枝菌根真菌(AMF)。宋富强等[12]对川西亚高山带森林生态系统外生菌根的研究表明该地高山栎0-20cm与20-40cm土壤中外生菌根侵染率与海拔高度呈显著正相关。目前,聚焦于高山栎根系菌根和益生真菌的研究仍较少。本文假设横断山脉亚高山带高山栎根系中内生真菌种类丰富,且存在有利于高山栎植物生存的共生真菌。为验证上述假设,以该地区3种典型高山栎根系为研究对象,通过对其根系内生真菌分离培养,结合形态学和分子生物学手段鉴定真菌,并对其多样性进行分析,以明确该地区高山栎根系内共生真菌的组成和分布区系,为阐明高山栎的生态适应机制提供理论依据,同时为筛选有益根系内生真菌提供活体菌种资源。

    • 横断山脉纵贯我国西南部,纬度从25°N延伸至29°40′N,北起西藏昌都,南至云南边境,总体呈北高南低趋势,是我国西南方地区的现代冰川分布区。该区域在27°40′N以北垂直分带明显,气候变化分明,植被分布随海拔上升出现显著差异[13]。横断山脉亚高山带林木一直以来虽受到较好保护,但其生态环境整体脆弱,高原生态系统不稳定,且时刻面临高山冰川消融等威胁,区域内部分地区水土流失较为严重[14]

    • 本研究于2020年7月、10月分别从横断山脉亚高山地区28°45′3″ ~ 30°59′35″N, 97°40′25″ ~ 102°50′18″E间的不同海拔(2 610 ~ 3 480 m)地区阳坡地段高山栎林下拉设10 × 10 m样方,于样方内高山栎(Q. semicarpifolia Smith)、长穗高山栎(Q. longispica (Hand.-Mazz.) A. Camus)及川滇高山栎(Q. aquifolioides Rehd. et Wils.)根部0 ~ 40 cm土层沿主根采集侧根至根尖,每种树选取3棵(3株长穗高山栎均编号GSL2)(表1)。根系样品分两部分,清理并分别标记,一份用干燥储藏管存于含冰袋的保温箱带回,−4 ℃保存;另一份放入FAA固定液(用时稀释一倍)保存,备后续试验。

      表 1  横断山脉亚高山高山栎样地

      Table 1.  Brief information of Quercus sampling plots in Hengduan Mountains

      树种
      Species
      采集地
      Sampling site
      经纬度
      Altitude &Longitude
      海拔
      Elevation
      树高
      Tree
      height
      胸径/地径
      DBH
      坡度
      Slope
      采集日期
      Sampling time
      编号
      NO.
      高山栎
      Quercus semicarpifolia
      西藏林芝察
      隅国道559旁
      97°29′17″E28°50′7″N 2 610 m 28 m 80 cm 33°3°4°4° 2020.10.23 GSL1
      GSL20
      GSL40
      GSL80
      长穗高山栎
      Quercus longispica
      西藏林芝察
      隅国道559旁
      97°11′29″E29°13′31″N 3 440 m 2.0 m 6 cm 12°阳坡 2020.10.22 GSL2
      川滇高山栎
      Quercus aquifolioides
      四川阿坝巴郎
      山国道310旁
      102°50′18″E30°59′35″N 3 480 m 2.1 m 4.5 cm 30°阳坡 2020.10.16 GSL3
      GSL4
      GSL5
    • 为观察根系内潜在的AMF、DSE或其他真菌等,取去除根尖的次生根系样本,经清水反复冲洗3 ~ 5次后剪成0.5 cm的小段。将组织小段分别放入10% KOH溶液中,90 ℃水浴1.5 h,取出重复涮洗,浸入3%乳酸溶液脱色10 min。再次涮洗,并加入0.05%苯胺蓝溶液,90 ℃水浴2 h,重复涮洗脱色,至根系颜色半透明或透明,取脱色较好的根系制片观察并记录侵染状况[15]

    • 流水冲洗根系样本12 h后,取待用根系裁成0.5 cm小段。分别以70% 酒精和0.1%升汞溶液消毒10 s和1 min,以五点培养法置于PDA和MA平板上,倒置后于25 ℃培养7 ~ 14 d[16]。根系组织块上长出真菌菌落后进行真菌转接培养和纯化,并保存菌株,经PDA和MA平板标准培养后进行形态学与分子学鉴定。

    • 盖玻片灭菌后呈45°斜插入菌落边缘,置于25 ℃恒温培养箱中培养14 d,制片并在LEICA MD750显微镜下观察形态。查阅相关真菌分类书籍与文献[17-18],进行形态学鉴定。

    • 利用改良的DNA快速提取法[19],提取菌体基因组DNA。选用ITS1、ITS4[20]通用引物进行PCR扩增检测真菌DNA。PCR反应体系为50 μL(ddH2O 20 μL,Taq PCR Master Mix 25 μL,ITS1 1.5 μL,ITS4 1.5 μL,DNA 2 μL)。94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s。回收PCR产物经凝胶成像系统(Molecular Imager GEL Doc TM XR)检测。将条带清晰的产物送生物公司(TSINGKE 昆明)进行测序。

    • α多样性是指以一种或几种多样性指数来测度和描述某一均质群落或生境内个体数在物种总数上的分配状况[21]。本研究选取Shannon-Wiener、Simpson多样性指数和Margalef 丰富度指数作为判断所分离菌落的物种多样性指标,以丰富度和均匀度相互补充说明菌种多样性。以上述3种高山栎根系样本作为各真菌种类生存的生境,分离真菌总数作为高山栎根系内可被分离的真菌总载量,各项指数数值越大,意味着该菌种的多样性越丰富。采用EXCEL2003 Biodiv统计CFU(菌落形成单位)分离频率等指标。

      经Chromas2.22和DNAMAN8软件对目标真菌种类的序列进行峰图查验与序列拼接处理后,提交至NCBI利用BLAST多重对比,以相似度为97%为基准确定属种分类关系。

    • 将染、脱色处理的根系制片后在显微镜下观察形态,可见根细胞内菌丝、微菌核以及暗色有隔真菌(DSE)等形态结构,观测到DSE在根系表皮部的侵入位点。菌丝直径6.2 ~ 15.8 μm,微菌核直径19.3 ~ 46.7 μm(图1-1至1-9)。根据菌丝在高山栎根系的侵染点和形态特征,初步判断有2种以上DSE。另外,在高山栎根皮层细胞内观察到大量疑似AM泡囊结构(图1-10、1-12),判断其为高山栎菌根结构。该类结构在3种高山栎根皮层细胞中均可发现,但以长穗高山栎居多,其他两种高山栎较少。

      图  1  3种高山栎根系中的真菌侵染结构

      Figure 1.  Fungal colonization and structures in roots cortex of Quercus spp.

    • 显微观测发现3种高山栎根皮层细胞中均存在DSE和AM等真菌结构。对3种高山栎根系内生真菌分离培养,共获得519株真菌,从高山栎、长穗高山栎、川滇高山栎的根系中分别分离得到174株、163株、182株,经形态鉴定,共27种真菌。从种类数量上看,高山栎根系内生真菌具有明显的形态多样性[21],而且在菌落形态、颜色、生长速度、表面分泌物、菌落质地及产孢(表2)等方面存在较大差异。

      表 2  从3种高山栎根系中分离获得的各真菌菌株的菌落特征

      Table 2.  Morphology characteristics of fungal colonies isolated from three species of Quercus

      菌株号
      Strain No.
      形态鉴定菌株
      Morphological
      identification strain
      菌落直径(14 d)
      Colony diameters
      形态特征
      Morphological characteristics
      GSL1-1 Mucor nederlandicus 9.0 菌落整体呈白色长毛状,生长迅速。直径为9 cm。表面无分泌物。菌丝无隔或极少分隔,直立,孢子囊球形、顶生,孢囊孢子球形、椭圆形或不规则。
      GSL1-5
      GSL5-G
      Cladosporium cladosporioides 2.4 菌落从中心向外有灰至白过渡。无分泌物且生长缓慢。菌丝无色或棕色,有隔,分生孢子梗直立,分生孢子无色至淡褐色,广椭圆形。
      GSL1-7 Ceratobasidiaceae,spp. 9.0 中央米黄,中圈白灰外圈浅褐至黄色,基底棕色。生长迅速且有分泌物。菌丝庞大,具横隔膜,无色,锁状联合结构,形成担子、担孢子。
      GSL1-8-B Dactylonectria estremocensis 3.4 中圈金黄,外圈白色。生长缓慢无分泌物。菌丝有隔,无色或浅褐色,分生孢子单孢或双孢,无色,圆柱或棍棒状,直或稍弯,厚垣孢子球形或椭圆形,褐色。
      GSL1-B Pestalotiopsistheae 5.9 白色花瓣状分层展开,呈绒毡状,未见分泌物。长速适中,分生孢子两端的细胞无色,中间的三个细胞暗色,顶端有3 ~ 5根的长附属丝。
      GSL1-F Boeremia var.exigua 6.6 整体黑色,外圈黑中圈黄。无分泌物,菌丝有隔,淡色薄壁或暗色厚壁,分生孢子器棕色,分生孢子小,单孢、无色,卵圆形。
      GSL2-2 Phialophora.mustea 2.3 内圈圆心淡褐色,外圈白色,内外圈明显分隔。菌丝黑色,分枝分隔,未见分生孢子。
      GSL2-3
      GSL2-11-D
      Ilyonectria robusta 8.8 圆心黄色,褐色第二圈为白色中圈褐色外圈白色。生长迅速,且无分泌物。菌丝褐色,有隔,分生孢子双孢或多孢,褐色,单生,有时具萌芽孔。
      GSL2-4-2 Penicillium daleae 5.6 菌落内圈圆心白色,向外墨绿色扩张,长速适中。分生孢子梗由菌丝垂直生出无足细胞,分生孢子梗顶部多次帚状分枝,最上层的产孢细胞瓶状(孢瓶体),分生孢子单细胞、近球形无色,串生。
      GSL2-4-A Trichocladium
      opacum
      2.6 菌落中央灰至黑色,隆起,边缘灰,长速慢。菌丝暗色有隔,呈分散状,顶端具簇状棕黑至黑色孢子,卵形。
      GSL2-5 Fusarium redolens 9 菌落整体白色,呈放射状向四周展开,可分层,生长迅速。菌丝透明可见分隔。分生孢子梗似藤蜷曲,分生孢子透明至浅黄,具内含物。
      GSL2-6
      GSL20-4
      Thelonectria veuillotiana 7.4
      7.1
      菌落圆心灰色,外部均呈白色,绒状,边缘不清晰。前期生长快,后生长缓慢。菌丝透明至微黄,两侧具大量簇生分生孢子,椭圆或长椭圆形。
      GSL2-9 Plectania,sp. 6.8 菌落灰色不规则,边缘深褐菌丝棕色,分枝分隔,产孢细胞单瓶颈,透明至棕色,领状结构单个或簇生,相互呈平行或分叉状,分生孢子单细胞,透明至淡
      褐色。
      GSL3-1 Coniochaeta hoffmannii 9.0 菌落中央稀薄,外圈逐渐增厚呈密织态,絮状,乳白色。分生孢子梗粗大,菌丝黄色透明,未见分隔,多呈同向排布,偶见黄色分生孢子盘踞。
      GSL3-E Preussia pilosella 2.0 菌落灰白色相间呈由中圈向外缘扩散,生长缓慢。菌丝浅黄有隔,密集无规则排布,未见分泌物。菌丝单侧偶见深黄卵形分生孢子。
      GSL3-F Pseudogymnoascus roseus 4.9 菌落中心黄灰色,外圈白色向周围延伸,长速适中,具分泌物。菌丝细长呈黄色,未见有隔,且末端分叉。分生孢子中间圆,两头间,少量。
      GSL4-1-A
      GSL4-2
      Ilyonectria Crassa 6.2
      5.2
      菌落内圈白色,外圈淡粉色并伴黄色分泌物,前期长速快,后停止生长。菌丝与分生孢子梗同向排布,分别为棕黄及淡黄色,可见卵形透明分生孢子在其周围分布。
      GSL4-5 Paraboeremia putaminum 3.9 菌落圆心处色灰,向外呈白色,生长较缓,无分泌物。棕色菌丝呈同向集中排列,可见分隔。有棕色、近圆形分生孢子成串排列。
      GSL4-F
      GSL20-B
      Pezicula radicicola 7.6 菌落中央为米黄色,基底黑色向外圈扩张,最外圈为灰色,绒状。长速适中,可见分泌物。菌丝深褐色,半透明,有隔,分生孢子梗末端可见明显膨大,圆形、近圆形分生孢子呈密集状分布。
      GSL3-B
      GSL5-2
      GSL5-C
      Pezicula melanigena 9.0 菌落内圈白点,中圈黑色,外圈白,气生菌丝不发达,平贴于培养基表面,且生长迅速,可见分泌物。菌丝深褐色,尖端较细,未见分隔。可见分生孢子盘及大量簇生的扁长条状分生孢子。
      GSL5-4 Diplodia corticola 3.3 菌落中央为米黄色点状基底褐色外圈黄色边界不晰,生长缓慢,有分泌物。菌丝呈红棕半透明有隔,分生孢子梗直立,具大量簇生近圆形棕红色分生孢子。
      GSL20-3 Thelonectria veuillotiana 7.8
      8.2
      菌落中央向外均为白色,絮状,生长较快。菌丝无色或暗色,有隔,分生孢子初期单孢、无色,后期双孢,深褐色。
      GSL20-A Phoma herbarum 8.2 菌落中央为米白色点状密集分布,基底为灰黑色,外圈灰白,生长较快,有分泌物。菌丝黑色半透明,无明显分隔。分生孢子为簇生,量极多,
      GSL20-F Penicillium janthinellum 5.6 菌落中央呈灰色向外呈扇形外圈白色,绒絮状,长势较快。菌丝浅黄透明,排布无序。分生孢子梗直立,分生孢子圆或近圆,透明,簇生。
      GSL40-3
      GSL80-1
      Fusarium acuminatum 8.8
      5.5
      菌落中央淡黄,中圈粉红,外圈白色,基底为粉红色菌丝无色或粉紫色,有隔,大型孢子镰刀型,多孢,无色,小型孢子卵形、长圆形,单孢,无色
      GSL80-D Trichoderma tomentosum 9.0 菌落白色,从中央向四周扩散,长速快,可布满培养皿。菌丝细,黑色透明,有隔。卵形浅黄色分生孢子紧密聚集于菌丝末端,可见大量分泌物。
      GSL80-H Penicillium griseum 6.1 菌落外圈白色,中央呈红褐色水滴状密集分布,长速快,有分泌物,一段时间后停止增大。菌丝棕,细长,褐色有隔。可见大量圆,近圆形分生孢子。
      GSL80-I Umbelopsis versiformis 5.4 菌落整体为白色,菌落边缘呈灰色,有龟裂纹。菌丝无色至浅褐色,有隔,孢子无色双孢,圆柱形,直或稍弯,

      图  2  从高山栎根系分离真菌的菌落及显微形态结构

      Figure 2.  The colonies and microscopic structures of fungi isolated from three speices of alpine Quercus

    • 对各内生真菌菌株的ITS区段序列扩增获得长度500 bp左右的序列。在NCBI的 GenBank中比对分析表明,除GSL1-7(96.96%)和GSL3-1(95.75%)可鉴定至科和属,其余菌株与GenBank中的同源菌株相似度均高于97%[22-23],可鉴定至种水平。通过对获得的各菌株ITS rRNA gene序列比对分析,共鉴定出17科20属27种真菌。文献记载表明包括4种DSE,2种有益菌或生防菌, 以及部分病原菌(表3)。

      表 3  横断山脉高山栎根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果

      Table 3.  Blasting comparison results for rDNA ITS sequences of root endophytic fungi from three species of Quercus in Hengduan Mountains

      菌株号
      Strains No.
      GenBank中相近菌株
      Fungal species
      菌株GenBank登录号
      Accession No.
      相似度
      Identity%
      备注
      Notice
      分离频率
      Isolate Frequency%
      GSL1-1 Mucor nederlandicus EU551186.1 99.29 内生菌 0.96
      GSL1-5
      GSL5-G
      Cladosporium cladosporioides MT635286.1 100.00 叶斑病菌 2.12
      GSL1-7 Ceratobasidiaceae,spp. LC511152.1 96.85 外生菌根菌 1.16
      GSL1-8-B Dactylonectria 
      estremocensis
      NR_121497.1 100.00 内生菌 3.85
      GSL1-B Pestalotiopsistheae MT252050.1 100.00 叶斑病菌 3.85
      GSL1-F Boeremia var.exigua KP746412.1 99.62 内生菌
      DSE真菌
      3.47
      GSL2-2
      GSL2-9
      Phialophora.mustea MT576440.1
      MK102700.1
      99.65
      99.63
      内生菌
      DSE真菌
      6.74
      GSL2-3
      GSL2-11-D
      Ilyonectria robusta MK400321.1 100.00 根腐病菌 5.20
      GSL2-4-2 Penicillium daleae MH862989.1 100.00 内生菌 2.12
      GSL2-4-A Trichocladium
      opacum
      KF850373.1 100.00 内生菌 5.40
      GSL2-5 Fusarium redolens MT563396.1 100.00 根腐病菌 4.24
      GSL2-6
      GSL20-4
      Thelonectria veuillotiana MK656131.1 99.65 内生菌 3.85
      GSL3-1 Plectania,sp. MN341261.1 95.75 内生菌 2.31
      GSL3-E Coniochaeta hoffmannii MH857210.1 97.24 内生菌 1.54
      GSL3-F Preussia pilosella HQ637314.1 98.62 内生菌 0.77
      GSL4-1-A
      GSL4-2
      Pseudogymnoascus roseus MK587683.1 100.00 内生菌 4.05
      GSL4-5 Ilyonectria Crassa MT573482.1 100.00 根腐病菌 5.01
      GSL4-F
      GSL20-B
      Paraboeremia putaminum MH858878.1 100.00 DSE真菌 5.20
      GSL3-B
      GSL5-2
      GSL5-C
      Pezicula radicicola MT131335.1 100.00 内生菌 4.43
      GSL5-4 Pezicula melanigena MT131349.1 100.00 内生菌 3.08
      GSL20-3
      GSL40-2
      Diplodia corticola MH384927.1 99.64 基腐病菌 0.96
      GSL20-4 Thelonectria veuillotiana MK656131.1 99.65 内生菌 5.78
      GSL20-A Phoma herbarum KF313118.1 100.00 DSE真菌 4.82
      GSL20-F Penicillium janthinellum MN450589.1 100.00 内生菌 1.54
      GSL40-3
      GSL80-1
      Fusarium acuminatum MT635295.1
      MT525360.1
      100.00
      100.00
      根腐病菌 5.20
      GSL80-D Trichoderma tomentosum EF488143.1 99.30 生防菌 7.13
      GSL80-H Penicillium griseum MH855063.1 99.83 内生菌 2.12
      GSL80-i Umbelopsis versiformis KR085966.1 100.00 内生菌 2.12
    • 通过对3种高山栎根系内生真菌物种多样性和丰度分析发现,其多样性丰度表现为高山栎>长穗高山栎>川滇高山栎。从真菌种类来看,Trichoderma tomentosum(绿色木霉)的分离频率最高(7.13%),在3种高山栎根系中均可分离到,其次为Fusarium acuminatum、Phoma herbarum (DSE) 和Trichocladium opacum。另3种DSE如Boeremia exigua var exigua、Phialophora.mustea、Paraboeremia putaminum分离频率分别为3.47%、6.74%和5.20%;Pseudogymnoascus roseus 的分离频率为4.05%,有文献报道该菌对植物生长有促进作用[25,26]Mucor nederlandicus分离频率最低(0.96%),仅分离自高山栎根系。经对3种高山栎根系内生真菌多样性指数分析,发现Shannon指数明显大于1,Simpson指数均接近于1,说明3种高山栎根系内生真菌物种多样性较丰富,但3种高山栎间根内真菌多样性无显著差异。

      表 4  3种高山栎根内生真菌的α多样性指数

      Table 4.  α diversity indices of endophytic fungal species of three alpine species of Quercus

      3种高山栎微生境
      Three microhabitats of Quercus altissima
      Simpson's指数
      Simpson's index
      Margalef's指数
      Margalef's index
      均匀度
      Evenness
      丰度
      Richness
      分离总个数
      Total Numbers
      高山栎 0.950 3.359 0.956 26 174
      长穗高山栎 0.943 3.402 0.928 26 163
      川滇高山栎 0.948 2.797 0.975 22 182
    • 对横断山脉亚高山带3种高山栎根系内生真菌分离培养共获得519株真菌,鉴定出真菌17科20属27种。根系染色结果表明,3种高山栎根皮层内均存在内生真菌,可见包括菌丝、微菌核及疑似AMF的泡囊结构。3种高山栎根内真菌α多样性分析发现内生真菌物种多样性较丰富,其中包含较多有益真菌或生防菌。

      本研究分离鉴定出的27种真菌中,Ceratobasidiaceae科真菌(GSL1-7)为外生菌根菌[24],其与NCBI中已知菌株序列相似度低于97%,说明该菌种为尚未被描述。Boeremia exigua var. exiguaPhoma herbarumPhialophora musteaParaboeremia putaminum为DSE。Pseudogymnoascus roseusTrichocladium opacum、Thelonectria veuillotianaMucor nederlandicus 曾在采自川、滇、藏等地的虫草菌核中分离得到,其中P. roseus能够促进植物生长并抑制病害[25,26]。绿色木霉Trichoderma tomentosum为土壤习居菌可用于植物病害生物防治[16,26]

      Plectania rhytidiaIlyonectria crassa曾在2种西藏药用植物根系中分离得到[27],此次从高山栎根系分离获得说明2者在横断山区分布广泛,但其对宿主植物的作用尚不明确。Kehr (1991)[28]报道Pezicula cinnamomea 可侵染美国红栎而造成严重损失。Kwaśna等[29]研究从洪水浸泡后的罗布栎(Quercus robur)分离出Pezicula radicicola,故推测这两种真菌对高山栎具有潜在致病性此外,Cladosporium cladosporioides、 Dactylonectria estremocensisD. torresensisPestalotiopsis kenyanaFusarium acuminatumF. redolensThelonectria veuillotianaIlyonectria robusta等为潜在的病原菌[30,31]。近年来,不断有研究报道DSE是植物根的常见内生菌 [29],且在促进植物生长、改善植物矿质营养、调节植物内源激素平衡、增强植物耐重金属离子和抗环境污染等方面意义重大[32,33]。DSE普遍存在于高山栎根系内,一定具有某种生理和生态功能,以提升高山栎的抗逆适应能力。

      高山栎是横断山脉亚高山的优势树种,具有重要的生态价值。但本研究中乔木和灌木型高山栎根系木质化程度均较高,不利于菌种回接。由于本研究取样范围和数量有限,只获得了初步研究结果,因此,对该地区不同海拔分布的高山栎根系内生真菌种类和功能仍有待进一步深入研究。

    • 本研究通过组织显微观察,发现横断山脉亚高山3种高山栎的根皮层细胞内有菌丝、微菌核、泡囊等结构,反映出其根系普遍存在DSE等内生真菌。从横断山脉亚高山3种高山栎根系中分离鉴定出3门17科20属27种内生真菌,表明横断山脉亚高山3种高山栎根内真菌物种多样性丰富,存在菌根菌、DSE和木霉等内生真菌及部分潜在的病原菌。初步研究发现3种高山栎根系内生真菌的多样性丰度差异不显著。

参考文献 (33)

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